1.3K Views
•
10:52 min
•
March 22nd, 2024
DOI :
March 22nd, 2024
•0:03
Introduction
1:16
Passaging iPSCs
3:32
Embryoid Body Induction
6:10
Hematopoietic Differentiation
8:31
M-CSF Maturation and Osteoclast Differentiation
9:25
Representative Results
10:19
Conclusion
Transcript
Osteoklaster er en multinucleated celletype, der almindeligvis anvendes af forskere inden for områder som knoglesygdomsforskning, kræftforskning, vævsteknik og endoprosteseforskning. Ikke desto mindre kan osteoklastdifferentiering være udfordrende, da fusion af forstadier er nødvendig. Derudover kræver differentiering af humane osteoklaster fra IPSC'er anvendelse af en række biologiske faktorer på det rigtige tidspunkt.
Når det kommer til humane primære celler. CD34 + mononukleære celler i perifert blod er i øjeblikket den mest anvendte celletype til differentiering i osteoklaster. Denne tilgang er imidlertid begrænset af heterogeniteten inden for CD34+-populationen og deres begrænsede udvidelsesmuligheder.
Humane IPSC'er udgør en alternativ kilde til osteoklaster. Da de kan formeres på ubestemt tid, giver de mulighed for udvidelse og opskalering af osteoklastproduktion. Dette giver mulighed for differentiering af et stort antal osteoklaster, hvilket letter osteoklastforskning.
Her demonstrerer vores postdoc Alexander Blumke og ph.d.-studerende Jessica Simon differentieringen af osteoklaster fra humane IPSC'er, der passerer IPSC'er. Begynd at passere IPSC'er ved at fjerne differentierede regioner eller regioner med mange døde IPSC-aggregater under stereomikroskopet ved hjælp af en P-10- eller P-20-pipettespids eller en celleskraber. Differentierede områder vises tættere og hvidere i farven.
Vask løsne de løsrevne celler med gammelt medium, vask derefter eventuelle resterende løsrevne celler væk med PBS to gange. Derefter tilsættes en milliliter fem enheder pr. milliliter dispase pr. Brønd til brønden. Kanterne af kolonierne, der løfter sig fra skålen, kan observeres under stereomikroskopet efter tre til fem minutter.
Fjern forsigtigt dispasen og tilsæt en milliliter DMEM / F-12 med 15 millimolær HEPES. Brug et stamcelleoverførselsværktøj eller en engangscelleløfter til at skære aggregaterne i lille størrelse. Overfør mediet med aggregater til et 15 ml konisk rør ved hjælp af en fem ml serologisk pipette eller en P-1000 med bred borespids.
Skyl brønden med DMEM / F-12 og overfør medier til 15 ml røret. De skiveskårne IPSC-aggregater centrifugeres ved 200 G i tre minutter. Supernatanten fjernes med en Pasteur-glaspipette, og der tilsættes to ml humant IPSC-serumfrit substrat for at løsne og resuspendere IPSC'erne ved hjælp af en serologisk pipette på fem ml eller P-1000 med spidser med bred boring.
Opsug det resterende basalmembranekstrakt fra de forbelagte brøndplader, og tilsæt en milliliter humant IPSC-serumfrit medium til hver brønd i seksbrøndpladen. Overfør IPSC'er til nye brønde i en seks-brøndplade, så det endelige volumen er to milliliter humant IPSC-serumfrit medium pr. Brønd ved hjælp af en P-1000 med spidser med bred boring. Afhængigt af IPSC-linjen skal splitforhold optimeres.
Her blev der brugt et 1:6 splitforhold. Brøndpladen hvirvles rundt for at fordele cellerne jævnt over pladen, efter at aggregaterne er overført. Embryoid kropsinduktion.
Opsug det gamle medium fra IPSC-kulturerne og skyl brøndene med DPBS. Tilsæt en halv milliliter forvarmet til stuetemperatur i hver brønd i en seks-brøndplade og hvirvl kulturbeholderen for at belægge hele brøndoverfladen. Inkuber kulturbeholderen ved 37 grader C i fem til otte minutter.
Fjern beholderen fra inkubatoren, aspirer opløsningen, og tilsæt trin et medium til brønde bestående af 50 nanogram pr. milliliter humant knoglemorfogent protein 4, 50 nanogram pr. milliliter human vaskulær endotelvækstfaktor 165, 20 nanogram pr. milliliter human stamcellefaktor og 10 mikromolær ROCK-hæmmer Y-27632. Fjern forsigtigt celler ved at skylle brønden med trin et medium. Træk celler ind i et konisk rør.
Tilføj nyt trin et medium til brønde og løsn eventuelle resterende celler ved hjælp af en celleskraber. Efter overførsel af alle celler til røret centrifugeres ved 200 G i fem minutter ved stuetemperatur for at pelletere cellerne. Aspirer og resuspender cellerne i alt to milliliter præ-ekvilibreret trin et medium.
Tæl celler ved hjælp af et hæmocytometer eller automatiseret celletællingsenhed Frø 12.500 celler pr. Brønd i en rundbundet ultralow-attachment 96-brøndplade i 100 mikroliter trin et medium. Under mikroskopet vises celler diffust i hele opløsningen. 96-brøndpladerne centrifugeres i tre minutter ved 100 G Efter centrifugering skal cellerne begynde at ligne sfæroider, når de ses under mikroskopet.
Placer pladen i en 37 grader C inkubator. Skift halvdelen af mediet på dag et og dag to med fase et medie. Brug en multikanalpipette til at bortskaffe gammelt medium i en petriskål.
Når du har bortskaffet medier fra 96-brøndspladen, skal du kontrollere, om der er EB'er, som ved et uheld er blevet fjernet. Overfør de utilsigtet fjernede EB'er i petriskålen tilbage ved hjælp af en P-1000 pipette hæmatopoietisk differentiering. Forfyld brønde af en seks-brøndplade med tre ml trin to medium, hvortil to millimolær ultraglutamin, 55-mikromolær beta-mercaptoethanol, 25 nanogram pr. milliliter, human interleukin-3 og 100 nanogram pr. milliliter human makrofagkolonistimulerende faktor tilsættes.
Brug en P-1000 og spids med bred boring til at overføre otte EB'er til hver brønd på seksbrøndspladen. Efter overførsel kontrolleres med øjet under stereomikroskopet, at otte EB'er er i hver brønd. Efter fem til syv dage skal en flydende cellepopulation bestående af hæmatopoietiske celler blive synlig.
Den hæmatopoietiske differentieringsperiode kan varieres, begyndende med syv dage. Differentiering i 10 dage viste en hæmatopoietisk population bestående af store CD45+CD14+og CD11b+subpopulationer. Efter fem dages behandling med trin to medium skal du udføre en mediumændring ved forsigtigt at fjerne det gamle medium og dispensere det i et 50 ml konisk rør.
Tilsæt straks en milliliter nyt trin to medium til brøndene. For at redde eventuelle flydende hæmatopoietiske celler, der allerede kan være til stede, skal du dreje røret ned med det gamle medium ved 300 G i fem minutter. Tilføj nyt trin to medium til røret og resuspender for at løsne celler, der kunne have været overført med det gamle medium.
Tilsæt to milliliter nyt trin to medium med gemte celler i hver brønd, som tidligere var fyldt med en milliliter trin to medium. På dag 10 af hæmatopoietisk differentiering høstes flydende hæmatopoietiske celler ved at samle dem i et 50 ml konisk rør og kan enten fryses tilbage ved hjælp af 10% DMSO, 50% FBS og 40% medium eller straks bruges til yderligere at differentiere celler til osteoklaster. M-CSF modning og osteoklast differentiering.
Frøceller på 200.000 celler pr. Centimeter kvadreret og behandle i tre dage med alfa MEM suppleret med 10% FBS og 50 nanogram pr. Milliliter M-CSF. For at udføre funktionelle assays eller billeddannelse skal du løsne de MCSF-modne celler ved at vaske med en P-1000 med bred borespids. Overfør løsrevne celler med gammelt medium til et rør og drej ned ved 300 G i fem minutter.
Resuspender og opløs cellepellet med frisk alfa MEM suppleret med 10% FBS, 50 nanogram pr. milliliter M-CSF og 80 nanogram pr. milliliter RANK-ligand. Reseed celler ved 200.000 celler per centimeter kvadreret og differentiere i syv til ni dage. Multinucleated osteoklaster vises typisk omkring dag fem til syv.
Repræsentative resultater. Sammensætningen af den genererede hæmatopoietiske cellepopulation kan analyseres under anvendelse af flowcytometri. Her viser hæmatopoietiske celler en stor population af CD45+forløberceller.
Cellepopulationer, der udtrykker monocytmarkørerne CD14 og CD11b, udgør normalt en tredjedel af hele befolkningen sammenlignet med isotypekontroller. Terminalt differentieret IPSC-afledt osteoklast kan ses under mikroskopet som TRAP-positive multinucleated celler. Konfokal mikroskopi viser celler, der pletter for katepsin K.Funktionelle assays såsom knogle- eller mineralabsorptionsassays muliggør yderligere kvantificering af osteoklastaktivitet.
Her er resorptionsgruber synlige efter fjernelse af moden osteoklast med 10% blegemiddel før billeddannelse, mens M-CSF-modne osteoklastprækursorer behandlet uden tilsætning af RANK-ligand ikke viser resorptionsgruber. Konklusion. Denne protokol muliggør robust og pålidelig differentiering af humane osteoklaster og kan give en standardløsning til knoglesygdomme eller sygdomme, der involverer overskydende forkalkning. Vi bruger osteoklaster til yderligere at konstruere dem i vores RANK-celler, der bruger et intracellulært signaldomæne, der kan aktiveres sammen med en kemisk inducer af dimerisering til kontrolleret og osteoprotegerinuafhængig osteoklastaktivering.
Denne protokol præsenterer differentieringen af humane osteoklaster fra inducerede pluripotente stamceller (iPSC'er) og beskriver metoder til karakterisering af osteoklaster og osteoklastprækursorer.
Explore More Videos
ABOUT JoVE
Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved