Name: Author Spotlight: Streamlining Protein Target Prediction and Validation באמצעות Molecular Docking ו-CETSA
Uploaded: 2024-02-23T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Author Spotlight: Streamlining Protein Target Prediction and Validation via Molecular Docking and CETSA at JoVE.com

עבודה זו נתמכה על ידי הקרן הלאומית למדעי הטבע של סין (82004031) ותוכנית המדע והטכנולוגיה של סצ'ואן (2022NSFSC1303). אנו מביעים את הערכתנו הרבה לג'יה-יי סון במכון החדשני לרפואה סינית ורוקחות, אוניברסיטת צ'נגדו לרפואה סינית מסורתית, על הסיוע בכתם המערבי.

1. הורדת המבנים של קסנטטין ו-Keap1
<ol><li>פתח את מסד הנתונים PubChem (https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/), הזן xanthatin (מולקולה קטנה), ולאחר מכן לחץ על חיפוש ולחץ על התוצאה הראשונה. לחץ על הורד ולחץ להציל תחת מבנה דו-ממדי כדי לשמור את המתחם בפורמט .sdf.</li>
	<li>הורד את המבנה הגבי?...

אימות אינטראקציה של Xanthatin-Keap1 עם עגינה ו-CETSA

<ol>
	<li>Soleymani, F., Paquet, E., Viktor, H., Michalowski, W., Spinello, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein-protein+interaction+prediction+with+deep+learning:+A+comprehensive+review.">Protein-protein interaction prediction with deep learning: A comprehensive review.</a> Computat Struct Biotechnol J. 20, 5316-5341 (2022).</li><li>Du, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insights+into+protein-ligand+interactions:+mechanisms,+models,+and+methods.">Insights into protein-ligand interactions: mechanisms, models, and methods.</a> Int J Mol Sci. 17 (2), 144 (2016).</li><li>Wu, Q., Peng, Z., Zhang, Y., Yang, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=COACH-D:+improved+protein-ligand+binding+sites+prediction+with+refined+ligand-binding+poses+through+molecular+docking.">COACH-D: improved protein-ligand binding sites prediction with refined ligand-binding poses through molecular docking.</a> Nucleic Acids Res. 46, W438-W442 (2018).</li><li>Zhang, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PROBselect:+accurate+prediction+of+protein-binding+residues+from+proteins+sequences+via+dynamic+predictor+selection.">PROBselect: accurate prediction of protein-binding residues from proteins sequences via dynamic predictor selection.</a> Bioinfo. 36, i735-i744 (2020).</li><li>Kandel, J., Tayara, H., Chong, K. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PUResNet:+prediction+of+protein-ligand+binding+sites+using+deep+residual+neural+network.">PUResNet: prediction of protein-ligand binding sites using deep residual neural network.</a> J Cheminfo. 13 (1), 65 (2021).</li><li>Dhakal, A., Mckay, C., Tanner, J. J., Cheng, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Artificial+intelligence+in+the+prediction+of+protein-ligand+interactions:+recent+advances+and+future+directions.">Artificial intelligence in the prediction of protein-ligand interactions: recent advances and future directions.</a> Brief Bioinform. 23 (1), 476 (2022).</li><li>Hatty, C. R., Banati, R. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein-ligand+and+membrane-ligand+interactions+in+pharmacology:+the+case+of+the+translocator+protein+(TSPO).">Protein-ligand and membrane-ligand interactions in pharmacology: the case of the translocator protein (TSPO).</a> Pharmacol Res. 100, 58-63 (2015).</li><li>Chaires, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calorimetry+and+thermodynamics+in+drug+design.">Calorimetry and thermodynamics in drug design.</a> Ann Rev Biophys. 37, 135-151 (2008).</li><li>Huang, S. Y., Zou, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advances+and+challenges+in+protein-ligand+docking.">Advances and challenges in protein-ligand docking.</a> Int J Mo Sci. 11 (8), 3016-3034 (2010).</li><li>Li, J., Fu, A., Zhang, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+overview+of+scoring+functions+used+for+protein-ligand+interactions+in+molecular+docking.">An overview of scoring functions used for protein-ligand interactions in molecular docking.</a> Interdiscip Sci. 11 (2), 320-328 (2019).</li><li>Crampon, K., Giorkallos, A., Deldossi, M., Baud, S., Steffenel, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Machine-learning+methods+for+ligand-protein+molecular+docking.">Machine-learning methods for ligand-protein molecular docking.</a> Drug Discov Today. 27 (1), 151-164 (2022).</li><li>Pinzi, L., Rastelli, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+docking:+Shifting+paradigms+in+drug+discovery.">Molecular docking: Shifting paradigms in drug discovery.</a> Int J Mol Sci. 20 (18), 4331 (2019).</li><li>Abdolmaleki, A., Ghasemi, F., Ghasemi, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Computer-aided+drug+design+to+explore+cyclodextrin+therapeutics+and+biomedical+applications.">Computer-aided drug design to explore cyclodextrin therapeutics and biomedical applications.</a> Chem Biol Drug Des. 89 (2), 257-268 (2017).</li><li>Chen, G., Seukep, A. J., Guo, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recent+advances+in+molecular+docking+for+the+research+and+discovery+of+potential+marine+drugs.">Recent advances in molecular docking for the research and discovery of potential marine drugs.</a> Mar Drugs. 18 (11), 545 (2020).</li><li>Li, T., Guo, R., Zong, Q., Ling, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Application+of+molecular+docking+in+elaborating+molecular+mechanisms+and+interactions+of+supramolecular+cyclodextrin.">Application of molecular docking in elaborating molecular mechanisms and interactions of supramolecular cyclodextrin.</a> Carbohydr Polym. 276, 118644 (2022).</li><li>Martinez Molina, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monitoring+drug+target+engagement+in+cells+and+tissues+using+the+cellular+thermal+shift+assay.">Monitoring drug target engagement in cells and tissues using the cellular thermal shift assay.</a> Science. 341 (6141), 84-87 (2013).</li><li>Tu, Y., Tan, L., Tao, H., Li, Y., Liu, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CETSA+and+thermal+proteome+profiling+strategies+for+target+identification+and+drug+discovery+of+natural+products.">CETSA and thermal proteome profiling strategies for target identification and drug discovery of natural products.</a> Phytomedicine. 116, 154862 (2023).</li><li>Dai, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Horizontal+cell+biology:+Monitoring+global+changes+of+protein+interaction+states+with+the+proteome-wide+cellular+thermal+shift+assay+(CETSA).">Horizontal cell biology: Monitoring global changes of protein interaction states with the proteome-wide cellular thermal shift assay (CETSA).</a> Annu Rev Biochem. 88, 383-408 (2019).</li><li>Lade, D. M., Nicoletti, R., Mersch, J., Agazie, Y. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Design+and+synthesis+of+improved+active-site+SHP2+inhibitors+with+anti-breast+cancer+cell+effects.">Design and synthesis of improved active-site SHP2 inhibitors with anti-breast cancer cell effects.</a> Eur J Med Chem. 247, 115017 (2023).</li><li>Jiang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+chemical-structure+TPOR+agonist,+TMEA,+promotes+megakaryocytes+differentiation+and+thrombopoiesis+via+mTOR+and+ERK+signalings.">Novel chemical-structure TPOR agonist, TMEA, promotes megakaryocytes differentiation and thrombopoiesis via mTOR and ERK signalings.</a> Phytomedicine. 110, 154637 (2023).</li><li>Mateus, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thermal+proteome+profiling+for+interrogating+protein+interactions.">Thermal proteome profiling for interrogating protein interactions.</a> Mol Syst Biol. 16 (3), 9232 (2020).</li><li>Sanchez, T. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Real-time+cellular+thermal+shift+assay+to+monitor+target+engagement.">Real-time cellular thermal shift assay to monitor target engagement.</a> ACS Chem Biol. 17 (9), 2471-2482 (2022).</li><li>Tolvanen, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Current+advances+in+CETSA.">Current advances in CETSA.</a> Front Mol Biosci. 9, 866764 (2022).</li><li>Liu, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Xanthatin+inhibits+STAT3+and+NF-&#954;B+signalling+by+covalently+binding+to+JAK+and+IKK+kinases.">Xanthatin inhibits STAT3 and NF-&#954;B signalling by covalently binding to JAK and IKK kinases.</a> J Cell Mol Med. 23 (6), 4301-4312 (2019).</li><li>Liu, Y., Chen, W., Zheng, F., Yu, H., Wei, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Xanthatin+alleviates+LPS-Induced+inflammatory+response+in+RAW264.7+macrophages+by+Inhibiting+NF-&#954;B,+MAPK+and+STATs+activation.">Xanthatin alleviates LPS-Induced inflammatory response in RAW264.7 macrophages by Inhibiting NF-&#954;B, MAPK and STATs activation.</a> Molecules. 27 (14), 4603 (2022).</li><li>Dinkova-Kostova, A. T., Kostov, R. V., Canning, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Keap1,+the+cysteine-based+mammalian+intracellular+sensor+for+electrophiles+and+oxidants.">Keap1, the cysteine-based mammalian intracellular sensor for electrophiles and oxidants.</a> Arch Biochem Biophys. 617, 84-93 (2017).</li><li>Tabana, Y., Babu, D., Fahlman, R., Siraki, A. G., Barakat, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Target+identification+of+small+molecules:+An+overview+of+the+current+applications+in+drug+discovery.">Target identification of small molecules: An overview of the current applications in drug discovery.</a> BMC Biotechnol. 23 (1), 44 (2023).</li><li>Schenone, M., Dan&#269;&#237;k, V., Wagner, B. K., Clemons, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Target+identification+and+mechanism+of+action+in+chemical+biology+and+drug+discovery.">Target identification and mechanism of action in chemical biology and drug discovery.</a> Nat Chem Biol. 9 (4), 232-240 (2013).</li><li>Hughes, J. P., Rees, S., Kalindjian, S. B., Philpott, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Principles+of+early+drug+discovery.">Principles of early drug discovery.</a> Br J Pharmacol. 162 (6), 1239-1249 (2011).</li><li>Chakraborty, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SARS-CoV-2+protein+drug+targets+landscape:+A+potential+pharmacological+insight+view+for+the+new+drug+development.">SARS-CoV-2 protein drug targets landscape: A potential pharmacological insight view for the new drug development.</a> Expert Rev Clin Pharmacol. 14 (2), 225-238 (2021).</li><li>Ziegler, S., Pries, V., Hedberg, C., Waldmann, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Target+identification+for+small+bioactive+molecules:+Finding+the+needle+in+the+haystack.">Target identification for small bioactive molecules: Finding the needle in the haystack.</a> Angew Chem Int Ed Engl. 52 (10), 2744-2792 (2013).</li><li>Zhang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highly+effective+identification+of+drug+targets+at+the+proteome+level+by+pH-dependent+protein+precipitation.">Highly effective identification of drug targets at the proteome level by pH-dependent protein precipitation.</a> Chem Sci. 13 (42), 12403-12418 (2022).</li><li>Zhang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simplified+thermal+proteome+profiling+approach+to+screen+protein+targets+of+a+ligand.">A simplified thermal proteome profiling approach to screen protein targets of a ligand.</a> Proteomics. 20, 1900372 (2020).</li><li>Hou, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Salidroside+intensifies+mitochondrial+function+of+CoCl2-damaged+HT22+cells+by+stimulating+PI3K-AKT-MAPK+signaling+pathway.">Salidroside intensifies mitochondrial function of CoCl2-damaged HT22 cells by stimulating PI3K-AKT-MAPK signaling pathway.</a> Phytomedicine. 109, 154568 (2022).</li><li>Wang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Salidroside,+a+phenyl+ethanol+glycoside+from+Rhodiolacrenulata,+orchestrates+hypoxic+mitochondrial+dynamics+homeostasis+by+stimulating+Sirt1/p53/Drp1+signaling.">Salidroside, a phenyl ethanol glycoside from Rhodiolacrenulata, orchestrates hypoxic mitochondrial dynamics homeostasis by stimulating Sirt1/p53/Drp1 signaling.</a> J Ethnopharmacol. 293, 115278 (2022).</li></ol>

זיהוי מטרות המחלה וגילוי ופיתוח תרופות קשורים קשר הדוק27. על ידי מיקוד מדויק במטרות ספציפיות, ניתן לפתח תרופות מועמדות לטיפול יעיל יותר במחלות מסוימות תוך מזעור תופעות הלוואי הקשורות לתרופות28,29. המטרות הנפוצות ביותר הן מטרות חלבון30</su...

חלבונים הם מקרומולקולות חשובות ביותר באורגניזמים חיים ויש להם מגוון רחב של פונקציות ייחודיות בתוך התאים, כגון הרכב הממברנה, היווצרות שלד ציטו-שלד, פעילות אנזימים, תחבורה, איתות תאי, ומעורבות במנגנונים תוך-תאיים וחוץ-תאיים 1,2,3. חלבונים מבטאים את תפקידיהם הביולוגיים בעיקר באמצעות אינטראקציות ספציפיות עם מגוון מולקולות, כולל חלבונים אחרים, חומצות גרעין, ליגנדות של מולקולות קטנות ויוני מתכת 1,4. ליגנדות הן תרכובות מולקולריות קטנות שנקשרות באופן ספציפי לחלבונים באורגניזם. האינטראקציה בין חלבונים לליגנדות מתרחשת באתרים ספציפיים על החלבון, הנקראים אתרי הקשירה, הידועים גם בשם כיסי הקישור5. במחקר כימיה תרופתית, ההתמקדות היא בזיהוי חלבוני מפתח הקשורים בבירור למחלות, המשמשים מטרות לתרופות6. לכן, הבנה מעמיקה של אתרי הקישור בין חלבונים לליגנדות היא בעלת חשיבות עליונה בקידום גילוי, תכנון ומחקר של תרופות 7,8.
עגינה מולקולרית היא כלי חישובי נפוץ לחקר קשירת ליגנד חלבון, המשתמש במבנים תלת-ממדיים של חלבונים וליגנדים כדי לחקור את מצבי הקישור והזיקות העיקריים שלהם בעת יצירת קומפלקסים יציבים 9,10,11. היישום של טכנולוגיית עגינה מולקולרית מקורו בשנות השבעים. בהתבסס על עקרון זיווג המנעול והמפתח ותוך שימוש באלגוריתמים של תוכנות עגינה מולקולריות, ניתן לקבוע את האינטראקציה בין תרכובות ומטרות מולקולריות על ידי ניתוח תוצאות העגינה. גישה זו מאפשרת חיזוי של אתרי קישור פעילים הן עבור התרכובת והן עבור מולקולת המטרה. כתוצאה מכך, הוא מאפשר זיהוי של קונפורמציית קישור אופטימלית (הנקראת כאן מודל הקשירה) עבור אינטראקציות ליגנד-קולטן, שהיא חיונית להבנת המכניקה של התקשרויות מולקולריות אלה 12,13,14,15. בעוד עגינה מולקולרית מספקת תחזיות מבוססות מחשב יקרות ערך של אינטראקציות ליגנד-קולטן, חשוב לציין כי מדובר בממצאים ראשוניים. כתוצאה מכך, אימות ניסיוני נוסף חיוני כדי לאשר אינטראקציות אלה.
בדיקת השינוי התרמי התאי (CETSA), שהוצעה לראשונה על ידי צוות המחקר של פאר נורדלונד בשנת 2013, משמשת כשיטה לאימות אינטראקציות חלבון מטרה לתרופה. טכניקה זו בודקת באופן ספציפי את היציבות התרמית של חלבוני מטרה המושרים על ידי קשירת תרופות, ומספקת גישה מעשית לאישור אינטראקציות מולקולריות 16,17,18. גישה זו מבוססת על העיקרון הבסיסי שקשירת ליגנדים יוצרת שינוי תרמי בתוך חלבוני המטרה וישימה למגוון רחב של דגימות ביולוגיות, כולל ליזטים של תאים, תאים חיים שלמים ורקמות19,20. CETSA תומך במעורבות מטרה ישירה של מולקולות קטנות בתאים שלמים על ידי גילוי ייצוב תרמודינמי של חלבונים עקב קשירת ליגנד וקישור התגובה הפנוטיפית שנצפתה לתרכובת המטרה21,22. בין המתודולוגיות השונות הנגזרות מ- CETSA, Western Blot-CETSA (WB-CETSA) נחשבת לגישה קלאסית. לאחר הכנת הדגימה בשיטת CETSA, נעשה שימוש בניתוח כתמים מערביים כדי לזהות שינויים ביציבות התרמית של חלבון המטרה. זה מאפשר קביעה מדויקת של אינטראקציות תרופה-חלבון בתוך מערכות תאיות17,23.
Xanthatin הוא תרכובת ביו-אקטיבית מבודדת מן הצמח Xanthium L. עם תכונות כגון אנטי דלקתיות, אשר שימש ברפואה הסינית המסורתית לטיפול במחלות כמו סינוסיטיס האף ודלקת פרקים24,25. חלבון 1 הקשור ל-ECH דמוי קלך (Keap1) הוא מרכיב של קומפלקס חלבונים רב-יחידות מבוסס Cullin-RING E3 Ubiquitin ligase Multi-subunit ומווסת חשוב של הומאוסטזיס חיזור תוך-תאי, המשפיע על עוצמת ומשך התגובה הדלקתית על ידי ויסות מצב חמצון-חיזור תוך-תאי26. במחקר זה השתמשנו לראשונה בעגינה מולקולרית כדי לחקור את האינטראקציה בין קסנטטין (מולקולה קטנה) וחלבון Keap1, במטרה לחזות את מצב הקישור שלהם. לאחר מכן, השתמשנו בשיטת CETSA כדי לאמת אינטראקציה זו על ידי הערכת ההשפעה של קסנטטין על היציבות התרמית של חלבון Keap1.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.45 &#956;m Polyvinylidene fluoride membrane</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>PR05509</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anhydrous ethanol</td>
			<td>Chron chemicals</td>
			<td>64-17-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin</td>
			<td>BioFroxx</td>
			<td>4240GR100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Broad-spectrum protease inhibitor mixtures</td>
			<td>Boster Biological Technology Co., Ltd</td>
			<td>AR1193</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO</td>
			<td>Boster Biological Technology Co., Ltd</td>
			<td>PYG0040</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Enhanced chemiluminescence reagent</td>
			<td>Beyotime Biotechnology Co., Ltd</td>
			<td>P0018S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GAPDH antibody</td>
			<td>ProteinTech Group Co., Ltd</td>
			<td>10494-1-AP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gel Imaging Instrument</td>
			<td>E-BLOT</td>
			<td>Touch Imager Pro</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gradient PCR instrument</td>
			<td>Biometra TADVANCED</td>
			<td>Biometra Tadvanced 96SG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High-speed freezing centrifuge</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>Allegra X-30R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Horseradish peroxidase-conjugated affiniPure goat antibody</td>
			<td>ProteinTech Group Co., Ltd</td>
			<td>SA00001-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropyl alcohol&#160;</td>
			<td>Chron chemicals</td>
			<td>67-63-0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Keap1 antibody</td>
			<td>Zen BioScience Co., Ltd</td>
			<td>R26935</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Metal bath</td>
			<td>Analytik Jena</td>
			<td>TSC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>Chron chemicals</td>
			<td>67-56-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ncmblot rapid transfer buffer (20&#215;)</td>
			<td>NCM Biotech Co., Ltd</td>
			<td>WB4600</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Omni-Easy OneStep PAGE gel fast preparation kie</td>
			<td>Epizyme Biotech Co., Ltd</td>
			<td>PG212</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffer saline</td>
			<td>Boster Biological Technology Co., Ltd</td>
			<td>PYG0021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Prestained Color Protein Marker</td>
			<td>Biosharp&#160;</td>
			<td>BL741A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protein Blotting Electrophoresis System</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>MiniPROTEAN&#210;Tetra Cell</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RAW264.7 cell</td>
			<td>Beyotime Biotechnology Co., Ltd</td>
			<td>C7505</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RAW264.7 cell-specific medium</td>
			<td>Procell Life Science&#38;Technology Co., Ltd</td>
			<td>CM-0597</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SDS-PAGE protein loading buffer</td>
			<td>Boster Biological Technology Co., Ltd</td>
			<td>AR1112-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SDS-PAGE running buffer powder</td>
			<td>Servicebio</td>
			<td>G2018</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris buffered saline powder</td>
			<td>Servicebio</td>
			<td>G0001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween 20</td>
			<td>BioFroxx</td>
			<td>1247ML100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water bath</td>
			<td>Memmert</td>
			<td>WNE10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water purifier</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>Milli- IQ 7005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xanthatin</td>
			<td>ChemConst Biotechnology Co., Ltd</td>
			<td>CONST210706</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

protein target prediction and validation of small molecule compound

חלבונים הם בסיסיים לפיזיולוגיה האנושית, כאשר המטרות שלהם הן קריטיות במחקר ופיתוח תרופות. זיהוי ותיקוף של מטרות חלבון חיוניות הפכו לחלק בלתי נפרד מפיתוח תרופות. עגינה מולקולרית היא כלי חישובי הנמצא בשימוש נרחב כדי לחקור קשירת ליגנד חלבון, במיוחד בהקשר של אינטראקציות מטרה בין תרופות וחלבונים. לצורך אימות ניסיוני של הקשירה וכדי לגשת ישירות לקשירת התרופה ומטרתה, נעשה שימוש בשיטת בדיקת השינוי התרמי התאי (CETSA). מחקר זה נועד לשלב עגינה מולקולרית עם CETSA כדי לחזות ולאמת אינטראקציות בין תרופות ומטרות חלבון חיוניות. באופן ספציפי, חזינו את האינטראקציה בין קסנטטין לחלבון Keap1, כמו גם את מצב הקישור שלו באמצעות ניתוח עגינה מולקולרית, ולאחר מכן אימות של האינטראקציה באמצעות בדיקת CETSA. התוצאות שלנו הראו כי קסנטטין יכול ליצור קשרי מימן עם שאריות חומצות אמינו ספציפיות של חלבון Keap1 ולהפחית את היציבות התרמית של חלבון Keap1, מה שמצביע על כך שקסנטטין יכול לקיים אינטראקציה ישירה עם חלבון Keap1.

Proteins are highly important macromolecules in living organisms and possess a diverse range of unique functions within cells, such as membrane composition, cytoskeleton formation, enzyme activity, transportation, cell signaling, and involvement in both intracellular and extracellular mechanisms1,2,3. Proteins manifest their biological functions primarily through specific interactions with a variety of molecules, including other proteins, nucleic acids, small molecule ligands, and metal ions1,4. Ligands are small molecular compounds that specifically bind to proteins in an organism. The interaction between proteins and ligands occurs at specific sites on the protein, called the binding sites, also known as the binding pockets5. In medicinal chemistry research, the focus lies in identifying key proteins that are clearly associated with diseases, which serve as targets for drugs6. Therefore, gaining a deep understanding of the binding sites between proteins and ligands is of utmost importance in promoting drug discovery, design, and research7,8.
Molecular docking is a widely used computational tool for studying protein-ligand binding, which employs the three-dimensional structures of proteins and ligands to explore their primary binding modes and affinities when forming stable complexes9,10,11. The application of molecular docking technology originated in the 1970s. Based on the lock and key pairing principle and utilizing the algorithms of molecular docking software, one can determine the interaction between compounds and molecular targets by analyzing docking results. This approach enables the prediction of active binding sites for both the compound and the target molecule. Consequently, it facilitates the identification of an optimal binding conformation (here called the binding model) for ligand-receptor interactions, which is crucial for understanding the mechanics of these molecular engagements12,13,14,15. While molecular docking provides valuable computer-based predictions of ligand-receptor interactions, it is important to note that these are preliminary findings. Consequently, further experimental verification is essential to confirm these interactions.
The cellular thermal shift assay (CETSA), initially proposed by P&#228;r Nordlund&#39;s research team in 2013, serves as a method for validating drug-target protein interactions. This technique specifically tests the thermal stability of target proteins induced by drug binding, providing a practical approach for confirming molecular interactions16,17,18. This approach is based on the fundamental principle that ligand binding initiates a thermal shift within target proteins and is applicable to a wide array of biological samples, including cell lysates, intact living cells, and tissues19,20. CETSA supports direct target engagement of small molecules in intact cells by detecting thermodynamic stabilization of proteins due to ligand binding and linking the observed phenotypic response to the target compound21,22. Among the various methodologies derived from CETSA, Western Blot-CETSA (WB-CETSA) is considered a classical approach. Following sample preparation using the CETSA method, western blot analysis is utilized to detect alterations in the thermal stability of the target protein. This allows for the precise determination of drug-protein interactions within cellular systems17,23.
Xanthatin is a bioactive compound isolated from the plant Xanthium L. with properties such as anti-inflammatory, which has been used in traditional Chinese medicine to treat diseases like nasal sinusitis and arthritis24,25. The kelch-like ECH-associated protein 1 (Keap1) is a component of the Cullin3-based Cullin-RING E3 ubiquitin ligase multi-subunit protein complex and an important regulator of intracellular redox homeostasis, which influences the intensity and duration of the inflammatory response by modulating the intracellular redox state26. In this study, we first utilized molecular docking to investigate the interaction between xanthatin (small molecule) and Keap1 protein, aiming to predict their binding mode. Subsequently, we employed the CETSA method to validate this interaction by assessing the impact of xanthatin on the thermal stability of the Keap1 protein.

Author Spotlight: Streamlining Protein Target Prediction and Validation באמצעות Molecular Docking ו-CETSA

חיזוי ואימות מטרות חלבונים של תרכובת מולקולות קטנות

Our research focuses on protein targets, prediction and validation of small molecular compounds. The experiment used here shows a method of molecular docking combined with similar thermal shift assay to predict and validate the interaction between small molecules and protein targets. These steps of CETSA are complicated and any steps errors during the operation can have a great impact on the results.Our protocol combines prediction with verification, effectively reducing both time consumption and economic costs. Furthermore, the experimental instruments and materials are easy to opt in. Finally, the CETSA samples are easy to prepare in test, which ensures the producibility of the samples.

ניתוח עגינה מולקולרית ניבא את האינטראקציה בין קסנטטין לחלבון Keap1. איור 2 מדגים היווצרות קשרי מימן בין שאריות קסנטטין וחומצות אמינו Gly-367 ו-Val-606 של חלבון Keap1, עם אורך קשר מימן של 2.17 Å עבור Gly-367 ו-2.13 Å עבור Val-606. בנוסף, ציון העגינה המחושב של -5.69 קק"ל/מול מסמל זיקה טובה בין קסנטטין לח?...

Watch this Scientific Journal Video about Author Spotlight: Streamlining Protein Target Prediction and Validation via Molecular Docking and CETSA at JoVE.com

הניסוי המשמש כאן מראה שיטה של עגינה מולקולרית בשילוב עם בדיקת שינוי תרמי תאי כדי לחזות ולאמת את האינטראקציה בין מולקולות קטנות למטרות חלבון.

Proteins are fundamental to human physiology, with their targets being crucial in research and drug development. The identification and validation of ...

המחקר שלנו מתמקד במטרות חלבון, חיזוי ותיקוף של תרכובות מולקולריות קטנות. הניסוי המשמש כאן מראה שיטה של עגינה מולקולרית בשילוב עם בדיקת שינוי תרמי דומה כדי לחזות ולאמת את האינטראקציה בין מולקולות קטנות ומטרות חלבון. שלבים אלה של CETSA הם מסובכים וכל שגיאות צעדים במהלך המבצע יכול להיות בעל השפעה רבה על התוצאות.הפרוטוקול שלנו משלב חיזוי עם אימות, ומפחית ביעילות הן את צריכת הזמן והן את העלויות הכלכליות. יתר על כן, קל לבחור את המכשירים והחומרים הניסיוניים. לבסוף, קל להכין את דגימות CETSA בבדיקה, מה שמבטיח את יכולת הייצור של הדגימות.

protein-target-prediction-and-validation-of-small-molecule-compound

Research

JoVE Journal

Medicine

Protein Target Prediction and Validation of Small Molecule Compound

Proteins are fundamental to human physiology, with their targets being crucial in research and drug development. The identification and validation of crucial protein targets have become integral to drug development. Molecular docking is a computational tool widely utilized to investigate protein-ligand binding, especially in the context of drug and protein target interactions. For the experimental verification of the binding and to access the binding of the drug and its target directly, the cellular thermal shift assay (CETSA) method is used. This study aimed to integrate molecular docking with CETSA to predict and validate interactions between drugs and vital protein targets. Specifically, we predicted the interaction between xanthatin and Keap1 protein as well as its binding mode through molecular docking analysis, followed by verification of the interaction using the CETSA assay. Our results demonstrated that xanthatin could establish hydrogen bonds with specific amino acid residues of Keap1 protein and reduce the thermostability of Keap1 protein, indicating that xanthatin could directly interact with Keap1 protein.

The experiment used here shows a method of molecular docking combined with cellular thermal shift assay to predict and validate the interaction between small molecules and protein targets.