Name: Author Spotlight: Investigating the Pathophysiology of Eosinophilic Esophagitis
Uploaded: 2024-05-10T14:20:00
Description: Read this Scientific Article Protocol about Author Spotlight: Investigating the Pathophysiology of Eosinophilic Esophagitis at JoVE.com

SNSF-bevilgningen 310030_219210 til J.H.N. støttet publiseringen av dette manuskriptet uten begrensninger. Figur 1 er laget ved hjelp av BioRender.com.

Prosedyrene ble godkjent av etikkkomiteen i Nordvest- og Sentral-Sveits (EKNZ; Prosjekt-ID 2019-00273). Alle pasientene ga skriftlig informert samtykke til eksperimentell bruk av biopsier før endoskopisk undersøkelse. Reagensene og utstyret som ble brukt i studien er oppført i materialtabellen.
1. Celleisolering for pasientavledede esophageal organoider
MERK: En liste over mediebestanddelene for dyrking av humane esophageal organoi...

Human Esophageal Organoids and Air-Liquid Interface Culture Protocols

De medfølgende prosedyrene tillater dyrking av pasientavledede organoider og ALI-kulturer med store utsikter til suksess. Organoidprotokollen er tilpasset fra den første publiserte protokollen som rapporterte genereringen av humane esophageal organoider26 og fra en nylig publisert protokoll32. Sherill og kolleger har beskrevet ALI-modellen22. Organoider og ALI-kulturmodeller hjelper hverandre med å studere virkningen av cytokiner og andre mediator...

Esophageal betennelse kompromitterer epitelbarrierens integritet 1,2,3,4,5, som observert ved eosinofil øsofagitt (EoE), en Th2-dominert kronisk inflammatorisk sykdom i spiserøret 6. EoE ble først beskrevet på 1990-tallet 7,8 og er hovedsakelig indusert av matantigener 9,10,11,12,13. De hyppigst forekommende symptomene på EoE i den voksne befolkningen er dysfagi og matpåvirkning14. Hos barn manifesterer EoE seg vanligvis med manglende trivsel, matvegring, oppkast og magesmerter15. Genomomfattende assosiasjonsstudier (GWAS) har identifisert EoE-risikogener involvert i epitelbarriereintegritet, og flyttet epitelet inn i fokus for EoE-forskning 16,17,18. EoE-transkriptomikk avslørte videre at en nedsatt differensieringsprosess og en reaktiv basalsonehyperplasi forårsaker den kompromitterte barrierefunksjonen til spiserørsepitelet 3,5,19,20,21,22. Den tidlige forståelsen av at EoE er en Th2-mediert sykdom6 førte til oppdagelsen av IL-13 som en drivende mediator ved å forstyrre epitelintegriteten 3,4,21,23. Eksperimentelle systemer som tillater disseksjon av cytokinmedierte effekter på epitelintegritet fra iboende barrieresvikt gjennom genetisk disposisjon gir muligheten til å studere det komplekse samspillet mellom immunceller og epitelet i EoE. Humane esophageal organoider og luft-væske grensesnitt (ALI) kulturer har blitt foreslått som verdifulle verktøy for å analysere konsekvensen av cytokinstimulering på epitelintegritet5.
Den første protokollen for generering av voksne vevsspesifikke stamceller (ASC)-avledede esophageal organoider ble etablert fem år etter de første publiserte rapportene om tarmorganoider i 2009 ved bruk av intestinale Lgr5+ ASC-er som rekapitulerer epitelrommet i tynntarmen24. DeWard et al. var banebrytende for å generere organoider fra murine esophageal epitelceller25. I 2018, Kasagi et al. genererte humane esophageal organoider fra den udødeliggjorte humane esophageal plateepitelcellelinjen EPC2-hTERT og primære pasientavledede celler26. Samme år, Zhang et al. genererte vellykket induserte pluripotente stamceller (iPSC)-avledede esophageal organoider. De avgrenset betydningen av TGFβ og beinmorfogenetiske proteinhemminger (BMP) for utvikling av esophageal progenitorcelle (EPC) og den avgjørende rollen til Notch-signalering i differensieringen av det lagdelte plateepitelet26,27. Trisno og kolleger utfylte disse funnene ved å identifisere Sox2 som en Wnt-hemmer som styrer utviklingsskjebnen mot esophageal differensiering28. De påfølgende forbedringene av protokoller, mediumsammensetning og kulturforhold økte organoiddannelseshastigheten og gjorde subkulturering og gjenvinning av organoider etter kryokonservering mulig 26,29,30,31,32. Selv om disse organoidene er kraftige verktøy for å studere vevsarkitektur og ekspresjon av potensielle målgener etter stimulering med cytokiner, vil ikke spiserørsorganoider tilby muligheten til å måle transepitelresistens (TEER) eller makromolekylfluks som direkte mål for barriereintegritet. Som tidligere beskrevet av Sherrill og kolleger22, tillater ALI-kulturer som modellerer epiteldifferensiering4 direkte vurderinger av epitelintegritet. Å kombinere pasientavledede organoider og ALI-kulturer er et kraftig verktøy for å undersøke vevsarkitektur og epitelbarriereintegritet i EoE.
Her er prosedyrer med instruksjoner for å isolere levedyktige celler fra esophageal biopsier og etablere esophageal organoid og ALI-kulturer som videre kan brukes til å studere effekten av cytokiner på barriereintegritet.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1250 &#181;L Griptip - Filter</td>
			<td>Integra</td>
			<td>4445</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>300 &#181;L Griptip - Filter</td>
			<td>Integra</td>
			<td>4435</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>70 &#181;M cell strainer</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>83.3945.070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ascorbic Acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich (Merck)</td>
			<td>A4544</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine pituitary extract</td>
			<td>Gibco (Thermo Fischer Scientific)</td>
			<td>3700015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich (Merck)</td>
			<td>21115</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Culture Multiwell Plates CELLSTAR for suspension cultures</td>
			<td>Greiner Bio-One</td>
			<td>7.657 185</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cultrex Basement Membrane Extract (BME), Type 2, Pathclear</td>
			<td>R&#38;D Systems (Bio-Techne)</td>
			<td>3532-010-02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl sulfoxide (DMSO), >99,5% BioScience Grade</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>A994</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dispase I</td>
			<td>Corning</td>
			<td>354235</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dispase II</td>
			<td>Sigma-Aldrich (Merck)</td>
			<td>D4693</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbeccos Phosphate Buffered Saline&#160; (DPBS)</td>
			<td>Sigma-Aldrich (Merck)</td>
			<td>D8537</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EVE Automated Cell Counter</td>
			<td>NanoEntek</td>
			<td>EVE-MC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EVE Cell counting slide</td>
			<td>NanoEntek</td>
			<td>EVS-050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon 5 mL Round Bottom Polystyrene Test Tube, with Cell Strainer Snap Cap</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>352235</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescin isothiocyanate (FITC)-dextran</td>
			<td>Sigma-Aldrich (Merck)</td>
			<td>FD4</td>
			<td>average mol wt 3000-5000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heraeus - Megafuge&#160; 40R&#160;</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>75004518</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human recombinant epidermal growth factor</td>
			<td>Gibco (Thermo Fischer Scientific)</td>
			<td>3700015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Keratinocyte-SFM</td>
			<td>Gibco (Thermo Fischer Scientific)</td>
			<td>17005042</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>Gibco (Thermo Fischer Scientific)</td>
			<td>15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Human KGF/FGF-7 Protein</td>
			<td>R&amp;D Systems (Bio-Techne)</td>
			<td>251-KG-010/CF</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Screw cap tube, 15 mL</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>62.554.502</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Single Channel EVOLVE 100-1000 &#181;L&#160;</td>
			<td>Integra</td>
			<td>3018</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Single Channel EVOLVE 20-200 &#181;L&#160;</td>
			<td>Integra</td>
			<td>3016</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe 1 mL</td>
			<td></td>
			<td>1134950</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ThermoMixer C</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5382000015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin inhibitor from Glycine max (soybean)</td>
			<td>Sigma-Aldrich (Merck)</td>
			<td>T9128</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA</td>
			<td>SAFC Biosciences (Merck)</td>
			<td>59418C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Y27632 dihydrochloride</td>
			<td>Tocris (Bio-Techne)</td>
			<td>1254</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

three-dimensional cell culture models to investigate the epithelial barrier in eosinophilic esophagitis

Plateepitelet i spiserøret er direkte utsatt for miljøet, og står kontinuerlig overfor fremmede antigener, inkludert matantigener og mikrober. Å opprettholde integriteten til epitelbarrieren er avgjørende for å forhindre infeksjoner og unngå betennelse forårsaket av ufarlige matavledede antigener. Denne artikkelen gir forenklede protokoller for generering av humane spiserørsorganoider og luft-væske-grensesnittkulturer fra pasientbiopsier for å studere epitelrommet i spiserøret i sammenheng med vevshomeostase og sykdom. Disse protokollene har vært betydelige vitenskapelige milepæler det siste tiåret, og beskriver tredimensjonale organlignende strukturer fra pasientavledede primærceller, organoider og luft-væske-grensesnittkulturer. De gir muligheten til å undersøke funksjonen til spesifikke cytokiner, vekstfaktorer og signalveier i spiserørsepitelet innenfor et tredimensjonalt rammeverk samtidig som de fenotypiske og genetiske egenskapene til giveren opprettholdes. Organoider gir informasjon om vevsmikroarkitektur ved å vurdere transkriptomet og proteomet etter cytokinstimulering. I motsetning til dette tillater luft-væske-grensesnittkulturer vurdering av epitelbarrierens integritet gjennom transepitelmotstand (TEER) eller makromolekylfluksmålinger. Å kombinere disse organoidene og luft-væske-grensesnittkulturene er et kraftig verktøy for å fremme forskning på svekkede esophageal epitelbarrieretilstander.

Esophageal inflammation compromises the epithelial barrier integrity1,2,3,4,5, as observed in eosinophilic esophagitis (EoE), a Th2-dominated chronic inflammatory disease of the esophagus6. EoE was first described in the 1990s7,8 and is predominantly induced by food antigens9,10,11,12,13. The most frequently occurring symptoms of EoE in the adult population are dysphagia and food impaction14. In children, EoE typically manifests with failure to thrive, food refusal, vomiting, and abdominal pain15. Genome-wide association studies (GWAS) have identified EoE risk genes involved in epithelial barrier integrity, moving the epithelium into the focus of EoE research16,17,18. EoE transcriptomics further revealed that an impaired differentiation process and a reactive basal zone hyperplasia cause the compromised barrier function of the esophageal epithelium3,5,19,20,21,22. The early understanding of EoE being a Th2-mediated disease6 led to the discovery of IL-13 as a driving mediator by disturbing epithelial integrity3,4,21,23. Experimental systems allowing the dissection of cytokine-mediated effects on epithelial integrity from intrinsic barrier impairment through genetic predisposition provide the possibility to study the complex interplay between immune cells and the epithelium in EoE. Human esophageal organoids and air-liquid interface (ALI) cultures have been proposed as valuable tools to analyze the consequence of cytokine stimulation on epithelial integrity5.
The first protocol for generating adult tissue-specific stem cell (ASC)-derived esophageal organoids was established five years after the first published reports of intestinal organoids in 2009 using intestinal Lgr5+ ASCs recapitulating the epithelial compartment of the small intestine24. DeWard et al. pioneered generating organoids from murine esophageal epithelial cells25. In 2018, Kasagi et al. generated human esophageal organoids from the immortalized human esophageal squamous epithelium cell line EPC2-hTERT and primary patient-derived cells26. In the same year, Zhang et al. successfully generated induced pluripotent stem cell (iPSC)-derived esophageal organoids. They delineated the significance of TGF&#946; and bone morphogenetic protein (BMP) inhibition for esophageal progenitor cell (EPC) development and the crucial role of Notch signaling in the differentiation of the stratified squamous epithelium26,27. Trisno and colleagues complemented these findings by identifying Sox2 as a Wnt inhibitor that directs the developmental fate towards esophageal differentiation28. The subsequent refinements of protocols, medium composition, and culture conditions increased the organoid formation rate and made subculturing and recovering organoids after cryopreservation possible26,29,30,31,32. Although these organoids are powerful tools for studying tissue architecture and expression of potential target genes after stimulation with cytokines, esophageal organoids will not offer the possibility to measure transepithelial resistance (TEER) or macromolecule flux as direct measures for barrier integrity. As previously described by Sherrill and colleagues22, ALI cultures modeling epithelial differentiation4&#160;allow direct assessments of epithelial integrity. Combining patient-derived organoids and ALI cultures is a powerful tool for investigating tissue architecture and epithelial barrier integrity in EoE.
Here are procedures with instructions for isolating viable cells from esophageal biopsies and establishing esophageal organoid and ALI cultures that can further be used to study the effects of cytokines on barrier integrity.

Author Spotlight: Investigating the Pathophysiology of Eosinophilic Esophagitis

Tredimensjonale cellekulturmodeller for å undersøke epitelbarrieren ved eosinofil øsofagitt 

Esophageal organoids vil vokse fra primære celler ekstrahert fra pasientbiopsier i henhold til instruksjonene i den medfølgende protokollen, som dokumentert med et omvendt brightfield-mikroskop (figur 1). Epiteliale ASC-er begynner å danne celleklynger på en selvorganiserende måte i løpet av de to første dagene av kulturen etter såing av de isolerte cellene i basalmembranekstraktet, og fungerer som et stillas. Størrelsen og antallet celleklynger, merkbart med et omvendt lysfeltmikro...

Read this Scientific Article Protocol about Author Spotlight: Investigating the Pathophysiology of Eosinophilic Esophagitis at JoVE.com

Her er det gitt en protokoll for kultur av humane esophageal organoider og luft-væske-grensesnittkultur. Esophageal organoiders luft-væske-grensesnittkultur kan brukes til å studere virkningen av cytokiner på esophageal epitelbarrieren.

The squamous epithelium of the esophagus is directly exposed to the environment, continuously facing foreign antigens, including food antigens and ...

Vi undersøker patofysiologien til eosinofil øsofagitt og prøver å nøste opp den inflammatoriske kaskaden som induserer og fremmer den kroniske inflammatoriske prosessen med EOE. Identifiseringen av nye immunmediatorer som bidrar til sykdomspatogenesen sentrert rundt svekkelse av epitelbarriere og godkjenning av terapeutiske antistoffer mot nevnte immunmediatorer. Vi har identifisert IL-20-underfamiliens cytokiner som inflammatoriske mediatorer som svekker epiteldifferensiering og keratinisering, noe som resulterer i svekkelse av epitelbarrieren via MAP-kinasebanen.