Name: Author Spotlight: בידוד יעיל של וירוסים הקשורים באדנו ליישומים פרה-קליניים
Uploaded: 2024-02-09T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Author Spotlight: Efficient Adeno-Associated Virus Isolation for Pre-Clinical Applications at JoVE.com

הרכב התמיסות והמאגרים המשמשים בפרוטוקול זה מובא בטבלה 1.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>תמיסה</td>
			<td colspan="2">הרכב</td>
		</tr><tr><td rowspan="4">חיץ ליזיס AAV</td>
			<td colspan="2">1.2 מ"ל של תמיסת NaCl 5 M</td>
		</tr><tr><td colspan="2">2 מ"ל של 1 M Tris-HCl pH 8.5 פתרון</td>
		</tr><tr><td colspan="2">80 uL של...

בידוד AAV על ידי צנטריפוגה הדרגתית צפיפות יודיקסנול כפולה

<ol>
	<li>Strauss, K. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Onasemnogene+abeparvovec+for+presymptomatic+infants+with+three+copies+of+SMN2+at+risk+for+spinal+muscular+atrophy:+the+Phase+III+SPR1NT+trial.">Onasemnogene abeparvovec for presymptomatic infants with three copies of SMN2 at risk for spinal muscular atrophy: the Phase III SPR1NT trial.</a> Nat Med. 28 (7), 1390-1397 (2022).</li><li>Fuller-Carter, P. I., Basiri, H., Harvey, A. R., Carvalho, L. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Focused+update+on+AAV-based+gene+therapy+clinical+trials+for+inherited+retinal+degeneration.">Focused update on AAV-based gene therapy clinical trials for inherited retinal degeneration.</a> BioDrugs. 34 (6), 763-781 (2020).</li><li>George, L. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiyear+factor+VIII+expression+after+AAV+gene+transfer+for+hemophilia+A.">Multiyear factor VIII expression after AAV gene transfer for hemophilia A.</a> N Engl J Med. 385 (21), 1961-1973 (2021).</li><li>Naso, M. F., Tomkowicz, B., Perry, W. L., Strohl, W. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adeno-Associated+Virus+(AAV)+as+a+vector+for+gene+therapy.">Adeno-Associated Virus (AAV) as a vector for gene therapy.</a> Biodrugs. 31 (4), 317-334 (2017).</li><li>Atchison, R. W., Casto, B. C., Hammon, W. M. c. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adenovirus-associated+defective+virus+particles.">Adenovirus-associated defective virus particles.</a> Science. 149 (3685), 754-756 (1965).</li><li>Wu, Z., Yang, H., Colosi, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+genome+size+on+AAV+vector+packaging.">Effect of genome size on AAV vector packaging.</a> Mol Ther. 18 (1), 80-86 (2010).</li><li>Samulski, R. J., Muzyczka, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=AAV-mediated+gene+therapy+for+research+and+therapeutic+purposes.">AAV-mediated gene therapy for research and therapeutic purposes.</a> Annu Rev Virol. 1 (1), 427-451 (2014).</li><li>Zolotukhin, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+of+recombinant+adeno-associated+virus+vectors.">Production of recombinant adeno-associated virus vectors.</a> Hum Gene Ther. 16 (5), 551-557 (2005).</li><li>Penaud-Budloo, M., Fran&#231;ois, A., Cl&#233;ment, N., Ayuso, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pharmacology+of+recombinant+adeno-associated+virus+production.">Pharmacology of recombinant adeno-associated virus production.</a> Mol Ther - Methods Clin Dev. 8, 166-180 (2018).</li><li>Costa-Verdera, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Understanding+and+Tackling+immune+responses+to+adeno-associated+viral+vectors.">Understanding and Tackling immune responses to adeno-associated viral vectors.</a> Hum Gene Ther. 34 (17-18), 836-852 (2023).</li><li>Ertl, H. C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitigating+serious+adverse+events+in+gene+therapy+with+AAV+Vectors:+Vector+dose+and+immunosuppression.">Mitigating serious adverse events in gene therapy with AAV Vectors: Vector dose and immunosuppression.</a> Drugs. 83 (4), 287-298 (2023).</li><li>Pupo, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=AAV+vectors:+The+Rubik's+cube+of+human+gene+therapy.">AAV vectors: The Rubik's cube of human gene therapy.</a> Mol Ther. 30 (12), 3515-3541 (2022).</li><li>Marsic, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vector+design+tour+de+force:+Integrating+combinatorial+and+rational+approaches+to+derive+novel+adeno-associated+virus+variants.">Vector design tour de force: Integrating combinatorial and rational approaches to derive novel adeno-associated virus variants.</a> Mol Ther. 22 (11), 1900-1909 (2014).</li><li>Grimm, D., Zolotukhin, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=E+Pluribus+Unum:+50+Years+of+research,+millions+of+viruses,+and+one+goal-tailored+acceleration+of+AAV+evolution.">E Pluribus Unum: 50 Years of research, millions of viruses, and one goal-tailored acceleration of AAV evolution.</a> Mol Ther. 23 (12), 1819-1831 (2015).</li><li>Biswas, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineering+and+in+vitro+selection+of+a+novel+AAV3B+variant+with+high+hepatocyte+tropism+and+reduced+seroreactivity.">Engineering and in vitro selection of a novel AAV3B variant with high hepatocyte tropism and reduced seroreactivity.</a> Mol Ther - Methods Clin Dev. 19, 347-361 (2020).</li><li>Perabo, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+selection+of+viral+vectors+with+modified+tropism:+the+adeno-associated+virus+display.">In vitro selection of viral vectors with modified tropism: the adeno-associated virus display.</a> Mol Ther. 8 (1), 151-157 (2003).</li><li>Crosson, S. M., Dib, P., Smith, J. K., Zolotukhin, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Helper-free+production+of+laboratory+grade+AAV+and+purification+by+iodixanol+density+gradient+centrifugation.">Helper-free production of laboratory grade AAV and purification by iodixanol density gradient centrifugation.</a> Mol Ther - Methods Clin Dev. 10, 1-7 (2018).</li><li>Chan, C., Harris, K. K., Zolotukhin, S., Keeler, G. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rational+design+of+AAV-rh74,+AAV3B,+and+AAV8+with+limited+liver+targeting.">Rational design of AAV-rh74, AAV3B, and AAV8 with limited liver targeting.</a> Viruses. 15 (11), 2168 (2023).</li><li>Schmidt, O. W., Cooney, M. K., Foy, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adeno-associated+virus+in+adenovirus+type+3+conjunctivitis.">Adeno-associated virus in adenovirus type 3 conjunctivitis.</a> Infect Immun. 11 (6), 1362-1370 (1975).</li><li>Grimm, D., Kern, A., Rittner, K., Kleinschmidt, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+tools+for+production+and+purification+of+recombinant+adenoassociated+virus+vectors.">Novel tools for production and purification of recombinant adenoassociated virus vectors.</a> Hum Gene Ther. 9 (18), 2745-2760 (1998).</li><li>Zolotukhin, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recombinant+adeno-associated+virus+purification+using+novel+methods+improves+infectious+titer+and+yield.">Recombinant adeno-associated virus purification using novel methods improves infectious titer and yield.</a> Gene Ther. 6 (6), 973-985 (1999).</li><li>Clark, K. R., Liu, X., Mcgrath, J. P., Johnson, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highly+purified+recombinant+adeno-associated+virus+vectors+are+biologically+active+and+free+of+detectable+helper+and+wild-type+viruses.">Highly purified recombinant adeno-associated virus vectors are biologically active and free of detectable helper and wild-type viruses.</a> Hum Gene Ther. 10 (6), 1031-1039 (1999).</li><li>Debelak, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cation-exchange+high-performance+liquid+chromatography+of+recombinant+adeno-associated+virus+type+2.">Cation-exchange high-performance liquid chromatography of recombinant adeno-associated virus type 2.</a> J Chromatogr B Biomed Sci App. 740 (2), 195-202 (2000).</li><li>Burova, E., Ioffe, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chromatographic+purification+of+recombinant+adenoviral+and+adeno-associated+viral+vectors:+methods+and+implications.">Chromatographic purification of recombinant adenoviral and adeno-associated viral vectors: methods and implications.</a> Gene Ther. 12 (1), S5-S17 (2005).</li><li>Adams, B., Bak, H., Tustian, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Moving+from+the+bench+towards+a+large+scale,+industrial+platform+process+for+adeno-associated+viral+vector+purification.">Moving from the bench towards a large scale, industrial platform process for adeno-associated viral vector purification.</a> Biotechnol Bioeng. 117 (10), 3199-3211 (2020).</li><li>Grieger, J. C., Choi, V. W., Samulski, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+and+characterization+of+adeno-associated+viral+vectors.">Production and characterization of adeno-associated viral vectors.</a> Nat Protoc. 1 (3), 1412-1428 (2006).</li><li>Florea, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-efficiency+purification+of+divergent+AAV+serotypes+using+AAVX+affinity+chromatography.">High-efficiency purification of divergent AAV serotypes using AAVX affinity chromatography.</a> Mol Ther Methods Clin Dev. 28, 146-159 (2022).</li><li>Chamberlain, K., Riyad, J. M., Weber, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expressing+transgenes+that+exceed+the+packaging+capacity+of+adeno-associated+virus+capsids.">Expressing transgenes that exceed the packaging capacity of adeno-associated virus capsids.</a> Hum Gene Ther Methods. 27 (1), 1-12 (2016).</li><li>Green, E. A., Hamaker, N. K., Lee, K. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+vector+elements+and+process+conditions+in+transient+and+stable+suspension+HEK293+platforms+using+SARS-CoV-2+receptor+binding+domain+as+a+model+protein.">Comparison of vector elements and process conditions in transient and stable suspension HEK293 platforms using SARS-CoV-2 receptor binding domain as a model protein.</a> BMC Biotechnol. 23 (1), 7 (2023).</li><li>Erbacher, P., Zou, S., Bettinger, T., Steffan, A. M., Remy, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chitosan-based+vector/DNA+complexes+for+gene+delivery:+Biophysical+characteristics+and+transfection+ability.">Chitosan-based vector/DNA complexes for gene delivery: Biophysical characteristics and transfection ability.</a> Pharm Res. 15 (9), 1332-1339 (1998).</li><li>Vandenberghe, L. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+serotype-dependent+release+of+functional+vector+into+the+culture+medium+during+adeno-associated+virus+manufacturing.">Efficient serotype-dependent release of functional vector into the culture medium during adeno-associated virus manufacturing.</a> Hum Gene Ther. 21 (10), 1251-1257 (2010).</li><li>Summerford, C., Samulski, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Membrane-associated+heparan+sulfate+proteoglycan+is+a+receptor+for+adeno-associated+virus+type+2+virions.">Membrane-associated heparan sulfate proteoglycan is a receptor for adeno-associated virus type 2 virions.</a> J Virol. 72 (2), 1438-1445 (1998).</li><li>Wright, J. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+factors+that+contribute+to+recombinant+AAV2+particle+aggregation+and+methods+to+prevent+its+occurrence+during+vector+purification+and+formulation.">Identification of factors that contribute to recombinant AAV2 particle aggregation and methods to prevent its occurrence during vector purification and formulation.</a> Mol Ther. 12 (1), 171-178 (2005).</li><li>Gruntman, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stability+and+compatibility+of+recombinant+adeno-associated+virus+under+conditions+commonly+encountered+in+human+gene+therapy+trials.">Stability and compatibility of recombinant adeno-associated virus under conditions commonly encountered in human gene therapy trials.</a> Hum Gene Ther Methods. 26 (2), 71-76 (2015).</li><li>Srivastava, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rationale+and+strategies+for+the+development+of+safe+and+effective+optimized+AAV+vectors+for+human+gene+therapy.">Rationale and strategies for the development of safe and effective optimized AAV vectors for human gene therapy.</a> Mol Ther Nucleic Acids. 32, 949-959 (2023).</li><li>Mullard, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FDA+approves+first+gene+therapy+for+Duchenne+muscular+dystrophy,+despite+internal+objections.">FDA approves first gene therapy for Duchenne muscular dystrophy, despite internal objections.</a> Nat Rev Drug Discov. 22 (8), 610-610 (2023).</li><li>Center for Biologics Evaluation and Research. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Approved+Cellular+and+Gene+Therapy+Products.">Approved Cellular and Gene Therapy Products.</a> US Food Drug Adm. , (2023).</li><li>Kang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=AAV+vectors+applied+to+the+treatment+of+CNS+disorders:+Clinical+status+and+challenges.">AAV vectors applied to the treatment of CNS disorders: Clinical status and challenges.</a> J Control Release Off J Control Release Soc. 355, 458-473 (2023).</li><li>De Wolf, D., Singh, K., Chuah, M. K., VandenDriessche, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hemophilia+gene+therapy:+The+end+of+the+beginning.">Hemophilia gene therapy: The end of the beginning.</a> Hum Gene Ther. 34 (17-18), 782-792 (2023).</li><li>Simons, E. J., Trapani, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+opportunities+and+challenges+of+gene+therapy+for+treatment+of+inherited+forms+of+vision+and+hearing+loss.">The opportunities and challenges of gene therapy for treatment of inherited forms of vision and hearing loss.</a> Hum Gene Ther. 34 (17-18), 808-820 (2023).</li></ol>

פרוטוקול טיהור שיפוע צפיפות יודיקסנול כפול הוא השיטה האוניברסלית מכיוון שהוא ישים לכל וריאנטים מוטנטיים AAV, ללא קשר לספציפיות הקולטן שלהם. שיטות מוקדמות לטיהור AAV הסתמכו על צפיפות חלקיקים וכללו צנטריפוגה איזופיקנית ב-CsCl וצנטריפוגה הדרגתית רציפה של צפיפות סוכרוז19. מאוחר יותר...

וקטורים נגיפיים רקומביננטיים הקשורים באדנו (rAAV) הם כלים בשימוש נרחב לטיפול במחלות גנטיות, כולל ניוון שרירים בעמוד השדרה, ניוון רשתית והמופיליה A 1,2,3. וקטורי rAAV מהונדסים כך שיחסרו גנים נגיפיים הנמצאים ב-AAV4 מסוג פראי, נגיף איקוסהדרלי קטן שאינו מעטפה עם גנום DNA ליניארי חד-גדילי של 4.7 קילו-בתים. AAV התגלה לראשונה בשנות ה-60 של המאה ה-20 כמזהם של תכשירי אדנו-וירוס5. למרות גודל הקפסיד הקטן שלו, המגביל את גודל הטרנסגן שניתן לארוז למקסימום של 4.9 קילו-בתים למעט ITRs6, AAV שימושי להעברת טרנסגנים מכיוון שהוא אינו פתוגני בבני אדם, מאפשר ביטוי של טרנסגן בסוגי תאים מתחלקים ולא מתחלקים רבים, ויש לו השפעות אימונוגניות מוגבלות7.
כחברים בסוג dependoparvovirus, הייצור של rAAVs מסתמך על ביטוי של גנים מסייעים נוכח אדנווירוס או וירוס הרפס סימפלקס8. פותחו מספר אסטרטגיות לייצור rAAV, אך ייצור בתאי HEK293 שעברו טרנספורמציה באמצעות הגנים המסייעים E1A/E1B אדנו-ויראליים הוא השיטה המבוססת ביותר המשמשת כיום9. הגישה הכללית של ייצור rAAV מתחילה עם טרנספקציה של תאי HEK293 עם שלושה פלסמידים המכילים את הטרנסגן בתוך חזרות מסוף הפוך (ITR), AAV rep ו cap גנים, וגנים מסייעים אדנו-ויראליים נוספים, בהתאמה. שבעים ושתיים שעות לאחר הטרנספקציה, תאים נקצרים ומעובדים כדי לטהר rAAV המכיל את הטרנסגן.
בפיתוח וקטורי rAAV חדשים למטרות טיפוליות, מטרה עיקרית היא לייצר וקטורים בעלי יעילות התמרה מוגברת. עלייה ביעילות ההתמרה של תאי המטרה פירושה ירידה במינון הקליני הדרוש של rAAV, ובכך להקטין את הסבירות להשפעות אימונוגניות שליליות החל מנטרול בתיווך נוגדנים ועד רעילות חריפה10,11. כדי לשפר את יעילות הטרנסדוקציה של וקטורי rAAV, ניתן לבצע שינויים בגנום הארוז או בקפסיד. שיטות מעשיות לכוונון יעילות הטרנסדוקציה באמצעות תכנון גנום ארוז כוללות שילוב של מקדמים חזקים וספציפיים לרקמות, בחירה מתחשבת של רכיבי עיבוד mRNA, ואופטימיזציה של רצף קידוד לשיפור יעילות התרגום12. שינויים בקפסיד נעשים במטרה להגדיל את הטרופיזם עבור סוגי תאים אנושיים מטרה. מאמצים לפיתוח קפסידים וקטוריים חדשים של העברת טרנסגנים rAAV מאופיינים בדרך כלל בהתמקדות בתכנון רציונלי של קפסידים AAV עם מוטציות ספציפיות המכוונות לקולטני תאים ספציפיים או באבולוציה מכוונת לזיהוי קפסידים עם טרופיזם עבור סוגי תאים ספציפיים מספריות קפסיד קומבינטוריות בעלות מורכבות גבוהה מבלי להתמקד בקולטן ספציפי אחד (אם כי קבוצות מסוימות משלבות גישות אלה)13, 14,15. בגישת האבולוציה המכוונת, ספריות קפסיד קומבינטוריות נבנות באמצעות עמוד שדרה סרוטיפי מסוים עם אזורים משתנים מוטנטים בצד החיצוני של הקפסיד16. ספריות קפסיד קומבינטוריות בנויות לעתים קרובות מסרוטיפים AAV שאינם מקורם בבני אדם, מה שמקטין את הסיכון לחסינות קיימת במהלך השימוש הקליני10. לכן, שיטות טיהור שניתן ליישם על כל סרוטיפ הן אידיאליות כדי לבטל את הצורך אופטימיזציה ספציפית לסרוטיפ עבור הסרוטיפים הפחות נפוצים המשמשים עמוד שדרה עבור ספריות אלה.
צנטריפוגת צפיפות יודיקסנול משמשת לטיהור טיטרים גבוהים של rAAV עם זיהומיות גבוהה17. בפרוטוקול זה, rAAV מיוצר בתרבית תאי תרחיף כדי להפחית את כמות העבודה הדרושה לייצור טיטרים גדולים של AAV. שלב צנטריפוגה נכלל גם כדי לנקות את התא lysate כדי להפחית את נוכחותם של חלבונים מזהמים ולהפחית את הסיכון של משקעים וירוס. פרוטוקול זה הוא שיטה חסכונית לייצור תכשירים של rAAV ברמת טוהר גבוהה המתאימים לשימוש פרה-קליני.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>5810 R benchtop centrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>22625501</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>8-channel peristaltic pump&#160;</td>
			<td>Watson-Marlow</td>
			<td>020.3708.00A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Automated cell counter&#160;</td>
			<td>NanoEntek</td>
			<td>EVE-MC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Avanti J-E high-speed centrifuge</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>369001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Benzonase</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>88701</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biological safety cabinet</td>
			<td>Labconco</td>
			<td>322491101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CO2 incubator with shaker&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Set at 8% CO2 and 37 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Conical centrifuge tubes</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>339652</td>
			<td>50 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Conical centrifuge tubes</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>339650</td>
			<td>15 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable micro-pipets</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>21-164-2G</td>
			<td>Capillaries</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s phosphate buffered saline without CaCl2 and MgCl2&#160; (DPBS) (10x)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D1408</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ECLIPSE Ts2R-FL inverted microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Expi293 Expression Medium</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>A1435101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Expi293F cells</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>A14527</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter tips</td>
			<td>USA Scientific</td>
			<td>1126-7810</td>
			<td>1000 &#181;L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter tips</td>
			<td>USA Scientific</td>
			<td>1120-8810</td>
			<td>200 &#181;L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter tips</td>
			<td>USA Scientific</td>
			<td>1120-1810</td>
			<td>20 &#181;L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter tips</td>
			<td>USA Scientific</td>
			<td>1121-3810</td>
			<td>10 &#181;L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hypodermic needles</td>
			<td>Tyco Healthcare</td>
			<td>820112</td>
			<td>20 GA x 1-1/2 A</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ice bucket with lid</td>
			<td>VWR</td>
			<td>10146-184</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>JS-5.3 rotor</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>368690</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium chloride solution (1 M)</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>M1028-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Metal stand and clamp&#160;</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>05-769-6Q</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge tubes</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>22600028</td>
			<td>1.5 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Needle nose pliers</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optima XE-90 ultracentrifuge</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>A94471</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Opti-MEM I Reduced-Serum Medium</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>31985062</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OptiPrep density gradient media (iodixanol)</td>
			<td>Serumwerk</td>
			<td>AXS-1114542</td>
			<td>60% iodixanol solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>P1000 Pipet</td>
			<td>Gilson</td>
			<td>F144059M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>P2 Pipet</td>
			<td>Gilson</td>
			<td>F144054M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>P20 Pipet</td>
			<td>Gilson</td>
			<td>F144056M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>P200 Pipet</td>
			<td>Gilson</td>
			<td>F144058M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phenol red&#160;solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P0290</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffered saline (PBS)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P4474</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipet-Aid XP pipette controller</td>
			<td>Drummond Scientific</td>
			<td>4-000-101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasmid pCapsid</td>
			<td>De novo or Addgene, etc.&#160;</td>
			<td>N/A</td>
			<td>We used pACGrh74.&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasmid pHelper</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>112867</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasmid pTransgene</td>
			<td>De novo or Addgene, etc.&#160;</td>
			<td>N/A</td>
			<td>We used pdsAAV-GFP.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pluronic F-68 polyol solution (10%)</td>
			<td>Mp Biomedicals</td>
			<td>92750049</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyethylene glycol 8000</td>
			<td>Research Products International</td>
			<td>P48080-500.0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyethylenimine HCl Max (PEI-Max)</td>
			<td>Polysciences</td>
			<td>NC1038561</td>
			<td>Dilute in water to 40 &#956;M</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polypropylene centrifuge tubes, sterile</td>
			<td>Corning</td>
			<td>431123</td>
			<td>500 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polypropylene centrifuge tubes, sterile</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430776</td>
			<td>250 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polypropylene Optiseal tubes</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>361625</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Serological pipettes</td>
			<td>Alkali Scientific</td>
			<td>SP250-B</td>
			<td>50 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Serological pipettes</td>
			<td>Alkali Scientific</td>
			<td>SP225-B</td>
			<td>25 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Serological pipettes</td>
			<td>Alkali Scientific</td>
			<td>SP210-B</td>
			<td>10 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Serological pipettes</td>
			<td>Alkali Scientific</td>
			<td>SP205-B</td>
			<td>5 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Shaker flasks</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>PBV1000</td>
			<td>1 L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Shaker flasks</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>PBV50-0</td>
			<td>500 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Shaker flasks</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>PBV250</td>
			<td>250 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Shaker flasks</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>PBV12-5</td>
			<td>125 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride solution (5 M)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>NC1752640</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile syringes</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>14-955-458</td>
			<td>5 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe filter</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>SLGV013SL</td>
			<td>0.22 micron</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris-HCl pH 8.5 (1 M)</td>
			<td>Kd Medical</td>
			<td>RGE3363</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan blue solution</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15250061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tube rack assembly</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>361646</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tube spacers (x4)</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>361669</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tubing for peristaltic pump</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14190516</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Type 70 Ti fixed-angle titanium rotor</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>337922</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultra low temperature freezer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Set at -70 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vivaspin 20 centrifugal concentrator</td>
			<td>Sartorius</td>
			<td>VS2041</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water bath&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Set at 37 &#176;C</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

suspension culture production and purification of adeno-associated virus by iodixanol density gradient centrifugation for in vivo applications

פרוטוקול זה מתאר ייצור וטיהור רקומביננטי של וירוס הקשור באדנו (rAAV) על ידי צנטריפוגת שיפוע צפיפות יודיקסנול, שיטה אגנוסטית לסרוטיפ לטיהור AAV שתוארה לראשונה בשנת 1999. וקטורי rAAV נמצאים בשימוש נרחב ביישומי ריפוי גנטי כדי להעביר טרנסגנים לסוגי תאים אנושיים שונים. בעבודה זו, הנגיף הרקומביננטי מיוצר על ידי טרנספקציה של תאי Expi293 בתרבית תרחיף עם פלסמידים המקודדים את הגנים הטרנסגנים, קפסיד וקטורי ועוזר אדנו-ויראלי. צנטריפוגת צפיפות יודיקסנול מטהרת חלקיקי AAV מלאים בהתבסס על צפיפות החלקיקים. בנוסף, שלושה שלבים כלולים במתודולוגיה זו הנפוצה כיום על מנת להגדיל את תפוקת הנגיף הכוללת, להפחית את הסיכון למשקעים עקב חלבונים מזהמים, ולרכז עוד יותר את תוצר הנגיף הסופי, בהתאמה: משקעים של חלקיקים נגיפיים ממדיה תאית באמצעות תמיסה של פוליאתילן גליקול (PEG) ונתרן כלורי, הכנסת סבב שני של צנטריפוגה הדרגתית צפיפות יודיקסנול, והחלפת חיץ באמצעות מסנן צנטריפוגלי. באמצעות שיטה זו, ניתן להשיג באופן עקבי טיטרים בטווח של 1012 חלקיקים נגיפיים / מ"ל של טוהר יוצא דופן לשימוש in vivo .

Recombinant adeno-associated viral (rAAV) vectors are widely used tools for the treatment of genetic diseases, including spinal muscular atrophy, retinal dystrophy, and hemophilia A1,2,3. rAAV vectors are engineered to lack viral genes present in wild-type AAV4, a small, non-envelope icosahedral virus with a linear single-stranded 4.7 kb DNA genome. AAV was first discovered in the 1960s as a contaminant of adenovirus preparations5. Despite its small capsid size, which limits the size of the transgene that can be packaged to a maximum of 4.9 kb excluding ITRs6, AAV is useful for transgene delivery because it is non-pathogenic in humans, allows expression of transgene in many dividing and nondividing cell types, and has limited immunogenic effects7.
As members of the genus dependoparvovirus, the production of rAAVs relies on the expression of helper genes present in adenovirus or herpes simplex virus8. Several strategies to produce rAAV have been developed, but production in HEK293 cells transformed with the adenoviral E1A/E1B helper genes is the most established method used today9. The general approach of rAAV production begins with the transfection of HEK293 cells with three plasmids containing the transgene within inverted terminal repeats (ITRs), AAV rep and cap genes, and additional adenoviral helper genes, respectively. Seventy-two hours after transfection, cells are harvested and processed to purify rAAV containing the transgene.
In the development of new rAAV vectors for therapeutic purposes, a major goal is producing vectors with increased transduction efficiency. An increase in the transduction efficiency of target cells would mean a decrease in the necessary clinical dose of rAAV, thus decreasing the likelihood of adverse immunogenic effects ranging from antibody-mediated neutralization to acute toxicities10,11. To improve the transduction efficacy of rAAV vectors, alterations can be made to the packaged genome or to the capsid. Viable methods to tune transduction efficacy via packaged genome design include the incorporation of strong and tissue-specific promoters, thoughtful selection of mRNA processing elements, and coding sequence optimization to improve translation efficiency12. Alterations to the capsid are made with the goal of increasing tropism for target human cell types. Efforts towards developing new rAAV transgene delivery vector capsids are generally characterized by a focus on either rational design of AAV capsids with specific mutations targeting specific cell receptors or directed evolution to identify capsids with tropism for specific cell types from high-complexity combinatorial capsid libraries without targeting one specific receptor (although some groups combine these approaches)13,14,15. In the directed evolution approach, combinatorial capsid libraries are constructed using a particular serotype backbone with mutated variable regions on the capsid exterior16. Combinatorial capsid libraries are often constructed from AAV serotypes not originating in humans, decreasing the risk of preexisting immunity during clinical use10. Therefore, purification methods that can be applied to any serotype are ideal to eliminate the need for serotype-specific optimization for the less commonly used serotypes serving as backbones for these libraries.
Iodixanol density gradient centrifugation is utilized to purify high titers of rAAV with high infectivity17. In this protocol, rAAV is produced in suspension cell culture to decrease the amount of labor needed to produce large titers of AAV. A centrifugation step is also included to clear cell lysate to reduce the presence of contaminating proteins and decrease the risk of virus precipitation. This protocol is a cost-effective method to produce preparations of high-purity rAAV suitable for pre-clinical use.

Author Spotlight: בידוד יעיל של וירוסים הקשורים באדנו ליישומים פרה-קליניים

תרבית תרחיף ייצור וטיהור של וירוס הקשור לאדנו על ידי צנטריפוגת שיפוע צפיפות יודיקסנול עבור יישומי in vivo

We use a directed evolution approach to identify adeno-associated viral capits with higher tropism for target human cell types. Through this research, we aim to produce recombinant adeno-associated viral vectors with improved target cell transduction and clinical relevance within the field of gene therapy. Our group recently de-targeted several AAV serotypes from the liver by incorporating capsid residues original to an AAV serotype that naturally possesses decreased liver tropism.If successfully expanded to additional serotypes, this provides the groundwork to decrease necessary RAAV clinical dose by peripheral injection and reduce adverse patient outcomes. The IODIXanol purification method while being cost effective is difficult to scale up. Additionally, in downstream applications, the directed evolution approach is performed with animal models or in vitro.So capsid isolated by directed evolution may not transduce in vivo targets in humans to the same extent as in preclinical models. This protocol is affordable and accessible for smaller labs. Additionally, this method yields high purity, recombinant adeno-associated virus that can be used for downstream preclinical in vivo applications.

שיטה זו יכולה לשמש להשגת טיטרים של לפחות 1012 חלקיקים נגיפיים לכל מ"ל. ניתן להשיג טיטר (איור 3) באמצעות qPCR באמצעות פריימרים ITR המסופקים בטבלה משלימה 1, באמצעות ddPCR או בכל שיטת טיטרינג אחרת. טיטרים תת-אופטימליים יכולים לנבוע משימוש בגן כובע המקודד לקפסיד עם יע...

Watch this Scientific Journal Video about Author Spotlight: Efficient Adeno-Associated Virus Isolation for Pre-Clinical Applications at JoVE.com

וירוס הקשור באדנו מיוצר בתרבית תאי השעיה ומטוהר על ידי צנטריפוגה הדרגתית בצפיפות יודיקסנול כפולה. צעדים כלולים כדי להגדיל את התפוקה הכוללת של הנגיף, להקטין את הסיכון של משקעים וירוס, ועוד לרכז את המוצר הסופי של הנגיף. הטיטרים הסופיים הצפויים להגיע ל-1012 חלקיקים נגיפיים / מ"ל ומתאימים לשימוש פרה-קליני in vivo .

This protocol describes recombinant adeno-associated virus (rAAV) production and purification by iodixanol density gradient centrifugation, a ...

אנו משתמשים בגישת אבולוציה מכוונת כדי לזהות קפיטים נגיפיים הקשורים באדנו עם טרופיזם גבוה יותר עבור סוגי תאים אנושיים ממוקדים. באמצעות מחקר זה, אנו שואפים לייצר וקטורים נגיפיים רקומביננטיים הקשורים באדנו עם התמרה משופרת של תאי מטרה ורלוונטיות קלינית בתחום הריפוי הגנטי. הקבוצה שלנו ביטלה לאחרונה מספר סרוטיפים AAV מהכבד על ידי שילוב שאריות קפסיד מקוריות לסרוטיפ AAV שיש לו באופן טבעי טרופיזם כבד מופחת.אם יורחב בהצלחה לסרוטיפים נוספים, זה מספק את הבסיס להפחתת המינון הקליני הדרוש של RAAV על ידי הזרקה היקפית ולהפחית את התוצאות השליליות של המטופלים. שיטת טיהור IODIXanol בעוד שהיא חסכונית קשה להרחבה. בנוסף, ביישומים במורד הזרם, גישת האבולוציה המכוונת מבוצעת עם מודלים של בעלי חיים או במבחנה.לכן, קפסיד המבודד על ידי אבולוציה מכוונת עשוי שלא להתמיר מטרות in vivo בבני אדם באותה מידה כמו במודלים פרה-קליניים. פרוטוקול זה הוא זול ונגיש עבור מעבדות קטנות יותר. בנוסף, שיטה זו מניבה טוהר גבוה, וירוס הקשור אדנו רקומביננטי שניתן להשתמש בו עבור יישומים פרה-קליניים in vivo במורד הזרם.

suspension-culture-production-purification-adeno-associated-virus

Research

JoVE Journal

Medicine

Suspension Culture Production and Purification of Adeno-Associated Virus by Iodixanol Density Gradient Centrifugation for In Vivo Applications

This protocol describes recombinant adeno-associated virus (rAAV) production and purification by iodixanol density gradient centrifugation, a serotype-agnostic method of purifying AAV first described in 1999. rAAV vectors are widely used in gene therapy applications to deliver transgenes to various human cell types. In this work, the recombinant virus is produced by transfection of Expi293 cells in suspension culture with plasmids encoding the transgene, vector capsid, and adenoviral helper genes. Iodixanol density gradient centrifugation purifies full AAV particles based on particle density. Additionally, three steps are included in this now-ubiquitous methodology in order to increase total virus yield, decrease the risk of precipitation due to contaminating proteins, and further concentrate the final virus product, respectively: precipitation of viral particles from cell media using a solution of polyethylene glycol (PEG) and sodium chloride, the introduction of a second round of iodixanol density gradient centrifugation, and buffer exchange via a centrifugal filter. Using this method, it is possible to consistently achieve titers in the range of 1012 viral particles/mL of exceptional purity for in vivo use.

Adeno-associated virus is produced in suspension cell culture and purified by double iodixanol density gradient centrifugation. Steps are included to increase total virus yield, decrease the risk of virus precipitation, and further concentrate the final virus product. Expected final titers reach 1012 viral particles/mL and are suitable for pre-clinical in vivo use.