Name: Author Spotlight: Assessing Intrathecal Gene Therapy Efficacy in Juvenile Rats
Uploaded: 2024-03-29T14:00:00
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著者らは、幼若ラットが髄腔内注射に対してもたらす課題について生産的な議論をしてくれたUTサウスウェスタン大学のSteven Gray氏、Matthew Rioux氏、Nanda Regmi氏、Lacey Stearman氏に感謝します。この研究は、ジャガー・ジーン・セラピー(JLFK)からの資金提供によって部分的に支援されました。

この研究は、エモリー大学の施設内動物管理および使用委員会(IACUC)によって承認されました。本研究では、Sprague-Dawleyラット(生後28-30日齢、体重約90-135g、雄と雌)を用いた。
1. ベクターの調製
<ol><li>手順の開始時に、AAV9ベクター( 材料の表を参照)を氷上で解凍します。</li>
	<li>ベクターを含む微量遠心チューブを卓上型遠心分離機で短時間遠心...

Lumbar Puncture Delivery of AAV9 in Juvenile Rats for CNS Gene Therapy

<ol>
	<li>Wurster, C., Petri, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Progress+in+spinal+muscular+atrophy+research.">Progress in spinal muscular atrophy research.</a> Curr Opin Neurol. 35 (5), 693-698 (2022).</li><li>Wu, K. 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R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+CNS+gene+delivery+and+evasion+of+anti-aav-neutralizing+antibodies+by+intrathecal+aav+administration+in+non-human+primates.">Global CNS gene delivery and evasion of anti-aav-neutralizing antibodies by intrathecal aav administration in non-human primates.</a> Gene Ther. 20 (4), 450-459 (2013).</li><li>Meyer, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improving+single+injection+CSF+delivery+of+AAV9-mediated+gene+therapy+for+sma:+A+dose-response+study+in+mice+and+non-human+primates.">Improving single injection CSF delivery of AAV9-mediated gene therapy for sma: A dose-response study in mice and non-human primates.</a> Mol Ther. 23 (3), 477-487 (2015).</li><li>Hinderer, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+intrathecal+routes+of+administration+for+adeno-associated+viral+vectors+in+large+animals.">Evaluation of intrathecal routes of administration for adeno-associated viral vectors in large animals.</a> Hum Gene Ther. 29 (1), 15-24 (2018).</li><li>Wang, Y. 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CNSにはさまざまな疾患が罹患しています。ウイルスベクターを介して関連遺伝子の機能的コピーを提供することは、脊髄性筋萎縮症など、本質的に劣性で単一遺伝子である患者にとって魅力的な治療戦略です。ただし、血液脳関門 (BBB) は、静脈内投与されるほとんどの遺伝子治療ベクターを除外します11。AAV9のようなBBBを通過できるものは、末梢形質導入によるベクター損...

近年、脊髄性筋萎縮症、網膜ジストロフィー、第IX因子血友病、がんなどの治療薬がFDAに承認されたことで、ウイルス媒介性遺伝子治療の有望性がついに実現されました1,2,3,4。現在、他にも数え切れないほどの治療法が開発されています。遺伝子治療は、治療用遺伝子を患者さんの細胞に届けることを目的としています。この新しい遺伝子の産物は、欠損した内因性遺伝子の欠落した活性を補ったり、毒性遺伝子を阻害したり、がん細胞を殺したり、その他の有益な機能を提供したりすることができます。
中枢神経系(CNS)に影響を与える疾患では、遺伝子治療ベクターを標的組織に直接送達することが望ましい場合が多いです。非全身的アプローチは、末梢形質導入によって引き起こされる可能性のあるオフターゲット副作用を最小限に抑えることと、標的組織5で適切なレベルの形質導入を達成するために必要なベクターの量を大幅に減少させるという2つの利点を提供する。
遺伝子治療ベクターをCNSに送達するには、さまざまなアプローチがあります。実質内注射は、ベクターを脊髄または脳組織に直接注入することであり、定義された領域への送達に使用できます。しかし、多くの疾患では、CNSの広範な形質導入が望まれています。これは、脳と脊髄の中や周囲を流れる脳脊髄液(CSF)5にベクターを送達することで達成できます。ベクトルを CSF に送達するには、主に 3 つの方法があります。最も侵襲的なアプローチは、頭蓋骨にバリ穴を開け、脳から側脳室に針を進める脳室内分娩です。これにより、脳全体に形質導入が起こります。しかし、この手順は頭蓋内出血を引き起こす可能性があり、このアプローチは一般に脊髄の限定的な形質導入のみを引き起こします6。頭蓋骨の基部にある大槽への注射は侵襲性が低いですが、脳幹に損傷を与えるリスクがあります。動物実験5ではよく使用されるが、大槽への注射はもはや診療所では日常的に使用されていない7。腰椎穿刺は、CSFにアクセスするための最も侵襲性の低いアプローチです。これには、2つの腰椎の間と腰椎槽に針を配置することが含まれます。
ベクター送達のための腰椎穿刺は、成体ラットとマウス、および新生児マウスで日常的に行われています8,9。この研究の著者らは最近、幼若ラット(生後28〜30日)で腰椎穿刺を行い、アデノ随伴ウイルス血清型9(AAV9)ベクターを送達しました。成体ラットでは、新生児腰椎穿刺針をL3椎骨とL4椎骨9の間に垂直に配置した。適切に配置すると、テールフリックとCSFがニードルリザーバーに流れ込みます。しかし、幼若ラットでは、これらの読み出しはどちらも達成できませんでした。次に、著者らは、L5とL6の間の角度で挿入された27Gインスリン注射器を使用して、成体マウスの手順を適応させようと試みました10。成体マウスでは、通常、P28ラットよりも小さいため、これはテールフリックを引き起こしませんが、注射液の逆流により誤った針の配置が明らかになります。しかし、幼若ラットでは、このアプローチにより、注射液が硬膜外に送達されることが一様に示され、これは、成体マウスと幼若ラットの間で脊髄を囲む組織層の弾力性が異なるためと考えられる。次に、カテーテルアプローチを評価しました。具体的には、カテーテルは腰椎槽の硬膜の切開部から胸部中央部の脊髄まで導入されました。しかし、このアプローチでは、分娩中に注射液が切開部位から大幅に逆流することになりました。ガイド針を使用して経皮的にカテーテルを髄腔内空間に配置する試みも成功しませんでした。層間幅が狭いため、カテーテルは吻側椎吻板に当たって前進しない可能性があります。
ここでは、幼若ラットにおける腰椎穿刺 による 成功し再現性のある溶液送達を達成するための方法が記載されている。このアプローチは、ウイルスベクターに使用でき、細胞、医薬品、その他の治療薬にも使用できる可能性があります。

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>200 &#181;L filtered pipette tips</td>
			<td>MidSci</td>
			<td>PR-200RK-FL</td>
			<td>Pipetting virus</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AAV9-GFP</td>
			<td>Vector Builder</td>
			<td>P200624-1005ynr</td>
			<td>AAV9 vector expressing GFP</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Absorbable Suture with Needle Coated Vicryl Polyglactin 910 FS-2 3/8 Circle Reverse Cutting Needle Size 4 - 0 Braided</td>
			<td>McKesson</td>
			<td>J422H</td>
			<td>Suture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bench pad</td>
			<td>VWR</td>
			<td>56616-031</td>
			<td>Surgery</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Braintree Scientific Isothermal Pads, 8&#39;&#39; x 8&#39;&#39;</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>50-195-4664</td>
			<td>Maintains body temperature</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Buprenorphine</td>
			<td>McKesson</td>
			<td>1013922</td>
			<td>Analgesic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Buprenorphine-ER (1 mg/mL)</td>
			<td>Zoopharma</td>
			<td></td>
			<td>Extended-release analgesic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cotton swabs</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>19-365-409</td>
			<td>Blood removal</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Drape, Mouse, Clear Plastic, 12&#34; x 12&#34;, with Adhesive Fenestration</td>
			<td>Steris</td>
			<td>1212CPSTF</td>
			<td>Surgical drape</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont #5 Forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11251-20</td>
			<td>Forceps</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electric Blanket</td>
			<td>CVS Health</td>
			<td></td>
			<td>CVS Health Series 500 Extra Long Heating Pad</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf Research plus, 1-channel pipette, variable, 20&#8211;200 &#181;L</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>3123000055</td>
			<td>Pipetting virus</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine Scissors</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>14059-11</td>
			<td>Curved surgical scissors</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Friedman-Pearson Rongeurs</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>16121-14</td>
			<td>Laminectomy</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Halsey Needle Holders</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>12001-13</td>
			<td>Needle driver</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin Syringes with Ultra-Fine Needle 12.7 mm x 30 G 3/10 mL/cc</td>
			<td>BD</td>
			<td>328431</td>
			<td>Syringe</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane</td>
			<td>McKesson</td>
			<td>803250</td>
			<td>Anesthetic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropanol wipes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>22-031-350</td>
			<td>Skin disinfection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lidocaine, 1%</td>
			<td>McKesson</td>
			<td>239935</td>
			<td>Local anesthesia</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge Tubes: 1.5mL</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>05-408-137</td>
			<td>Loading the syringe</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Povidone-iodine</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>50-118-0481</td>
			<td>Skin disinfection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scalpel Handle - #4</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>10004-13</td>
			<td>Scalpel blade holder</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sure-Seal Induction Chamber</td>
			<td>Braintree Scientific</td>
			<td>EZ-17</td>
			<td>Anesthesia box</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical Blade Miltex Carbon Steel No. 11 Sterile Disposable Individually Wrapped</td>
			<td>McKesson</td>
			<td>4-111</td>
			<td>#11 Scalpel blade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SYSTANE NIGHTTIME Eye Ointment</td>
			<td>Alcon</td>
			<td></td>
			<td>Eye ointment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan Blue</td>
			<td>VWR</td>
			<td>97063-702</td>
			<td>Injection</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

intrathecal vector delivery in juvenile rats via lumbar cistern injection

遺伝子治療は、機能遺伝子の導入、毒性遺伝子の不活性化、または製品の疾患生物学を調節できる遺伝子の提供など、疾患の治療のために患者に新しい遺伝子を送達するための強力な技術です。治療用ベクターの送達方法は、全身送達のための静脈内注入から標的組織への直接注入まで、さまざまな形態をとることができます。神経変性疾患の場合、形質導入を脳や脊髄に偏らせることが望ましいことがよくあります。中枢神経系全体を標的とする最も侵襲性の低いアプローチには、脳脊髄液(CSF)への注射が含まれ、治療薬が中枢神経系の大部分に到達することを可能にします。CSFにベクターを送達する最も安全なアプローチは、針を脊髄の腰椎槽に導入する腰椎髄腔内注射です。この技術は、腰椎穿刺とも呼ばれ、新生児や成体のげっ歯類、および大型動物モデルで広く使用されています。この手法は種や発生段階によって似ていますが、髄腔内空間を取り巻く組織のサイズ、構造、弾力性の微妙な違いにより、アプローチには適応が必要です。この記事では、アデノ随伴血清型9ベクターを送達するために、幼若ラットに腰椎穿刺を行う方法について説明します。ここでは、25〜35μLのベクターを腰椎槽に注入し、緑色蛍光タンパク質(GFP)レポーターを使用して、各注入から生じる形質導入プロファイルを評価しました。このアプローチの利点と課題について説明します。

The promise of viral-mediated gene therapies has finally been realized in recent years with the FDA approval of treatments for spinal muscular atrophy, retinal dystrophy, factor IX hemophilia, cancer, and more1,2,3,4. Countless other therapeutics are currently in development. Gene therapy aims to deliver a therapeutic gene to a patient&#39;s cells. The products of this new gene can replace the missing activity from a deficient endogenous gene, inhibit a toxic gene, kill cancerous cells, or provide some other beneficial function.
For diseases affecting the central nervous system (CNS), delivering the gene therapy vector directly to the target tissue is often desirable. Non-systemic approaches provide two benefits: they minimize off-target side effects that may be caused by peripheral transduction, and they greatly reduce the amount of vector needed to achieve adequate levels of transduction in the target tissue5.
There are a variety of approaches to delivering gene therapy vectors to the CNS. Intraparenchymal injection, the injection of a vector directly into the spinal cord or brain tissue, can be used for delivery to a defined region. However, for many diseases, broad transduction of the CNS is desired. This can be accomplished by delivering a vector to the cerebrospinal fluid (CSF)5, the fluid that flows in and around the brain and spinal cord. There are three primary ways to deliver vectors to the CSF. The most invasive approach is intracerebroventricular delivery, which involves drilling a burr hole through the skull and advancing a needle through the brain into the lateral ventricles. This yields transduction throughout the brain. However, the procedure may cause intracranial hemorrhage, and the approach generally produces only limited transduction of the spinal cord6. Injection into the cisterna magna at the base of the skull is less invasive, but carries the risk of damage to the brainstem. While often used in animal research5, injection into the cisterna magna is no longer used routinely in the clinic7. Lumbar puncture is the least invasive approach to access the CSF. This involves placing a needle between two lumbar vertebrae and into the lumbar cistern.
Lumbar puncture for vector delivery is routinely performed in adult rats and mice and in neonatal mice8,9. The authors of this study recently performed lumbar punctures in juvenile rats (28-30 days of age) to deliver adeno-associated virus serotype 9 (AAV9) vectors. In adult rats, a neonatal lumbar puncture needle was placed vertically between the L3 and L4 vertebrae9. Proper placement results in a tail flick and CSF flowing up into the needle reservoir. In juvenile rats, though, neither of these read-outs could be achieved. The authors then attempted to adapt an adult mouse procedure using a 27 G insulin syringe inserted at an angle between L5 and L610. In adult mice, which are typically smaller than P28 rats, this does not produce a tail flick, but incorrect needle placement is evident by the backflow of the injectate. In juvenile rats, however, this approach uniformly led to the injectate being delivered epidurally, likely resulting from different elasticity between adult mice and juvenile rats of the tissue layers surrounding the spinal cord. Catheter approaches were evaluated next. Specifically, a catheter was introduced through an incision in the dura of the lumbar cistern and up to the mid-thoracic spinal cord; however, this approach led to substantial reflux of the injectate back out of the incision site during delivery. Attempts to place the catheter into the intrathecal space percutaneously using a guide needle were also unsuccessful. Due to the narrowness of the interlaminar width, the catheter would likely hit the rostral lamina and fail to advance.
Here, a method is described to achieve successful and reproducible solution delivery via a lumbar puncture in the juvenile rat. This approach can be used for viral vectors, and likely also for cells, pharmaceuticals, and other therapeutics.

Author Spotlight: Assessing Intrathecal Gene Therapy Efficacy in Juvenile Rats

腰椎貯水槽注射による幼若ラットの髄腔内ベクター送達

注射技術の精度を決定するために、染料であるトリパンブルーを治療薬の代用として使用した。この色素はタンパク質に容易に結合するため、通常、注入された構造内に留まります。これは、色素が治療薬の注射後の分布を正確に予測できない可能性があることを意味します。これは、単に注入の精度を明らかにするために使用されます。腰椎槽にうまく導入されると、トリパンブルーは硬?...

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幼若ラットの腰椎槽に注射を行うための外科的処置が記載されている。このアプローチは、遺伝子治療ベクターの髄腔内送達に使用されてきましたが、このアプローチは、細胞や薬物を含むさまざまな治療に使用できることが期待されています。

Gene therapy is a powerful technology to deliver new genes to a patient for the treatment of disease, be it to introduce a functional gene, inactivate a ...

私たちの研究は、中枢神経系に影響を与える疾患に対する遺伝子治療の開発に焦点を当てています。2023年12月現在、FDAは、脊髄性筋萎縮症、レーバー先天性黒内障、デュシェンヌ型筋ジストロフィー、血友病AおよびBなど、いくつかの遺伝子ストアに対してAAVベースの遺伝子治療を承認しています。遺伝性疾患に対する安全で効果的な介入を考案するには、患者を対象とした慎重な自然史研究から組織培養や動物モデルの前臨床研究まで、さまざまなアプローチを活用する必要がありますが、遺伝子治療は実際にはこの目的に使用されるいくつかの技術の1つにすぎません。多くの遺伝子治療実験では、新生児または成体動物を使用します。若年期の治療を評価する人はほとんどいませんが、これは遺伝性疾患の患者集団です。そのため、年長の子供にとって、体の大きさと免疫系は、遺伝子治療の静脈内投与に大きな障壁をもたらします。髄腔内送達はこれを克服できるかもしれませんが、この仮説を検証するには適切なモデルが必要です。私たちが開発したこの手順により、このアプローチの有効性を幼若ラットで評価することができます。