Name: लेखक स्पॉटलाइट: पूर्व-नैदानिक अनुप्रयोगों के लिए कुशल एडेनो-एसोसिएटेड वायरस अलगाव
Uploaded: 2024-02-09T14:30:00
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कोई नहीं।

इस प्रोटोकॉल में उपयोग किए जाने वाले समाधान और बफ़र्स की संरचना तालिका 1में प्रदान की जाती है।
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>विलयन</td>
			<td colspan="2">संयोजन</td>
		</tr><tr><td rowspan="4">एएवी lysis बफर</td>
			<td...

डबल Iodixanol घनत्व ढाल Centrifugation द्वारा AAV अलगाव

<ol>
	<li>Strauss, K. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Onasemnogene+abeparvovec+for+presymptomatic+infants+with+three+copies+of+SMN2+at+risk+for+spinal+muscular+atrophy:+the+Phase+III+SPR1NT+trial.">Onasemnogene abeparvovec for presymptomatic infants with three copies of SMN2 at risk for spinal muscular atrophy: the Phase III SPR1NT trial.</a> Nat Med. 28 (7), 1390-1397 (2022).</li><li>Fuller-Carter, P. I., Basiri, H., Harvey, A. R., Carvalho, L. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Focused+update+on+AAV-based+gene+therapy+clinical+trials+for+inherited+retinal+degeneration.">Focused update on AAV-based gene therapy clinical trials for inherited retinal degeneration.</a> BioDrugs. 34 (6), 763-781 (2020).</li><li>George, L. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiyear+factor+VIII+expression+after+AAV+gene+transfer+for+hemophilia+A.">Multiyear factor VIII expression after AAV gene transfer for hemophilia A.</a> N Engl J Med. 385 (21), 1961-1973 (2021).</li><li>Naso, M. F., Tomkowicz, B., Perry, W. L., Strohl, W. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adeno-Associated+Virus+(AAV)+as+a+vector+for+gene+therapy.">Adeno-Associated Virus (AAV) as a vector for gene therapy.</a> Biodrugs. 31 (4), 317-334 (2017).</li><li>Atchison, R. W., Casto, B. C., Hammon, W. M. c. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adenovirus-associated+defective+virus+particles.">Adenovirus-associated defective virus particles.</a> Science. 149 (3685), 754-756 (1965).</li><li>Wu, Z., Yang, H., Colosi, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+genome+size+on+AAV+vector+packaging.">Effect of genome size on AAV vector packaging.</a> Mol Ther. 18 (1), 80-86 (2010).</li><li>Samulski, R. J., Muzyczka, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=AAV-mediated+gene+therapy+for+research+and+therapeutic+purposes.">AAV-mediated gene therapy for research and therapeutic purposes.</a> Annu Rev Virol. 1 (1), 427-451 (2014).</li><li>Zolotukhin, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+of+recombinant+adeno-associated+virus+vectors.">Production of recombinant adeno-associated virus vectors.</a> Hum Gene Ther. 16 (5), 551-557 (2005).</li><li>Penaud-Budloo, M., Fran&#231;ois, A., Cl&#233;ment, N., Ayuso, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pharmacology+of+recombinant+adeno-associated+virus+production.">Pharmacology of recombinant adeno-associated virus production.</a> Mol Ther - Methods Clin Dev. 8, 166-180 (2018).</li><li>Costa-Verdera, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Understanding+and+Tackling+immune+responses+to+adeno-associated+viral+vectors.">Understanding and Tackling immune responses to adeno-associated viral vectors.</a> Hum Gene Ther. 34 (17-18), 836-852 (2023).</li><li>Ertl, H. C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitigating+serious+adverse+events+in+gene+therapy+with+AAV+Vectors:+Vector+dose+and+immunosuppression.">Mitigating serious adverse events in gene therapy with AAV Vectors: Vector dose and immunosuppression.</a> Drugs. 83 (4), 287-298 (2023).</li><li>Pupo, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=AAV+vectors:+The+Rubik's+cube+of+human+gene+therapy.">AAV vectors: The Rubik's cube of human gene therapy.</a> Mol Ther. 30 (12), 3515-3541 (2022).</li><li>Marsic, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vector+design+tour+de+force:+Integrating+combinatorial+and+rational+approaches+to+derive+novel+adeno-associated+virus+variants.">Vector design tour de force: Integrating combinatorial and rational approaches to derive novel adeno-associated virus variants.</a> Mol Ther. 22 (11), 1900-1909 (2014).</li><li>Grimm, D., Zolotukhin, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=E+Pluribus+Unum:+50+Years+of+research,+millions+of+viruses,+and+one+goal-tailored+acceleration+of+AAV+evolution.">E Pluribus Unum: 50 Years of research, millions of viruses, and one goal-tailored acceleration of AAV evolution.</a> Mol Ther. 23 (12), 1819-1831 (2015).</li><li>Biswas, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineering+and+in+vitro+selection+of+a+novel+AAV3B+variant+with+high+hepatocyte+tropism+and+reduced+seroreactivity.">Engineering and in vitro selection of a novel AAV3B variant with high hepatocyte tropism and reduced seroreactivity.</a> Mol Ther - Methods Clin Dev. 19, 347-361 (2020).</li><li>Perabo, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+selection+of+viral+vectors+with+modified+tropism:+the+adeno-associated+virus+display.">In vitro selection of viral vectors with modified tropism: the adeno-associated virus display.</a> Mol Ther. 8 (1), 151-157 (2003).</li><li>Crosson, S. M., Dib, P., Smith, J. K., Zolotukhin, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Helper-free+production+of+laboratory+grade+AAV+and+purification+by+iodixanol+density+gradient+centrifugation.">Helper-free production of laboratory grade AAV and purification by iodixanol density gradient centrifugation.</a> Mol Ther - Methods Clin Dev. 10, 1-7 (2018).</li><li>Chan, C., Harris, K. K., Zolotukhin, S., Keeler, G. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rational+design+of+AAV-rh74,+AAV3B,+and+AAV8+with+limited+liver+targeting.">Rational design of AAV-rh74, AAV3B, and AAV8 with limited liver targeting.</a> Viruses. 15 (11), 2168 (2023).</li><li>Schmidt, O. W., Cooney, M. K., Foy, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adeno-associated+virus+in+adenovirus+type+3+conjunctivitis.">Adeno-associated virus in adenovirus type 3 conjunctivitis.</a> Infect Immun. 11 (6), 1362-1370 (1975).</li><li>Grimm, D., Kern, A., Rittner, K., Kleinschmidt, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+tools+for+production+and+purification+of+recombinant+adenoassociated+virus+vectors.">Novel tools for production and purification of recombinant adenoassociated virus vectors.</a> Hum Gene Ther. 9 (18), 2745-2760 (1998).</li><li>Zolotukhin, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recombinant+adeno-associated+virus+purification+using+novel+methods+improves+infectious+titer+and+yield.">Recombinant adeno-associated virus purification using novel methods improves infectious titer and yield.</a> Gene Ther. 6 (6), 973-985 (1999).</li><li>Clark, K. R., Liu, X., Mcgrath, J. P., Johnson, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highly+purified+recombinant+adeno-associated+virus+vectors+are+biologically+active+and+free+of+detectable+helper+and+wild-type+viruses.">Highly purified recombinant adeno-associated virus vectors are biologically active and free of detectable helper and wild-type viruses.</a> Hum Gene Ther. 10 (6), 1031-1039 (1999).</li><li>Debelak, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cation-exchange+high-performance+liquid+chromatography+of+recombinant+adeno-associated+virus+type+2.">Cation-exchange high-performance liquid chromatography of recombinant adeno-associated virus type 2.</a> J Chromatogr B Biomed Sci App. 740 (2), 195-202 (2000).</li><li>Burova, E., Ioffe, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chromatographic+purification+of+recombinant+adenoviral+and+adeno-associated+viral+vectors:+methods+and+implications.">Chromatographic purification of recombinant adenoviral and adeno-associated viral vectors: methods and implications.</a> Gene Ther. 12 (1), S5-S17 (2005).</li><li>Adams, B., Bak, H., Tustian, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Moving+from+the+bench+towards+a+large+scale,+industrial+platform+process+for+adeno-associated+viral+vector+purification.">Moving from the bench towards a large scale, industrial platform process for adeno-associated viral vector purification.</a> Biotechnol Bioeng. 117 (10), 3199-3211 (2020).</li><li>Grieger, J. C., Choi, V. W., Samulski, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+and+characterization+of+adeno-associated+viral+vectors.">Production and characterization of adeno-associated viral vectors.</a> Nat Protoc. 1 (3), 1412-1428 (2006).</li><li>Florea, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-efficiency+purification+of+divergent+AAV+serotypes+using+AAVX+affinity+chromatography.">High-efficiency purification of divergent AAV serotypes using AAVX affinity chromatography.</a> Mol Ther Methods Clin Dev. 28, 146-159 (2022).</li><li>Chamberlain, K., Riyad, J. M., Weber, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expressing+transgenes+that+exceed+the+packaging+capacity+of+adeno-associated+virus+capsids.">Expressing transgenes that exceed the packaging capacity of adeno-associated virus capsids.</a> Hum Gene Ther Methods. 27 (1), 1-12 (2016).</li><li>Green, E. A., Hamaker, N. K., Lee, K. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+vector+elements+and+process+conditions+in+transient+and+stable+suspension+HEK293+platforms+using+SARS-CoV-2+receptor+binding+domain+as+a+model+protein.">Comparison of vector elements and process conditions in transient and stable suspension HEK293 platforms using SARS-CoV-2 receptor binding domain as a model protein.</a> BMC Biotechnol. 23 (1), 7 (2023).</li><li>Erbacher, P., Zou, S., Bettinger, T., Steffan, A. M., Remy, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chitosan-based+vector/DNA+complexes+for+gene+delivery:+Biophysical+characteristics+and+transfection+ability.">Chitosan-based vector/DNA complexes for gene delivery: Biophysical characteristics and transfection ability.</a> Pharm Res. 15 (9), 1332-1339 (1998).</li><li>Vandenberghe, L. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+serotype-dependent+release+of+functional+vector+into+the+culture+medium+during+adeno-associated+virus+manufacturing.">Efficient serotype-dependent release of functional vector into the culture medium during adeno-associated virus manufacturing.</a> Hum Gene Ther. 21 (10), 1251-1257 (2010).</li><li>Summerford, C., Samulski, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Membrane-associated+heparan+sulfate+proteoglycan+is+a+receptor+for+adeno-associated+virus+type+2+virions.">Membrane-associated heparan sulfate proteoglycan is a receptor for adeno-associated virus type 2 virions.</a> J Virol. 72 (2), 1438-1445 (1998).</li><li>Wright, J. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+factors+that+contribute+to+recombinant+AAV2+particle+aggregation+and+methods+to+prevent+its+occurrence+during+vector+purification+and+formulation.">Identification of factors that contribute to recombinant AAV2 particle aggregation and methods to prevent its occurrence during vector purification and formulation.</a> Mol Ther. 12 (1), 171-178 (2005).</li><li>Gruntman, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stability+and+compatibility+of+recombinant+adeno-associated+virus+under+conditions+commonly+encountered+in+human+gene+therapy+trials.">Stability and compatibility of recombinant adeno-associated virus under conditions commonly encountered in human gene therapy trials.</a> Hum Gene Ther Methods. 26 (2), 71-76 (2015).</li><li>Srivastava, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rationale+and+strategies+for+the+development+of+safe+and+effective+optimized+AAV+vectors+for+human+gene+therapy.">Rationale and strategies for the development of safe and effective optimized AAV vectors for human gene therapy.</a> Mol Ther Nucleic Acids. 32, 949-959 (2023).</li><li>Mullard, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FDA+approves+first+gene+therapy+for+Duchenne+muscular+dystrophy,+despite+internal+objections.">FDA approves first gene therapy for Duchenne muscular dystrophy, despite internal objections.</a> Nat Rev Drug Discov. 22 (8), 610-610 (2023).</li><li>Center for Biologics Evaluation and Research. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Approved+Cellular+and+Gene+Therapy+Products.">Approved Cellular and Gene Therapy Products.</a> US Food Drug Adm. , (2023).</li><li>Kang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=AAV+vectors+applied+to+the+treatment+of+CNS+disorders:+Clinical+status+and+challenges.">AAV vectors applied to the treatment of CNS disorders: Clinical status and challenges.</a> J Control Release Off J Control Release Soc. 355, 458-473 (2023).</li><li>De Wolf, D., Singh, K., Chuah, M. K., VandenDriessche, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hemophilia+gene+therapy:+The+end+of+the+beginning.">Hemophilia gene therapy: The end of the beginning.</a> Hum Gene Ther. 34 (17-18), 782-792 (2023).</li><li>Simons, E. J., Trapani, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+opportunities+and+challenges+of+gene+therapy+for+treatment+of+inherited+forms+of+vision+and+hearing+loss.">The opportunities and challenges of gene therapy for treatment of inherited forms of vision and hearing loss.</a> Hum Gene Ther. 34 (17-18), 808-820 (2023).</li></ol>

डबल आयोडिक्सानॉल घनत्व ढाल शुद्धि प्रोटोकॉल सार्वभौमिक विधि है क्योंकि यह किसी भी एएवी उत्परिवर्ती वेरिएंट पर लागू होता है, चाहे उनकी रिसेप्टर विशिष्टता कुछ भी हो। एएवी शुद्धि के प्रारंभिक तरीकों क?...

पुनः संयोजक एडेनो-जुड़े वायरल (आरएएवी) वैक्टर व्यापक रूप से आनुवंशिक रोगों के उपचार के लिए उपकरण का उपयोग किया जाता है, जिसमें रीढ़ की हड्डी पेशी शोष, रेटिना डिस्ट्रोफी, और हीमोफिलिया ए 1,2,3 शामिल हैं। आरएएवी वैक्टर को जंगली-प्रकार एएवी4 में मौजूद वायरल जीन की कमी के लिए इंजीनियर किया जाता है, जो एक रैखिक एकल-फंसे 4.7 केबी डीएनए जीनोम के साथ एक छोटा, गैर-लिफाफा इकोसाहेड्रल वायरस है। एएवी को पहली बार 1960 के दशक में एडेनोवायरसतैयारी 5 के संदूषक के रूप में खोजा गया था। अपने छोटे कैप्सिड आकार के बावजूद, जो ट्रांसजीन के आकार को सीमित करता है जिसे आईटीआर6 को छोड़कर अधिकतम 4.9 केबी तक पैक किया जा सकता है, एएवी ट्रांसजीन डिलीवरी के लिए उपयोगी है क्योंकि यह मनुष्यों में गैर-रोगजनक है, कई विभाजित और गैर-विभाजित सेल प्रकारों में ट्रांसजीन की अभिव्यक्ति की अनुमति देता है, और सीमित इम्युनोजेनिक प्रभाव7.
जीनस डिपेंडोपार्वोवायरस के सदस्यों के रूप में, आरएएवी का उत्पादन एडेनोवायरस या हर्पीज सिम्प्लेक्स वायरस8 में मौजूद सहायक जीन की अभिव्यक्ति पर निर्भर करता है। आरएएवी का उत्पादन करने के लिए कई रणनीतियों का विकास किया गया है, लेकिन एडेनोवायरल ई 1 ए / ई 1 बी हेल्पर जीन के साथ परिवर्तित एचईके 293 कोशिकाओं में उत्पादन आज इस्तेमाल की जाने वाली सबसे स्थापित विधि है9. आरएएवी उत्पादन का सामान्य दृष्टिकोण क्रमशः उल्टे टर्मिनल रिपीट (आईटीआर), एएवी प्रतिनिधि और कैप जीन, और अतिरिक्त एडेनोवायरल हेल्पर जीन के भीतर ट्रांसजीन युक्त तीन प्लास्मिड के साथ HEK293 कोशिकाओं के अभिकर्मक के साथ शुरू होता है। अभिकर्मक के बहत्तर घंटे बाद, कोशिकाओं को काटा जाता है और ट्रांसजीन युक्त आरएएवी को शुद्ध करने के लिए संसाधित किया जाता है।
चिकित्सीय उद्देश्यों के लिए नए आरएएवी वैक्टर के विकास में, एक प्रमुख लक्ष्य बढ़ी हुई पारगमन दक्षता के साथ वैक्टर का उत्पादन कर रहा है। लक्ष्य कोशिकाओं के पारगमन दक्षता में वृद्धि आरएएवी के आवश्यक नैदानिक खुराक में कमी का मतलब होगा, इस प्रकार तीव्र विषाक्तता10,11 के लिए एंटीबॉडी मध्यस्थता तटस्थता से लेकर प्रतिकूल इम्युनोजेनिक प्रभाव की संभावना कम हो रही है. आरएएवी वैक्टर की पारगमन प्रभावकारिता में सुधार करने के लिए, पैक किए गए जीनोम या कैप्सिड में परिवर्तन किए जा सकते हैं। पैक जीनोम डिजाइन के माध्यम से पारगमन प्रभावकारिता धुन करने के लिए व्यवहार्य तरीकों मजबूत और ऊतक विशिष्ट प्रमोटरों, एमआरएनए प्रसंस्करण तत्वों के विचारशील चयन, और अनुवाद दक्षता12 में सुधार करने के लिए कोडिंग अनुक्रम अनुकूलन के समावेश शामिल हैं. कैप्सिड में परिवर्तन लक्ष्य मानव कोशिका प्रकारों के लिए ट्रोपिज्म बढ़ाने के लक्ष्य के साथ किए जाते हैं। नए आरएएवी ट्रांसजीन डिलीवरी वेक्टर कैप्सिड विकसित करने के प्रयासों को आम तौर पर विशिष्ट सेल रिसेप्टर्स को लक्षित करने वाले विशिष्ट उत्परिवर्तन के साथ एएवी कैप्सिड के तर्कसंगत डिजाइन पर ध्यान केंद्रित करने की विशेषता होती है या एक विशिष्ट रिसेप्टर को लक्षित किए बिना उच्च जटिलता कॉम्बिनेटरियल कैप्सिड पुस्तकालयों से विशिष्ट सेल प्रकारों के लिए ट्रोपिज्म के साथ कैप्सिड की पहचान करने के लिए निर्देशित विकास (हालांकि कुछ समूह इन दृष्टिकोणों को जोड़ते हैं)13, 14,15. निर्देशित विकास दृष्टिकोण में, combinatorial capsid पुस्तकालयों capsid बाहरी16 पर उत्परिवर्तित चर क्षेत्रों के साथ एक विशेष सीरोटाइप रीढ़ का उपयोग कर निर्माण कर रहे हैं. कॉम्बिनेटरियल कैप्सिड पुस्तकालयों का निर्माण अक्सर एएवी सीरोटाइप से किया जाता है जो मनुष्यों में उत्पन्न नहीं होते हैं, नैदानिक उपयोग10 के दौरान पूर्ववर्ती प्रतिरक्षा के जोखिम को कम करते हैं। इसलिए, शुद्धि विधियां जिन्हें किसी भी सीरोटाइप पर लागू किया जा सकता है, इन पुस्तकालयों के लिए रीढ़ के रूप में सेवा करने वाले कम सामान्यतः उपयोग किए जाने वाले सीरोटाइप के लिए सीरोटाइप-विशिष्ट अनुकूलन की आवश्यकता को समाप्त करने के लिए आदर्श हैं।
Iodixanol घनत्व ढाल centrifugation उच्च संक्रामकता17 के साथ rAAV के उच्च टाइटर्स शुद्ध करने के लिए प्रयोग किया जाता है. इस प्रोटोकॉल में, आरएएवी के बड़े टाइटर्स का उत्पादन करने के लिए आवश्यक श्रम की मात्रा को कम करने के लिए निलंबन सेल संस्कृति में आरएएवी का उत्पादन किया जाता है। दूषित प्रोटीन की उपस्थिति को कम करने और वायरस वर्षा के जोखिम को कम करने के लिए सेल लाइसेट को साफ करने के लिए एक सेंट्रीफ्यूजेशन कदम भी शामिल है। यह प्रोटोकॉल पूर्व-नैदानिक उपयोग के लिए उपयुक्त उच्च शुद्धता आरएएवी की तैयारी का उत्पादन करने के लिए एक लागत प्रभावी तरीका है।

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>5810 R benchtop centrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>22625501</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>8-channel peristaltic pump&#160;</td>
			<td>Watson-Marlow</td>
			<td>020.3708.00A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Automated cell counter&#160;</td>
			<td>NanoEntek</td>
			<td>EVE-MC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Avanti J-E high-speed centrifuge</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>369001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Benzonase</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>88701</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biological safety cabinet</td>
			<td>Labconco</td>
			<td>322491101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CO2 incubator with shaker&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Set at 8% CO2 and 37 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Conical centrifuge tubes</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>339652</td>
			<td>50 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Conical centrifuge tubes</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>339650</td>
			<td>15 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable micro-pipets</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>21-164-2G</td>
			<td>Capillaries</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s phosphate buffered saline without CaCl2 and MgCl2&#160; (DPBS) (10x)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D1408</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ECLIPSE Ts2R-FL inverted microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Expi293 Expression Medium</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>A1435101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Expi293F cells</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>A14527</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter tips</td>
			<td>USA Scientific</td>
			<td>1126-7810</td>
			<td>1000 &#181;L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter tips</td>
			<td>USA Scientific</td>
			<td>1120-8810</td>
			<td>200 &#181;L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter tips</td>
			<td>USA Scientific</td>
			<td>1120-1810</td>
			<td>20 &#181;L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter tips</td>
			<td>USA Scientific</td>
			<td>1121-3810</td>
			<td>10 &#181;L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hypodermic needles</td>
			<td>Tyco Healthcare</td>
			<td>820112</td>
			<td>20 GA x 1-1/2 A</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ice bucket with lid</td>
			<td>VWR</td>
			<td>10146-184</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>JS-5.3 rotor</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>368690</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium chloride solution (1 M)</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>M1028-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Metal stand and clamp&#160;</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>05-769-6Q</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge tubes</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>22600028</td>
			<td>1.5 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Needle nose pliers</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optima XE-90 ultracentrifuge</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>A94471</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Opti-MEM I Reduced-Serum Medium</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>31985062</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OptiPrep density gradient media (iodixanol)</td>
			<td>Serumwerk</td>
			<td>AXS-1114542</td>
			<td>60% iodixanol solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>P1000 Pipet</td>
			<td>Gilson</td>
			<td>F144059M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>P2 Pipet</td>
			<td>Gilson</td>
			<td>F144054M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>P20 Pipet</td>
			<td>Gilson</td>
			<td>F144056M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>P200 Pipet</td>
			<td>Gilson</td>
			<td>F144058M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phenol red&#160;solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P0290</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffered saline (PBS)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P4474</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipet-Aid XP pipette controller</td>
			<td>Drummond Scientific</td>
			<td>4-000-101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasmid pCapsid</td>
			<td>De novo or Addgene, etc.&#160;</td>
			<td>N/A</td>
			<td>We used pACGrh74.&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasmid pHelper</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>112867</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasmid pTransgene</td>
			<td>De novo or Addgene, etc.&#160;</td>
			<td>N/A</td>
			<td>We used pdsAAV-GFP.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pluronic F-68 polyol solution (10%)</td>
			<td>Mp Biomedicals</td>
			<td>92750049</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyethylene glycol 8000</td>
			<td>Research Products International</td>
			<td>P48080-500.0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyethylenimine HCl Max (PEI-Max)</td>
			<td>Polysciences</td>
			<td>NC1038561</td>
			<td>Dilute in water to 40 &#956;M</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polypropylene centrifuge tubes, sterile</td>
			<td>Corning</td>
			<td>431123</td>
			<td>500 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polypropylene centrifuge tubes, sterile</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430776</td>
			<td>250 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polypropylene Optiseal tubes</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>361625</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Serological pipettes</td>
			<td>Alkali Scientific</td>
			<td>SP250-B</td>
			<td>50 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Serological pipettes</td>
			<td>Alkali Scientific</td>
			<td>SP225-B</td>
			<td>25 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Serological pipettes</td>
			<td>Alkali Scientific</td>
			<td>SP210-B</td>
			<td>10 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Serological pipettes</td>
			<td>Alkali Scientific</td>
			<td>SP205-B</td>
			<td>5 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Shaker flasks</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>PBV1000</td>
			<td>1 L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Shaker flasks</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>PBV50-0</td>
			<td>500 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Shaker flasks</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>PBV250</td>
			<td>250 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Shaker flasks</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>PBV12-5</td>
			<td>125 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride solution (5 M)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>NC1752640</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile syringes</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>14-955-458</td>
			<td>5 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe filter</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>SLGV013SL</td>
			<td>0.22 micron</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris-HCl pH 8.5 (1 M)</td>
			<td>Kd Medical</td>
			<td>RGE3363</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan blue solution</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15250061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tube rack assembly</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>361646</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tube spacers (x4)</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>361669</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tubing for peristaltic pump</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14190516</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Type 70 Ti fixed-angle titanium rotor</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>337922</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultra low temperature freezer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Set at -70 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vivaspin 20 centrifugal concentrator</td>
			<td>Sartorius</td>
			<td>VS2041</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water bath&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Set at 37 &#176;C</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

suspension culture production and purification of adeno-associated virus by iodixanol density gradient centrifugation for in vivo applications

यह प्रोटोकॉल पुनः संयोजक एडेनो-जुड़े वायरस (आरएएवी) उत्पादन और आयोडिक्सानॉल घनत्व ढाल सेंट्रीफ्यूजेशन द्वारा शुद्धिकरण का वर्णन करता है, जो पहली बार 1999 में वर्णित एएवी को शुद्ध करने की एक सीरोटाइप-अज्ञेयवादी विधि है। आरएएवी वैक्टर का व्यापक रूप से जीन थेरेपी अनुप्रयोगों में विभिन्न मानव कोशिका प्रकारों में ट्रांसजीन देने के लिए उपयोग किया जाता है। इस काम में, पुनः संयोजक वायरस ट्रांसजीन, वेक्टर कैप्सिड और एडेनोवायरल हेल्पर जीन को एन्कोडिंग करने वाले प्लास्मिड के साथ निलंबन संस्कृति में Expi293 कोशिकाओं के अभिकर्मक द्वारा निर्मित होता है। Iodixanol घनत्व ढाल centrifugation कण घनत्व के आधार पर पूर्ण AAV कणों को शुद्ध करता है। इसके अतिरिक्त, कुल वायरस उपज बढ़ाने के लिए इस अब-सर्वव्यापी पद्धति में तीन चरण शामिल हैं, दूषित प्रोटीन के कारण वर्षा के जोखिम को कम करते हैं, और क्रमशः अंतिम वायरस उत्पाद को और अधिक केंद्रित करते हैं: पॉलीथीन ग्लाइकॉल (पीईजी) और सोडियम क्लोराइड के समाधान का उपयोग करके सेल मीडिया से वायरल कणों की वर्षा, आयोडिक्सानॉल घनत्व ढाल सेंट्रीफ्यूजेशन के दूसरे दौर की शुरूआत, और एक केन्द्रापसारक फिल्टर के माध्यम से बफर विनिमय। इस पद्धति का उपयोग करके, विवो उपयोग के लिए असाधारण शुद्धता के 1012 वायरल कणों/एमएल की सीमा में टाइटर्स को लगातार प्राप्त करना संभव है।

Recombinant adeno-associated viral (rAAV) vectors are widely used tools for the treatment of genetic diseases, including spinal muscular atrophy, retinal dystrophy, and hemophilia A1,2,3. rAAV vectors are engineered to lack viral genes present in wild-type AAV4, a small, non-envelope icosahedral virus with a linear single-stranded 4.7 kb DNA genome. AAV was first discovered in the 1960s as a contaminant of adenovirus preparations5. Despite its small capsid size, which limits the size of the transgene that can be packaged to a maximum of 4.9 kb excluding ITRs6, AAV is useful for transgene delivery because it is non-pathogenic in humans, allows expression of transgene in many dividing and nondividing cell types, and has limited immunogenic effects7.
As members of the genus dependoparvovirus, the production of rAAVs relies on the expression of helper genes present in adenovirus or herpes simplex virus8. Several strategies to produce rAAV have been developed, but production in HEK293 cells transformed with the adenoviral E1A/E1B helper genes is the most established method used today9. The general approach of rAAV production begins with the transfection of HEK293 cells with three plasmids containing the transgene within inverted terminal repeats (ITRs), AAV rep and cap genes, and additional adenoviral helper genes, respectively. Seventy-two hours after transfection, cells are harvested and processed to purify rAAV containing the transgene.
In the development of new rAAV vectors for therapeutic purposes, a major goal is producing vectors with increased transduction efficiency. An increase in the transduction efficiency of target cells would mean a decrease in the necessary clinical dose of rAAV, thus decreasing the likelihood of adverse immunogenic effects ranging from antibody-mediated neutralization to acute toxicities10,11. To improve the transduction efficacy of rAAV vectors, alterations can be made to the packaged genome or to the capsid. Viable methods to tune transduction efficacy via packaged genome design include the incorporation of strong and tissue-specific promoters, thoughtful selection of mRNA processing elements, and coding sequence optimization to improve translation efficiency12. Alterations to the capsid are made with the goal of increasing tropism for target human cell types. Efforts towards developing new rAAV transgene delivery vector capsids are generally characterized by a focus on either rational design of AAV capsids with specific mutations targeting specific cell receptors or directed evolution to identify capsids with tropism for specific cell types from high-complexity combinatorial capsid libraries without targeting one specific receptor (although some groups combine these approaches)13,14,15. In the directed evolution approach, combinatorial capsid libraries are constructed using a particular serotype backbone with mutated variable regions on the capsid exterior16. Combinatorial capsid libraries are often constructed from AAV serotypes not originating in humans, decreasing the risk of preexisting immunity during clinical use10. Therefore, purification methods that can be applied to any serotype are ideal to eliminate the need for serotype-specific optimization for the less commonly used serotypes serving as backbones for these libraries.
Iodixanol density gradient centrifugation is utilized to purify high titers of rAAV with high infectivity17. In this protocol, rAAV is produced in suspension cell culture to decrease the amount of labor needed to produce large titers of AAV. A centrifugation step is also included to clear cell lysate to reduce the presence of contaminating proteins and decrease the risk of virus precipitation. This protocol is a cost-effective method to produce preparations of high-purity rAAV suitable for pre-clinical use.

लेखक स्पॉटलाइट: पूर्व-नैदानिक अनुप्रयोगों के लिए कुशल एडेनो-एसोसिएटेड वायरस अलगाव

सस्पेंशन कल्चर प्रोडक्शन एंड प्यूरीफिकेशन ऑफ एडेनो-एसोसिएटेड वायरस बाय Iodixanol डेंसिटी ग्रेडिएंट सेंट्रीफ्यूजेशन इन विवो एप्लीकेशंस

We use a directed evolution approach to identify adeno-associated viral capits with higher tropism for target human cell types. Through this research, we aim to produce recombinant adeno-associated viral vectors with improved target cell transduction and clinical relevance within the field of gene therapy. Our group recently de-targeted several AAV serotypes from the liver by incorporating capsid residues original to an AAV serotype that naturally possesses decreased liver tropism.If successfully expanded to additional serotypes, this provides the groundwork to decrease necessary RAAV clinical dose by peripheral injection and reduce adverse patient outcomes. The IODIXanol purification method while being cost effective is difficult to scale up. Additionally, in downstream applications, the directed evolution approach is performed with animal models or in vitro.So capsid isolated by directed evolution may not transduce in vivo targets in humans to the same extent as in preclinical models. This protocol is affordable and accessible for smaller labs. Additionally, this method yields high purity, recombinant adeno-associated virus that can be used for downstream preclinical in vivo applications.

इस विधि का उपयोग एमएल प्रति कम से कम 1012 वायरल कणों के टाइटर्स प्राप्त करने के लिए किया जा सकता है। पूरक तालिका 1 में प्रदान किए गए आईटीआर प्राइमरों का उपयोग करके, डीडीपीसीआर द्वारा, या किसी अन्य...

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एडेनो-जुड़े वायरस निलंबन सेल संस्कृति में उत्पन्न होते हैं और डबल आयोडिक्सानोल घनत्व ढाल सेंट्रीफ्यूजेशन द्वारा शुद्ध होते हैं। कुल वायरस उपज बढ़ाने, वायरस वर्षा के जोखिम को कम करने और अंतिम वायरस उत्पाद को और अधिक केंद्रित करने के लिए कदम शामिल किए गए हैं। अपेक्षित अंतिम टाइटर्स 1012 वायरल कणों/एमएल तक पहुंचते हैं और विवो उपयोग में पूर्व-नैदानिक के लिए उपयुक्त होते हैं।

This protocol describes recombinant adeno-associated virus (rAAV) production and purification by iodixanol density gradient centrifugation, a ...

हम लक्षित मानव कोशिका प्रकारों के लिए उच्च ट्रोपिज्म के साथ एडेनो-जुड़े वायरल कैप की पहचान करने के लिए एक निर्देशित विकास दृष्टिकोण का उपयोग करते हैं। इस शोध के माध्यम से, हम जीन थेरेपी के क्षेत्र में बेहतर लक्ष्य सेल पारगमन और नैदानिक प्रासंगिकता के साथ पुनः संयोजक एडेनो-जुड़े वायरल वैक्टर का उत्पादन करना चाहते हैं। हमारे समूह ने हाल ही में एएवी सीरोटाइप के लिए मूल कैप्सिड अवशेषों को शामिल करके यकृत से कई एएवी सीरोटाइप को डी-लक्षित किया है जो स्वाभाविक रूप से यकृत ट्रोपिज्म में कमी आई है।यदि सफलतापूर्वक अतिरिक्त सीरोटाइप तक विस्तारित किया जाता है, तो यह परिधीय इंजेक्शन द्वारा आवश्यक आरएएवी नैदानिक खुराक को कम करने और प्रतिकूल रोगी परिणामों को कम करने के लिए आधारभूत कार्य प्रदान करता है। IODIXanol शुद्धिकरण विधि लागत प्रभावी होने के बावजूद बड़े पैमाने पर मुश्किल है। इसके अतिरिक्त, डाउनस्ट्रीम अनुप्रयोगों में, निर्देशित विकास दृष्टिकोण पशु मॉडल या इन विट्रो के साथ किया जाता है।इसलिए निर्देशित विकास द्वारा पृथक कैप्सिड मनुष्यों में विवो लक्ष्यों में उसी हद तक ट्रांसड्यूस नहीं कर सकता है जैसे कि प्रीक्लिनिकल मॉडल में। यह प्रोटोकॉल छोटी प्रयोगशालाओं के लिए सस्ती और सुलभ है। इसके अतिरिक्त, यह विधि उच्च शुद्धता, पुनः संयोजक एडेनो-जुड़े वायरस पैदा करती है जिसका उपयोग विवो अनुप्रयोगों में डाउनस्ट्रीम प्रीक्लिनिकल के लिए किया जा सकता है।

suspension-culture-production-purification-adeno-associated-virus

Research

JoVE Journal

Medicine

Suspension Culture Production and Purification of Adeno-Associated Virus by Iodixanol Density Gradient Centrifugation for In Vivo Applications

This protocol describes recombinant adeno-associated virus (rAAV) production and purification by iodixanol density gradient centrifugation, a serotype-agnostic method of purifying AAV first described in 1999. rAAV vectors are widely used in gene therapy applications to deliver transgenes to various human cell types. In this work, the recombinant virus is produced by transfection of Expi293 cells in suspension culture with plasmids encoding the transgene, vector capsid, and adenoviral helper genes. Iodixanol density gradient centrifugation purifies full AAV particles based on particle density. Additionally, three steps are included in this now-ubiquitous methodology in order to increase total virus yield, decrease the risk of precipitation due to contaminating proteins, and further concentrate the final virus product, respectively: precipitation of viral particles from cell media using a solution of polyethylene glycol (PEG) and sodium chloride, the introduction of a second round of iodixanol density gradient centrifugation, and buffer exchange via a centrifugal filter. Using this method, it is possible to consistently achieve titers in the range of 1012 viral particles/mL of exceptional purity for in vivo use.

Adeno-associated virus is produced in suspension cell culture and purified by double iodixanol density gradient centrifugation. Steps are included to increase total virus yield, decrease the risk of virus precipitation, and further concentrate the final virus product. Expected final titers reach 1012 viral particles/mL and are suitable for pre-clinical in vivo use.