Name: Author Spotlight: Developing a Reproducible Method for Isolating Bone Marrow-Derived Macrophages from Neonatal Mice to Advance Early Life Immune Responses
Uploaded: 2024-05-24T14:15:00
Description: Various techniques for isolating bone marrow from adult mice have been well established. However, isolating bone marrow from neonatal mice is challenging ...

Este trabajo fue apoyado por los Institutos Nacionales de Salud [R01 AI163333] para CMR. Reconocemos el apoyo financiero adicional brindado a la Instalación Central de Citometría de Flujo y Célula Única de la Universidad de Virginia Occidental mediante las siguientes subvenciones: WV CTSI grant GM104942, Tumor Microenvironment CoBRE grant GM121322 y NIH grant OD016165.

Todos los procedimientos fueron aprobados por los Comités Institucionales de Cuidado y Uso de Animales de Virginia Occidental y se realizaron siguiendo las recomendaciones de la Guía para el Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio del Consejo Nacional de Investigación. Para este estudio se utilizaron crías de ratón C57BL/6J. Los detalles de todos los reactivos y equipos utilizados se enumeran en la Tabla de Materiales.
1. Preparación de los medios
<ol...

Phagocytic Assay Evaluation of Neonatal Bone Marrow Derived Macrophages 

<ol>
	<li>Lucas, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+organization+of+the+bone+marrow+and+its+role+in+hematopoiesis.">Structural organization of the bone marrow and its role in hematopoiesis.</a> Curr Opin Hematol. 28 (1), 36-42 (2021).</li><li>Deb, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+stem+cells+turn+into+bone+and+fat.">How stem cells turn into bone and fat.</a> N Engl J Med. 380 (23), 2268-2270 (2019).</li><li>Lin, H., Sohn, J., Shen, H., Langhans, M. T., Tuan, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bone+marrow+mesenchymal+stem+cells:+Aging+and+tissue+engineering+applications+to+enhance+bone+healing.">Bone marrow mesenchymal stem cells: Aging and tissue engineering applications to enhance bone healing.</a> Biomaterials. 203, 96-110 (2019).</li><li>Soleimani, M., Nadri, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+protocol+for+isolation+and+culture+of+mesenchymal+stem+cells+from+mouse+bone+marrow.">A protocol for isolation and culture of mesenchymal stem cells from mouse bone marrow.</a> Nat Protoc. 4 (1), 102-106 (2009).</li><li>Kaushansky, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lineage-specific+hematopoietic+growth+factors.">Lineage-specific hematopoietic growth factors.</a> N Engl J Med. 354 (19), 2034-2045 (2006).</li><li>Huang, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+improved+protocol+for+isolation+and+culture+of+mesenchymal+stem+cells+from+mouse+bone+marrow.">An improved protocol for isolation and culture of mesenchymal stem cells from mouse bone marrow.</a> J Orthop Translat. 3 (1), 26-33 (2015).</li><li>Smith, A. M., Davis, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Challenges+and+opportunities+to+enhance+global+drug+development+in+neonates.">Challenges and opportunities to enhance global drug development in neonates.</a> Curr Opin Pediatr. 29 (2), 149-152 (2017).</li><li>Lagler, F. B., Hirschfeld, S., Kindblom, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Challenges+in+clinical+trials+for+children+and+young+people.">Challenges in clinical trials for children and young people.</a> Arch Dis Child. 106 (4), 321-325 (2021).</li><li>Heap, R. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteomics+characterization+of+the+L929+cell+supernatant+and+its+role+in+BMDM+differentiation.">Proteomics characterization of the L929 cell supernatant and its role in BMDM differentiation.</a> Life Sci Alliance. 4 (6), 202000957 (2021).</li><li>Weischenfeldt, J., Bone Porse, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=marrow-derived+macrophages+(BMM):+Isolation+and+Applications.">marrow-derived macrophages (BMM): Isolation and Applications.</a> CSH Protoc. 2008, (2008).</li><li>Goncalves, R., Kaliff Teofilo Murta, G., Aparecidade de Souza, I., Mosser, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+culture+of+bone+marrow-derived+macrophages+from+mice.">Isolation and culture of bone marrow-derived macrophages from mice.</a> J Vis Exp. (196), e64566 (2023).</li><li>Perfetto, S. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Amine+reactive+dyes:+An+effective+tool+to+discriminate+live+and+dead+cells+in+polychromatic+flow+cytometry.">Amine reactive dyes: An effective tool to discriminate live and dead cells in polychromatic flow cytometry.</a> J Immunol Methods. 313 (1-2), 199-208 (2006).</li><li>Springer, T., Galfre, G., Secher, D. S., Milstein, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mac-1:+A+macrophage+differentiation+antigen+identified+by+monoclonal+antibody.">Mac-1: A macrophage differentiation antigen identified by monoclonal antibody.</a> Eur J Immunol. 9 (4), 301-306 (1979).</li><li>Austyn, J. M., Gordon, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=F4/80,+a+monoclonal+antibody+directed+specifically+against+the+mouse+macrophage.">F4/80, a monoclonal antibody directed specifically against the mouse macrophage.</a> Eur J Immunol. 11 (10), 805-815 (1981).</li><li>Akbarshahi, H., Menzel, M., Posaric Bauden, M., Rosendahl, A., Andersson, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enrichment+of+murine+CD68++CCR2++and+CD68++CD206++lung+macrophages+in+acute+pancreatitis-associated+acute+lung+injury.">Enrichment of murine CD68+ CCR2+ and CD68+ CD206+ lung macrophages in acute pancreatitis-associated acute lung injury.</a> PLoS One. 7 (10), e42654 (2012).</li><li>Yao, Y., Xu, X. H., Jin, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Macrophage+polarization+in+physiological+and+pathological+pregnancy.">Macrophage polarization in physiological and pathological pregnancy.</a> Front Immunol. 10, 792 (2019).</li><li>Lu, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+expression+of+CD11c+defines+two+types+of+tissue-resident+macrophages+with+different+origins+in+steady-state+salivary+glands.">Differential expression of CD11c defines two types of tissue-resident macrophages with different origins in steady-state salivary glands.</a> Sci Rep. 12 (1), 931 (2022).</li><li>Harbeson, D., Ben-Othman, R., Amenyogbe, N., Kollmann, T. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Outgrowing+the+immaturity+myth:+The+cost+of+defending+from+neonatal+infectious+disease.">Outgrowing the immaturity myth: The cost of defending from neonatal infectious disease.</a> Front Immunol. 9, 1077 (2018).</li><li>Kollmann, T. R., Kampmann, B., Mazmanian, S. K., Marchant, A., Levy, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protecting+the+newborn+and+young+infant+from+infectious+diseases:+Lessons+from+immune+ontogeny.">Protecting the newborn and young infant from infectious diseases: Lessons from immune ontogeny.</a> Immunity. 46 (3), 350-363 (2017).</li><li>Loopmans, S., Stockmans, I., Carmeliet, G., Stegen, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+in+vitro+characterization+of+murine+young-adult+long+bone+skeletal+progenitors.">Isolation and in vitro characterization of murine young-adult long bone skeletal progenitors.</a> Front Endocrinol (Lausanne). 13, 930358 (2022).</li><li>Winterberg, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+phenotypic+features+of+neonatal+murine+macrophages).">Distinct phenotypic features of neonatal murine macrophages).</a> Eur J Immunol. 45 (1), 214-224 (2015).</li><li>de Brito Monteiro, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=M-CSF-+and+L929-derived+macrophages+present+distinct+metabolic+profiles+with+similar+inflammatory+outcomes.">M-CSF- and L929-derived macrophages present distinct metabolic profiles with similar inflammatory outcomes.</a> Immunobiology. 225 (3), 151935 (2020).</li></ol>

La investigación con modelos de ratones neonatos puede presentar una serie de desafíos. Los neonatos tienen un sistema inmunológico en desarrollo que es único en comparación con los adultos8. Como tal, no se debe asumir que los datos generados a partir de modelos animales adultos se aplican a los recién nacidos, y varios trabajos publicados han articulado bien esta idea18,19. Por lo tanto, se necesitan modelos neonatales específicos...

La médula ósea encierra poblaciones de células madre hematopoyéticas y mesenquimales que son autorrenovables y se pueden diferenciar en varios linajes celulares. Las células madre hematopoyéticas de la médula ósea dan lugar a linajes mieloides y linfoides1. Las células madre mesenquimales producen osteoblastos (hueso), adipocitos (grasa) o condrocitos (cartílago)2. Estas células tienen múltiples aplicaciones en el campo de la biología celular y la ingeniería de tejidos, incluida la terapia génica 3,4. Las células progenitoras presentes en la médula ósea se diferencian en tipos celulares específicos en presencia de factores de crecimiento específicos del linaje. La eritropoyetina promueve la proliferación de células progenitoras eritroides, el factor estimulante de colonias de granulocitos (G-CSF) estimula el crecimiento de colonias de neutrófilos y la trombopoyetina regula la producción de plaquetas, como algunos ejemplos de factores de crecimiento específicos del linaje5. El FACS marcado con antígeno de superficie celular y la clasificación celular activada magnéticamente (MACS) son métodos bien establecidos para el aislamiento y la purificación de los tipos específicos de células derivadas de la médula ósea6.
Aunque los estudios neonatales están avanzando hacia la búsqueda de las causas de las muertes neonatales y el tratamiento de las complicaciones durante los partos prematuros, el desarrollo terapéutico directo sigue siendo una necesidad médica insatisfecha. Smith y Davis afirmaron: "Los pacientes pediátricos siguen siendo huérfanos terapéuticos"7. Existen varios desafíos, como muestras pequeñas, efectos de por vida del resultado y cuestiones éticas en la obtención del consentimiento en los estudios clínicos de neonatos8. Por lo tanto, existe una gran demanda de modelos de estudio in vivo e in vitro específicos para neonatos para lograr relevancia traslacional. Debido a las similitudes entre los niveles anatómicos y tisulares, los períodos de gestación cortos y el tamaño de las camadas, los roedores son el sistema modelo de mamíferos más estudiado.
Aquí, describimos un procedimiento detallado, altamente factible y reproducible para aislar médula ósea de crías de ratón de 7-9 días de edad y su capacidad para diferenciarse en macrófagos. Sin embargo, se podría lograr una variedad de linajes celulares con el uso de señales de diferenciación distintas. También demostramos la presencia de marcadores de superficie celular y la presencia de actividad fagocítica in vitro esperada para los macrófagos derivados de la médula ósea (BMDM).

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>40 &#181;m strainer</td>
			<td>Greiner</td>
			<td>542040</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96 well round (U) bottom plate</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>12-565-65</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mouse CD11b-BV786</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>740861</td>
			<td>FACS analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mouse CD206-Alexa Fluor488</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>141709</td>
			<td>FACS analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mouse F4/80-PE</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>565410</td>
			<td>FACS analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Countess3</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>TSI-C3ACC</td>
			<td>Automated cell counter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Hyclone</td>
			<td>SH30022.01</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO</td>
			<td>VWR</td>
			<td>WN182</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS, 1x</td>
			<td>Corning</td>
			<td>21-031-CV</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Escherichia coli O1:K1:H7</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>11775</td>
			<td>Infection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EVOS FL&#160;</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>12-563-649</td>
			<td>Cell Imaging System&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS</td>
			<td>Avantor&#160;</td>
			<td>76419-584</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FluoroBright BMDM</td>
			<td>Thermo fisher Scientific</td>
			<td>A1896701</td>
			<td>Dye free culture media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutamine</td>
			<td>Cytiva</td>
			<td>SH30034.01</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Cytiva</td>
			<td>SH30237.01</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-929</td>
			<td>ATCC</td>
			<td></td>
			<td>Differentiation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LSRFortessa</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td></td>
			<td>Flowcytometer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lysotracker red DND 99</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>L7528</td>
			<td>Fluorescent dye</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEM</td>
			<td>Corning</td>
			<td>15-010-CV</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin /streptomycin&#160;</td>
			<td>Hyclone</td>
			<td>SV30010</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pHrodo green STP ester&#160;</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>P35369</td>
			<td>Fluorescent dye</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T75 flask</td>
			<td>Cell star</td>
			<td>658170</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>25300120</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zeiss 710&#160;</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>P20GM103434</td>
			<td>Confocal</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

neonatal mouse bone marrow isolation and preparation of bone marrow-derived macrophages

Varias técnicas para aislar la médula ósea de ratones adultos han sido bien establecidas. Sin embargo, aislar la médula ósea de ratones neonatos es un desafío y requiere mucho tiempo, pero para algunos modelos, es traslacionalmente relevante y necesario. Este protocolo describe un método eficiente y sencillo para preparar células de médula ósea de cachorros de 7 a 9 días de edad. Estas células se pueden aislar o diferenciar aún más en tipos específicos de células de interés. Los macrófagos son células inmunitarias cruciales que desempeñan un papel importante en la inflamación y la infección. Durante el desarrollo, los macrófagos neonatales contribuyen significativamente a la remodelación de los tejidos. Además, el fenotipo y las funciones de los macrófagos neonatales difieren de los de sus homólogos adultos. Este protocolo también describe la diferenciación de los macrófagos neonatales de las células aisladas de la médula ósea en presencia de medio condicionado con L929. Los marcadores de superficie para macrófagos neonatales diferenciados se evaluaron mediante análisis de citometría de flujo. Para demostrar la funcionalidad, también se probó la eficiencia fagocítica utilizando Escherichia coli conjugada con colorante sensible al pH.

Bone marrow encloses both hematopoietic and mesenchymal stem cell populations that are self-renewable and can be differentiated into various cell lineages.&#160;Hematopoietic stem cells in the bone marrow give rise to myeloid and lymphoid lineages1. Mesenchymal stem cells produce osteoblasts (bone), adipocytes (fat), or chondrocytes (cartilage)2. These cells have multiple applications in the field of cell biology and tissue engineering, including gene therapy3,4. Progenitor cells present in the bone marrow differentiate into specific cell types in the presence of lineage-specific growth factors. Erythropoietin promotes the proliferation of erythroid progenitor cells, granulocyte colony-stimulating factor (G-CSF) stimulates the growth of neutrophil colonies, and thrombopoietin regulates the production of platelets as a few examples of lineage-specific growth factors5. Cell surface antigen labeled FACS and magnetic-activated cell sorting (MACS) are well-established methods for isolation and purification of the specific bone marrow-derived cell types6.
Though neonatal studies are advancing toward finding the causes of neonatal deaths and addressing the complications during premature births, direct therapeutic development remains an unmet medical need. Smith and Davis stated, &#34;Pediatric patients remain therapeutic orphans&#34;7. There are several challenges, such as small samples, lifelong effects of the outcome, and ethical issues in obtaining consent in clinical studies of neonates8. Hence, there is a high demand for in vivo and in vitro study models specific to neonates to achieve translational relevance. Because of the similarities between anatomical and tissue levels, short gestational periods, and litter sizes, rodents are the most studied mammalian model system.
Here, we describe a detailed, highly feasible, and reproducible procedure for isolating bone marrow from 7-9-day-old mouse pups and their ability to differentiate into macrophages. However, a variety of cell lineages could be achieved with the use of distinct differentiation signals. We also demonstrate the presence of cell surface markers and the presence of in vitro phagocytic activity expected for bone marrow-derived macrophages (BMDMs).

Author Spotlight: Developing a Reproducible Method for Isolating Bone Marrow-Derived Macrophages from Neonatal Mice to Advance Early Life Immune Responses

Aislamiento de médula ósea de ratón neonatal y preparación de macrófagos derivados de la médula ósea

Utilizando el método descrito en este estudio, se pueden aislar con éxito de 25 a 37 millones de células de médula ósea de una camada de cinco crías de ratón C57BL/6. Este método ha sido validado con tamaños de camada que oscilan entre 5 y 7 crías. La edad mínima para el aislamiento en nuestros experimentos ha sido de 7 días. Dependiendo del tamaño de la camada y del número de células necesarias para el experimento, que es inferior a un millón, los investigadores podrían intentar este protocolo para rato...

Este protocolo describe un método sencillo y no enzimático para aislar células de médula ósea de ratón neonatal de 7-9 días de edad y generar macrófagos diferenciados utilizando un sobrenadante de células L929 como fuente de factor estimulante de colonias de granulocitos (M-CSF). Los macrófagos derivados de la médula ósea se analizaron más a fondo para determinar los antígenos de superficie F4/80, CD206, CD11b y la competencia funcional.

Various techniques for isolating bone marrow from adult mice have been well established. However, isolating bone marrow from neonatal mice is challenging ...