Name: Autore in primo piano: Sviluppo di cantilever AFM bio-ibridi per l'analisi quantitativa dei meccanismi di puntura delle zanzare
Uploaded: 2024-04-26T14:40:00
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Gli autori riconoscono il sostegno finanziario del New Frontiers in Research Fund (NFRF) del Canada, del programma Discovery del Natural Sciences and Engineering Research Council of Canada (NSERC) e delle borse di studio per la formazione magistrale del Fonds de Recherche du Québec Nature et Technologies (FRQNT). Gli autori desiderano inoltre ringraziare il gruppo del Prof. Yaoyao Zhao alla McGill per il loro supporto tecnico sulla stampa 3D di alcuni componenti.

La specie di zanzara utilizzata per questo protocollo è una femmina adulta non infetta di Aedes aegypti (A. aegypti), ricevuta congelata e conservata in un congelatore a -20 °C. La specie è stata fornita dal NIH/NIAID Filariasis Research Reagent Resource Center per la distribuzione attraverso BEI Resources, NIAID, NIH: Aedes aegypti non infetta, ceppo Black Eye Liverpool (Frozen), NR-48920. I reagenti e le attrezzature utilizzate per lo studio sono elencati nella tabella dei material...

Sonda AFM bio-ibrida con labbro di zanzara per lo studio dei comportamenti di morso

<ol>
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M., Swaminathan, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanics+of+a+mosquito+bite+with+applications+to+microneedle+design.">Mechanics of a mosquito bite with applications to microneedle design.</a> Bioinspir Biomim. 3 (4), 046001 (2008).</li><li>Dai, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanoscale+surface+measurements+at+sidewalls+of+nano-+and+micro-structures.">Nanoscale surface measurements at sidewalls of nano- and micro-structures.</a> Measur Sci and Technol. 18 (2), 334-341 (2007).</li></ol>

La fase 1 del protocollo ha lo scopo di pulire il campione biologico dal labbro indesiderato. Per ottenere ciò, viene praticata un'incisione sul labbro, ma non sul fascicolo, che si trova direttamente sotto il labbro (Figura 1). Poiché il fascicolo e il labbro non sono uniti insieme alla loro interfaccia (cioè, il labbro è libero di scorrere lungo il fascicolo ed è tenuto in posizione solo dal suo attacco alla testa della zanzara), l'incisione eseguita ha lo scopo di separare parte del ...

L'Organizzazione Mondiale della Sanità (OMS) ha riferito che le malattie trasmesse da vettori (VBD) rappresentano oltre il 17% di tutte le malattie infettive, che causano più di 7.000.000 di decessi all'anno a livello globale. Ad esempio, essendo l'animale più letale del mondo, le zanzare diffondono numerosi agenti patogeni, come dengue, malaria e Zika, attraverso artropodi che si nutrono di sangue, provocando 700 milioni di infezioni ogni anno. Le esplorazioni verso lo sviluppo di misure efficaci per prevenire le VBD sono di fondamentale importanza, tra cui l'imitazione dei comportamenti di penetrazione delle zanzare per studiare i loro meccanismi di puntura e gli studi di potenziali barriere per dimostrare la loro efficacia nel prevenire la penetrazione. Una sfida chiave è quella di sviluppare approcci adeguati per eseguire tali indagini. Sono stati compiuti sforzi in letteratura, incluso lo sviluppo di aghi su microscala che assomigliano alla geometria di un pungiglione di zanzara; tuttavia, molti dei materiali utilizzati per realizzare questi microaghi (ad esempio, materiali viscoelastici2, silicio (Si), vetro, ceramica3, ecc.) hanno proprietà meccaniche diverse rispetto al materiale biologico della proboscide della zanzara. I materiali ingegnerizzati possono essere fragili e soggetti a fratture e deformazioni 3,4, mentre la proboscide della zanzara può resistere meglio alla frattura o all'instabilità4. Il vantaggio di avere una sonda bio-ibrida che utilizza il labbro di una zanzara invece di materiali ingegnerizzati è che può essere una rappresentazione più accurata del meccanismo di perforazione delle zanzare. Inoltre, strumenti specializzati devono essere integrati con micro aghi per eseguire studi quantitativi, come la misurazione accurata della forza5, che non è facilmente ottenibile con configurazioni personalizzate utilizzando microaghi ingegnerizzati.
L'approccio basato sulla microscopia a forza atomica (AFM) è promettente in quanto funziona impiegando un cantilever con una punta ultrasottile accuratamente posizionata vicino alla superficie di un campione. La punta può essere scansionata o premuta verso/dentro una superficie, subendo forze attrattive o repulsive variabili a causa delle sue interazioni con un campione6. Queste interazioni portano alla deflessione del cantilever, che viene tracciata dalla riflessione di un raggio laser dalla parte superiore del cantilever su un fotorilevatore6. L'eccezionale sensibilità al movimento del sistema consente all'AFM di condurre una vasta gamma di misurazioni, tra cui, ma non solo, la mappatura morfologica con precisione picometrica, le misurazioni della forza che vanno dai piconewton ai micronewtone le indagini multifisiche complete. Ad esempio, le indentazioni AFM possono essere eseguite per valutare con precisione la risposta alla forza applicata di un campione e anche per misurare la durezza, l'elasticità e altre proprietà meccaniche di un campione accoppiandole con modelli analitici appropriati8. La sonda dell'AFM è più comunemente realizzata in silicio (Si) o nitruro di silicio (Si3, N4)8 con una lunghezza di 20-300 μm9 e un raggio di punta dell'ordine di diverse o decine di nanometri10. Il raggio della punta su scala nanometrica può essere ideale per applicazioni come l'imaging ad alta risoluzione; tuttavia, non possiede le caratteristiche dei pungiglioni biologici per gli studi che cercano di imitare i comportamenti di penetrazione in termini di rigidità, raggio, forma e rapporto d'aspetto. Ad esempio, la struttura a microaghi di una zanzara è il fascicolo, che ha un rapporto d'aspetto di ~6011 (lunghezza da ~1,5 mm a 2 mm; diametro ~30 μm)12. Mentre si può presumere che una sonda AFM convenzionale assomigli a un pungiglione biologico come un labbro, le sue proprietà e dimensioni distinte del materiale non rifletteranno la situazione reale durante un morso.
Per consentire indagini quantitative sui comportamenti di penetrazione che imitano i morsi biologici di insetti o altri animali con pungiglioni, qui viene sviluppato un processo per fabbricare cantilever AFM bio-ibridi con un pungiglione biologico come punta. Come caso di studio, è stato dimostrato con successo un cantilever AFM con la punta di un labbro di zanzara attaccato. Sfruttando le informazioni esistenti dalla letteratura sulle tipiche forze di inserzione che una zanzara usa per perforare la pelle di una vittima12,13, questo cantilever AFM bio-ibrido può potenzialmente consentire un'imitazione quasi reale delle punture di zanzara sotto un normale AFM. Il protocollo di sfruttare i pungiglioni microbiologici per fabbricare cantilever AFM bio-ibridi può essere applicato anche allo sviluppo di altri cantilever AFM bioibridi a base di pungiglione affilato per indagini quantitative di una varietà di meccanismi di morso.
Terminologie Uno schema di una proboscide e dei suoi componenti di interesse è mostrato nella Figura 1 e le loro definizioni sono (1) Proboscide: una parte del corpo della bocca di una zanzara che consente alla zanzara di nutrirsi, con una struttura nucleo-guscio composta dal fascicolo (nucleo) e dal labbro (guscio), (2) Labio: la copertura esterna scura e smussata di una proboscide2, (3) Fascicolo: un gruppo di aghi sottili contenuti all'interno del labbro, tra cui due mascelle, due mandibole, un'ipofaringe e un labbro2, (4) Ipofaringe: responsabile della secrezione di saliva nel flusso sanguigno dell'ospite2, (5) Mascelle: membro seghettato che assiste nel meccanismo di alimentazione2, (5) Mandibole: simili alla mascella, aiutano la zanzara nel meccanismo di alimentazione e hanno una punta acuminata2, (6) Labbro: il membro principale per penetrare nella pelle di una vittima, che è molto più grande delle mascelle, delle mandibole e dell'ipofaringe. Ha anche strutture sensoriali che gli consentono di trovare vasi sanguigni e canali interni sotto la pelle2, (7) Manipolatore: un gruppo con tre gradi di libertà e precisione su scala micron per il posizionamento, che consente il movimento nelle direzioni XYZ, (8) Gruppo morsetto: un morsetto in 2 parti su misura montato sul manipolatore utilizzato per bloccare il cantilever AFM senza punta durante l'esperimento.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>&#160;5-SA-SE Straight Tapered Ultra Fine-Pointed Tweezers</td>
			<td>Excelta</td>
			<td>N/A</td>
			<td>For manipulating/dissecting the proboscis.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C-4D Probe station</td>
			<td>Everbeing Int&#8217;l Corp&#160;</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Used for AFM assembly.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tipless Tapping Mode Cantilever</td>
			<td>NanoAndMore USA</td>
			<td>TL-NCH</td>
			<td>AFM cantilever used for mounting the labrum. 
			Specs are shown here: 
			 
			Shape: Beam 
			Force Constant: 42 N/m (10 - 130 N/m) 
			Resonance Frequency: 330 kHz (204 - 497 kHz) 
			Length: 125 &#181;m (115 - 135 &#181;m) 
			Width: 30 &#181;m (22.5 - 37.5 &#181;m) 
			Thickness: 4 &#181;m ( 3 - 5 &#181;m)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UV Expoxy</td>
			<td>Let&#39;s resin</td>
			<td>ALR00146</td>
			<td>For stinger attachment.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

development of a bio-hybrid mosquito stinger-based atomic force microscopy probe

Le zanzare, note come gli animali più letali per l'uomo a causa della loro capacità di trasmettere malattie, rappresentano una sfida persistente per la salute pubblica. La strategia di prevenzione primaria attualmente in uso prevede l'uso di repellenti chimici, che spesso si rivelano inefficaci in quanto le zanzare sviluppano rapidamente resistenza. Di conseguenza, l'invenzione di nuovi metodi preventivi è fondamentale. Tale sviluppo dipende da una comprensione approfondita dei comportamenti di puntura delle zanzare, che richiede una configurazione sperimentale che riproduca accuratamente gli scenari di puntura reali con parametri di test controllabili e misurazioni quantitative. Per colmare questa lacuna, è stata progettata una sonda di microscopia a forza atomica (AFM) bio-ibrida, con un pungiglione biologico - in particolare, un labbro di zanzara - come punta. Questa sonda bio-ibrida, compatibile con i sistemi AFM standard, consente una simulazione quasi autentica dei comportamenti di penetrazione delle zanzare. Questo metodo segna un passo avanti nello studio quantitativo dei meccanismi di puntura, portando potenzialmente alla creazione di barriere efficaci contro le malattie trasmesse da vettori (VBD) e aprendo nuove strade nella lotta contro le malattie trasmesse dalle zanzare.

World Health Organization (WHO) reported that vector-borne diseases (VBDs) account for over 17% of all infectious diseases, which cause more than 7,00,000 deaths per year globally. For example, as the deadliest animal in the world, mosquitoes spread numerous pathogens, such as dengue, malaria, and Zika, through blood-feeding arthropods, resulting in 700 million infections each year1. Explorations toward the development of effective measures to prevent VBDs are of crucial importance, including mimicking the penetration behaviors of mosquitoes to investigate their biting mechanisms and studies of potential barriers to prove their efficacy in preventing penetration. One key challenge is to develop proper approaches to perform such investigations. Efforts have been made in the literature, including the development of micro-scale needles that resemble the geometry of a mosquito stinger; however, many of the materials used to make these microneedles (i.e., viscoelastic materials2, silicon (Si), glass, ceramic3, etc.) have different mechanical properties than the biological material of the mosquito&#39;s proboscis. The engineered materials can be brittle and prone to fracture and buckling3,4, whereas the mosquito&#39;s proboscis can withstand fracture or buckling better4. The benefit of having a bio-hybrid probe using the labrum of a mosquito instead of engineered materials is that it can be a more accurate representation of the piercing mechanism of mosquitoes. Also, specialized tools must be integrated with micro needles to perform quantitative studies, such as the accurate measurement of force5, which is not easily achievable with customized setups using engineered microneedles.
Atomic force microscopy (AFM)-based approach is promising in that it operates by employing a cantilever with an ultra-fine tip that is carefully positioned close to a sample&#39;s surface. The tip can either scan across or be pressed towards/into a surface, experiencing varying attractive or repulsive forces due to its interactions with a sample6. These interactions lead to the cantilever&#39;s deflection, which is tracked by the reflection of a laser beam from the cantilever&#39;s top onto a photodetector6. The exceptional sensitivity to movement of the system enables AFM to conduct a diverse range of measurements, including but not limited to morphological mapping with picometer accuracy, force measurements ranging from piconewtons to micronewtons, and comprehensive multiphysics investigations7. For example, AFM indentations can be performed to precisely assess the response to the applied force of a sample and also to measure the hardness, elasticity, and other mechanical properties of a sample by coupling with appropriate analytical models8. The probe of the AFM is most commonly made of silicon (Si) or silicon nitride (Si3N4)8 with a length of 20-300 &#181;m9 and a tip radius on the order of several to tens of nanometers10. The nanometer scale tip radius can be ideal for applications such as high-resolution imaging; however, it does not possess the characteristics of biological stingers for studies that try to mimic penetration behaviors in terms of stiffness, radius, shape, and aspect ratio. For example, the microneedle structure of a mosquito is the fascicle, which has an aspect ratio of ~6011 (length ~1.5 mm to 2 mm; diameter ~30 &#181;m)12. While a conventional AFM probe can be assumed to resemble a biological stinger like a labrum, its distinct material properties and dimensions will not reflect the real situation during a bite.
To enable quantitative investigations of penetration behaviors mimicking biological bites of insects or other animals with stingers, here, a process to fabricate bio-hybrid AFM cantilevers with a biological stinger as its tip is developed. As a case study, an AFM cantilever with a mosquito labrum&#39;s tip attached was successfully demonstrated. Harnessing existing information from literature on the typical insertion forces that a mosquito uses to pierce through a victim&#39;s skin12,13, this bio-hybrid AFM cantilever can potentially allow near-real mimicry of mosquito bites under a regular AFM. The protocol of leveraging micro biological stingers to fabricate bio-hybrid AFM cantilevers can also be applied to the development of other sharp stinger-based biohybrid AFM cantilevers for quantitative investigations of a variety of biting mechanisms.
Terminologies 
A schematic of a proboscis and its components of interest are shown in Figure 1, and their definitions are (1) Proboscis: a body part from the mouth of a mosquito that allows the mosquito to feed itself, with a core-shell structure composed of the fascicle(core) and the labium(shell), (2) Labium: the dark and blunt outer cover of a proboscis2, (3) Fascicle: a group of slender needles contained inside of the labium, including two maxillae, two mandibles, a hypopharynx, and a labrum2, (4) Hypopharynx: responsible for secreting saliva into the host&#39;s bloodstream2, (5) Maxillae: serrated member assisting in the feeding mechanism2, (5) Mandibles: similar to the maxilla, they help the mosquito in the feeding mechanism and have a sharp tip2, (6) Labrum: the main member for penetrating the skin of a victim, which is much bigger than the maxillae, mandibles and hypopharynx. It also has sensory structures that allow it to find blood vessels and internal channels under the skin2, (7) Manipulator: an assembly with three degrees of freedom and micron-scale accuracy for positioning, allowing movement in XYZ directions, (8) Clamp assembly: a custom-made 2-part clamp mounted to the manipulator used to clamp the tipless AFM cantilever during the experiment.

Autore in primo piano: Sviluppo di cantilever AFM bio-ibridi per l'analisi quantitativa dei meccanismi di puntura delle zanzare

Sviluppo di una sonda per microscopia a forza atomica basata su pungiglione di zanzara bio-ibrida

We're looking to develop an AFM cantilever to potentially quantitatively study the biting mechanisms of the mosquito. Our protocol offers a new method for creating accurate, controllable, and reliable AFM probes in order to study animal biting or stinging processes. Our protocol aims at accurately simulating the animal biting process, causing current methodologies to either be uncontrollable, unreproducible in a reliable manner, or in certain cases completely inaccurate.The impact of our work is twofold. The first, we create a protocol that enables other researchers to fabricate their own custom bio-hybrid AFM cantilevers. Secondly, our work paves the way for creating other protocols that merge testing systems with biological material for creating more realistic testing scenarios.

Le immagini al microscopio elettronico a scansione (SEM) della sonda AFM bio-ibrida fabbricata possono essere trovate nella Figura 7. L'estremità del labbro è stata incollata con successo alla trave a sbalzo senza punta. A causa della naturale curvatura dei pungiglioni di zanzara e del funzionamento manuale del protocollo presentato, è estremamente difficile ottenere un cantilever con una punta del pungiglione perfettamente perpendicolare al cantilever. L'angolo decentrato tra il pungigli...

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Indagini quantitative e controllate sui comportamenti di puntura degli insetti sono fondamentali per elaborare strategie efficaci per combattere le malattie trasmesse da vettori. In questo contesto, viene introdotto un metodo per fabbricare una sonda di microscopia a forza atomica (AFM) bio-ibrida.

Mosquitoes, notorious as the deadliest animals to humans due to their capacity to transmit diseases, pose a persistent challenge to public health. The ...

Stiamo cercando di sviluppare un cantilever AFM per studiare potenzialmente quantitativamente i meccanismi di puntura della zanzara. Il nostro protocollo offre un nuovo metodo per creare sonde AFM accurate, controllabili e affidabili al fine di studiare i processi di morso o puntura degli animali. Il nostro protocollo mira a simulare accuratamente il processo di morsicatura dell'animale, rendendo le attuali metodologie incontrollabili, non riproducibili in modo affidabile o, in alcuni casi, completamente imprecise.L'impatto del nostro lavoro è duplice. Il primo, creiamo un protocollo che consente ad altri ricercatori di fabbricare i propri cantilever AFM bio-ibridi personalizzati. In secondo luogo, il nostro lavoro apre la strada alla creazione di altri protocolli che fondono i sistemi di test con il materiale biologico per creare scenari di test più realistici.

development-bio-hybrid-mosquito-stinger-based-atomic-force-microscopy

Research

JoVE Journal

Engineering

Development of a Bio-Hybrid Mosquito Stinger-Based Atomic Force Microscopy Probe

Mosquitoes, notorious as the deadliest animals to humans due to their capacity to transmit diseases, pose a persistent challenge to public health. The primary prevention strategy currently in use involves chemical repellents, which often prove ineffective as mosquitoes rapidly develop resistance. Consequently, the invention of new preventive methods is crucial. Such development hinges on a thorough understanding of mosquito biting behaviors, necessitating an experimental setup that accurately replicates actual biting scenarios with controllable testing parameters and quantitative measurements. To bridge this gap, a bio-hybrid atomic force microscopy (AFM) probe was engineered, featuring a biological stinger - specifically, a mosquito labrum - as its tip. This bio-hybrid probe, compatible with standard AFM systems, enables a near-authentic simulation of mosquito penetration behaviors. This method marks a step forward in the quantitative study of biting mechanisms, potentially leading to the creation of effective barriers against vector-borne diseases (VBDs) and opening new avenues in the fight against mosquito-transmitted illnesses.

Quantitative and controlled investigations into insect biting behaviors are crucial for devising effective strategies to combat vector-borne diseases. In this context, a method for fabricating a bio-hybrid atomic force microscopy (AFM) probe is introduced.