Name: 著者スポットライト:蚊に刺されるメカニズムの定量的分析のためのバイオハイブリッドAFMカンチレバーの開発
Uploaded: 2024-04-26T14:40:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Author Spotlight: Development of Bio-Hybrid AFM Cantilevers for Quantitative Analysis of Mosquito Biting Mechanisms at JoVE.com

著者らは、カナダの研究基金(NFRF)、カナダ自然科学工学研究評議会(NSERC)ディスカバリープログラム、およびケベック自然技術財団(FRQNT)の修士課程のトレーニング奨学金からの資金援助を認めています。著者らはまた、いくつかのコンポーネントの3Dプリンティングに関する技術サポートを提供してくれたマギル大学のYaoyao Zhao教授のグループに感謝します。

このプロトコルに使用される蚊の種は、感染していない成虫 のネッタイシマカ (A. aegypti)であり、冷凍され、-20°Cの冷凍庫に保管されます。この種は、NIH/NIAIDフィラリア症研究試薬リソースセンターから提供され、BEI Resources、NIAID、NIH:Uninfected Aedes aegypti、Strain Black Eye Liverpool (Frozen)、NR-48920を通じて配布されました。研究に使用された試薬と機器は、 材料表に...

咬傷行動の研究のための蚊唇を用いたバイオハイブリッドAFMプローブ

<ol>
	<li>World Health Organization. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+vector+control+response+2017&#8211;2030.">Global vector control response 2017&#8211;2030.</a> World Health Organization. , (2017).</li><li>Gurera, D., Bhushan, B., Kumar, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lessons+from+mosquitoes&#8217;+painless+piercing.">Lessons from mosquitoes&#8217; painless piercing.</a> J Mech Behav Biomed Mater. 84, 178-187 (2018).</li><li>Ma, G., Wu, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microneedle,+bio-microneedle+and+bio-inspired+microneedle:+A+review.">Microneedle, bio-microneedle and bio-inspired microneedle: A review.</a> Journ of Contr Relea. 251, 11-23 (2017).</li><li>Kong, X., Wu, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Micronano+structure+and+mechanics+behavior+of+mosquito&#8217;s+proboscis+biomaterials+with+applications+to+microneedle+design.">Micronano structure and mechanics behavior of mosquito&#8217;s proboscis biomaterials with applications to microneedle design.</a> Advan Mater Res. 299-300, 376-379 (2011).</li><li>Li, A. D. R., Putra, K. B., Chen, L., Montgomery, J. S., Shih, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mosquito+proboscis-inspired+needle+insertion+to+reduce+tissue+deformation+and+organ+displacement.">Mosquito proboscis-inspired needle insertion to reduce tissue deformation and organ displacement.</a> Sci Rep. 10 (1), 12248 (2020).</li><li>Meyer, E., Hug, H. J., Bennewitz, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Introduction+to+Scanning+Probe+Microscopy.">Introduction to Scanning Probe Microscopy.</a> Scanning Probe Microscopy. 1, 1-13 (2004).</li><li>Garc&#237;a, R., Per&#233;z, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+atomic+force+microscopy+methods.">Dynamic atomic force microscopy methods.</a> Surf Sci Rep. 47 (6), 197-301 (2002).</li><li>Thurner, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Atomic+force+microscopy+and+indentation+force+measurement+of+bone.">Atomic force microscopy and indentation force measurement of bone.</a> WIREs Nanomed and Nanobio. 1 (6), 624-649 (2009).</li><li>M&#252;ller, D. J., Dufr&#234;ne, Y. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Atomic+force+microscopy+as+a+multifunctional+molecular+toolbox+in+nanobiotechnology.">Atomic force microscopy as a multifunctional molecular toolbox in nanobiotechnology.</a> Nat Nanotech. 3 (5), 261-269 (2008).</li><li>Hussain, D., Ahmad, K., Song, J., Xie, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advances+in+the+atomic+force+microscopy+for+-critical+dimension+metrology.">Advances in the atomic force microscopy for -critical dimension metrology.</a> Meas Sci Technol. 28 (1), 012001 (2017).</li><li>Kong, X. Q., Wu, C. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mosquito+proboscis:+An+elegant+biomicroelectromechanical+system.">Mosquito proboscis: An elegant biomicroelectromechanical system.</a> Phys Rev E. 82 (1), 011910 (2010).</li><li>Kong, X. Q., Wu, C. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measurement+and+prediction+of+insertion+force+for+the+mosquito.">Measurement and prediction of insertion force for the mosquito.</a> J Bionic Eng. 6 (2), 143-152 (2009).</li><li>Ramasubramanian, M. K., Barham, O. M., Swaminathan, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanics+of+a+mosquito+bite+with+applications+to+microneedle+design.">Mechanics of a mosquito bite with applications to microneedle design.</a> Bioinspir Biomim. 3 (4), 046001 (2008).</li><li>Dai, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanoscale+surface+measurements+at+sidewalls+of+nano-+and+micro-structures.">Nanoscale surface measurements at sidewalls of nano- and micro-structures.</a> Measur Sci and Technol. 18 (2), 334-341 (2007).</li></ol>

プロトコルのステップ1は、不要な陰唇の生物学的サンプルを洗浄することを目的としています。これを達成するために、陰唇を切開しますが、陰唇の真下にある束には切開しません(図1)。束と陰唇はそれらの界面で結合されていないため(つまり、陰唇は束に沿って自由にスライドし、蚊の頭に付着することによってのみ所定の位置に保持されます)、実行された切開は?...

世界保健機関(WHO)は、ベクター媒介性疾患(VBD)が全感染症の17%以上を占め、世界で年間70万人以上の死亡を引き起こしていると報告しました。例えば、世界で最も致命的な動物である蚊は、デング熱、マラリア、ジカ熱などの多くの病原体を、血液を媒介する節足動物を介して拡散させ、毎年7億件の感染をもたらしています1。蚊の侵入行動を模倣して蚊を刺すメカニズムを調べたり、侵入防止の有効性を証明するための潜在的な障壁の研究など、VBDを予防するための効果的な対策の開発に向けた探求は非常に重要です。重要な課題の1つは、そのような調査を実行するための適切なアプローチを開発することです。蚊の針の形状に似たマイクロスケールの針の開発など、文献で努力が払われてきました。しかし、これらのマイクロニードルを作るために使用される材料の多くは、粘弾性材料2、シリコン(Si)、ガラス、セラミック3など)は、蚊の吻の生物学的材料とは異なる機械的特性を持っています。設計された材料は脆く、破壊や座屈を起こしやすい可能性があります3,4が、蚊の吻は破壊や座屈によく耐えることができます4。人工材料の代わりに蚊の唇を使用するバイオハイブリッドプローブを持つことの利点は、蚊の穿刺メカニズムをより正確に表現できることです。また、力5の正確な測定など、定量的な研究を行うには、特殊なツールをマイクロニードルと統合する必要がありますが、これは、設計されたマイクロニードルを使用したカスタマイズされたセットアップでは簡単に達成できません。
原子間力顕微鏡(AFM)ベースのアプローチは、サンプルの表面近くに注意深く配置された超微細チップを備えたカンチレバーを採用することによって動作するという点で有望です。先端は、表面を横切ってスキャンするか、表面に向かって/押し込むことができ、サンプルとの相互作用により、さまざまな引力または反発力を受けます6。これらの相互作用は、カンチレバーの偏向につながり、カンチレバーの上部から光検出器6へのレーザービームの反射によって追跡される。システムの動きに対する並外れた感度により、AFMは、ピコメートル精度の形態学的マッピング、ピコニュートンからマイクロニュートンまでの力測定、包括的なマルチフィジックス調査7など、さまざまな測定を行うことができます。例えば、AFMインデンテーションは、試料に加えられた力に対する応答を正確に評価するために実行することができ、また、適切な分析モデル8と結合することによって、試料の硬度、弾性、およびその他の機械的特性を測定することができる。AFMのプローブは、最も一般的には、長さ20〜300μm9、先端半径が数〜数十ナノメートルのオーダー10のシリコン(Si)または窒化ケイ素(Si3N4)8でできています。ナノメートルスケールの先端半径は、高解像度イメージングなどのアプリケーションに最適です。ただし、剛性、半径、形状、およびアスペクト比の点で浸透動作を模倣しようとする研究用の生物学的針の特性はありません。例えば、蚊の微小針構造は束であり、そのアスペクト比は~6011(長さ~1.5mmから2mm、直径~30μm)12である。従来のAFMプローブは、唇のような生物学的な針に似ていると想定できますが、その明確な材料特性と寸法は、噛み合わせ中の実際の状況を反映していません。
昆虫などの生物咬傷を針で模倣した浸透挙動を定量的に調べるために、生物針を先端とするバイオハイブリッドAFM片持ち梁を作製するプロセスを開発した。ケーススタディとして、蚊の唇の先端が取り付けられたAFMカンチレバーのデモンストレーションに成功しました。蚊が犠牲者の皮膚を突き刺すために使用する典型的な挿入力に関する文献からの既存の情報を利用する12,13、このバイオハイブリッドAFMカンチレバーは、通常のAFMの下で蚊に刺された蚊のほぼ現実的な模倣を可能にする可能性があります。マイクロバイオバイオスティンガーを活用してバイオハイブリッドAFMカンチレバーを製造するプロトコルは、さまざまな噛み込みメカニズムの定量的研究のための他の鋭いスティンガーベースのバイオハイブリッドAFMカンチレバーの開発にも適用できます。
用語 吻とその関心のあるコンポーネントの概略図を図1に示し、それらの定義は、(1)テング:蚊が自分自身を養うことを可能にする蚊の口からの体の部分で、束(コア)と陰唇(シェル)で構成されるコアシェル構造、(2)陰唇:テング2の暗くて鈍い外側のカバー、(3)束:2つの上顎、2つの下顎、下咽頭、および唇を含む、陰唇の内側に含まれる細い針のグループ2、(4)下咽頭:宿主の血流に唾液を分泌する役割を果たします2、(5)上顎:摂食メカニズムを補助する鋸歯状のメンバー2、(5)下顎:上顎と同様に、摂食メカニズムで蚊を助け、鋭い先端2を持っています、(6)唇:上顎、下顎骨、下咽頭よりもはるかに大きい、犠牲者の皮膚を貫通するための主要なメンバー。また、皮膚の下の血管や内部チャネルを見つけることができる感覚構造も備えています2、 (7) マニピュレータ:位置決めのための3つの自由度とミクロンスケールの精度を備えたアセンブリで、XYZ方向への移動を可能にします (8) クランプアセンブリ : 実験中にチップレスAFMカンチレバーをクランプするために使用されるマニピュレータに取り付けられたカスタムメイドの2部構成クランプ。

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>&#160;5-SA-SE Straight Tapered Ultra Fine-Pointed Tweezers</td>
			<td>Excelta</td>
			<td>N/A</td>
			<td>For manipulating/dissecting the proboscis.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C-4D Probe station</td>
			<td>Everbeing Int&#8217;l Corp&#160;</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Used for AFM assembly.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tipless Tapping Mode Cantilever</td>
			<td>NanoAndMore USA</td>
			<td>TL-NCH</td>
			<td>AFM cantilever used for mounting the labrum. 
			Specs are shown here: 
			 
			Shape: Beam 
			Force Constant: 42 N/m (10 - 130 N/m) 
			Resonance Frequency: 330 kHz (204 - 497 kHz) 
			Length: 125 &#181;m (115 - 135 &#181;m) 
			Width: 30 &#181;m (22.5 - 37.5 &#181;m) 
			Thickness: 4 &#181;m ( 3 - 5 &#181;m)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UV Expoxy</td>
			<td>Let&#39;s resin</td>
			<td>ALR00146</td>
			<td>For stinger attachment.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

development of a bio-hybrid mosquito stinger-based atomic force microscopy probe

蚊は、病気を媒介する能力があるため、人間にとって最も致命的な動物として悪名高く、公衆衛生に永続的な課題を提起しています。現在使用されている一次予防戦略には化学忌避剤が含まれますが、蚊が急速に耐性を発達させるため、効果がないことがよくあります。したがって、新しい予防方法の発明は非常に重要です。このような開発は、蚊に刺される行動を完全に理解することにかかっており、制御可能なテストパラメータと定量的測定を使用して実際の刺すシナリオを正確に再現する実験設定が必要です。このギャップを埋めるために、バイオハイブリッド原子間力顕微鏡(AFM)プローブが設計され、その先端として生物学的針(特に蚊の唇)が特徴付けられました。このバイオハイブリッドプローブは、標準的なAFMシステムと互換性があり、蚊の侵入挙動をほぼ本物に近いシミュレーションで実現します。この方法は、噛むメカニズムの定量的研究における一歩前進を示し、ベクター媒介性疾患(VBD)に対する効果的な障壁の作成につながり、蚊が媒介する病気との闘いに新たな道を開く可能性があります。

World Health Organization (WHO) reported that vector-borne diseases (VBDs) account for over 17% of all infectious diseases, which cause more than 7,00,000 deaths per year globally. For example, as the deadliest animal in the world, mosquitoes spread numerous pathogens, such as dengue, malaria, and Zika, through blood-feeding arthropods, resulting in 700 million infections each year1. Explorations toward the development of effective measures to prevent VBDs are of crucial importance, including mimicking the penetration behaviors of mosquitoes to investigate their biting mechanisms and studies of potential barriers to prove their efficacy in preventing penetration. One key challenge is to develop proper approaches to perform such investigations. Efforts have been made in the literature, including the development of micro-scale needles that resemble the geometry of a mosquito stinger; however, many of the materials used to make these microneedles (i.e., viscoelastic materials2, silicon (Si), glass, ceramic3, etc.) have different mechanical properties than the biological material of the mosquito&#39;s proboscis. The engineered materials can be brittle and prone to fracture and buckling3,4, whereas the mosquito&#39;s proboscis can withstand fracture or buckling better4. The benefit of having a bio-hybrid probe using the labrum of a mosquito instead of engineered materials is that it can be a more accurate representation of the piercing mechanism of mosquitoes. Also, specialized tools must be integrated with micro needles to perform quantitative studies, such as the accurate measurement of force5, which is not easily achievable with customized setups using engineered microneedles.
Atomic force microscopy (AFM)-based approach is promising in that it operates by employing a cantilever with an ultra-fine tip that is carefully positioned close to a sample&#39;s surface. The tip can either scan across or be pressed towards/into a surface, experiencing varying attractive or repulsive forces due to its interactions with a sample6. These interactions lead to the cantilever&#39;s deflection, which is tracked by the reflection of a laser beam from the cantilever&#39;s top onto a photodetector6. The exceptional sensitivity to movement of the system enables AFM to conduct a diverse range of measurements, including but not limited to morphological mapping with picometer accuracy, force measurements ranging from piconewtons to micronewtons, and comprehensive multiphysics investigations7. For example, AFM indentations can be performed to precisely assess the response to the applied force of a sample and also to measure the hardness, elasticity, and other mechanical properties of a sample by coupling with appropriate analytical models8. The probe of the AFM is most commonly made of silicon (Si) or silicon nitride (Si3N4)8 with a length of 20-300 &#181;m9 and a tip radius on the order of several to tens of nanometers10. The nanometer scale tip radius can be ideal for applications such as high-resolution imaging; however, it does not possess the characteristics of biological stingers for studies that try to mimic penetration behaviors in terms of stiffness, radius, shape, and aspect ratio. For example, the microneedle structure of a mosquito is the fascicle, which has an aspect ratio of ~6011 (length ~1.5 mm to 2 mm; diameter ~30 &#181;m)12. While a conventional AFM probe can be assumed to resemble a biological stinger like a labrum, its distinct material properties and dimensions will not reflect the real situation during a bite.
To enable quantitative investigations of penetration behaviors mimicking biological bites of insects or other animals with stingers, here, a process to fabricate bio-hybrid AFM cantilevers with a biological stinger as its tip is developed. As a case study, an AFM cantilever with a mosquito labrum&#39;s tip attached was successfully demonstrated. Harnessing existing information from literature on the typical insertion forces that a mosquito uses to pierce through a victim&#39;s skin12,13, this bio-hybrid AFM cantilever can potentially allow near-real mimicry of mosquito bites under a regular AFM. The protocol of leveraging micro biological stingers to fabricate bio-hybrid AFM cantilevers can also be applied to the development of other sharp stinger-based biohybrid AFM cantilevers for quantitative investigations of a variety of biting mechanisms.
Terminologies 
A schematic of a proboscis and its components of interest are shown in Figure 1, and their definitions are (1) Proboscis: a body part from the mouth of a mosquito that allows the mosquito to feed itself, with a core-shell structure composed of the fascicle(core) and the labium(shell), (2) Labium: the dark and blunt outer cover of a proboscis2, (3) Fascicle: a group of slender needles contained inside of the labium, including two maxillae, two mandibles, a hypopharynx, and a labrum2, (4) Hypopharynx: responsible for secreting saliva into the host&#39;s bloodstream2, (5) Maxillae: serrated member assisting in the feeding mechanism2, (5) Mandibles: similar to the maxilla, they help the mosquito in the feeding mechanism and have a sharp tip2, (6) Labrum: the main member for penetrating the skin of a victim, which is much bigger than the maxillae, mandibles and hypopharynx. It also has sensory structures that allow it to find blood vessels and internal channels under the skin2, (7) Manipulator: an assembly with three degrees of freedom and micron-scale accuracy for positioning, allowing movement in XYZ directions, (8) Clamp assembly: a custom-made 2-part clamp mounted to the manipulator used to clamp the tipless AFM cantilever during the experiment.

著者スポットライト:蚊に刺されるメカニズムの定量的分析のためのバイオハイブリッドAFMカンチレバーの開発

バイオハイブリッド型蚊取りを用いた原子間力顕微鏡プローブの開発

We're looking to develop an AFM cantilever to potentially quantitatively study the biting mechanisms of the mosquito. Our protocol offers a new method for creating accurate, controllable, and reliable AFM probes in order to study animal biting or stinging processes. Our protocol aims at accurately simulating the animal biting process, causing current methodologies to either be uncontrollable, unreproducible in a reliable manner, or in certain cases completely inaccurate.The impact of our work is twofold. The first, we create a protocol that enables other researchers to fabricate their own custom bio-hybrid AFM cantilevers. Secondly, our work paves the way for creating other protocols that merge testing systems with biological material for creating more realistic testing scenarios.

作製したバイオハイブリッドAFMプローブの走査型電子顕微鏡(SEM)画像を 図7に示します。唇の端は、チップレスカンチレバービームにうまく接着されました。蚊の針の自然な曲率と提示されたプロトコルの手動操作のために、片持ち梁に対して完全に垂直な針の先端を持つ片持ちを得ることは非常に困難です。スティンガーとカンチレバーに垂直な仮想の中心線との間の...

Watch this Scientific Journal Video about Author Spotlight: Development of Bio-Hybrid AFM Cantilevers for Quantitative Analysis of Mosquito Biting Mechanisms at JoVE.com

昆虫を噛む行動の定量的かつ制御された調査は、ベクター媒介性疾患と戦うための効果的な戦略を考案するために重要です。これに関連して、バイオハイブリッド原子間力顕微鏡(AFM)プローブを製造する方法が導入されます。

Mosquitoes, notorious as the deadliest animals to humans due to their capacity to transmit diseases, pose a persistent challenge to public health. The ...

私たちは、蚊の刺すメカニズムを定量的に研究する可能性のあるAFMカンチレバーの開発を検討しています。私たちのプロトコルは、動物の噛みつきや刺すようなプロセスを研究するために、正確で制御可能で信頼性の高いAFMプローブを作成するための新しい方法を提供します。私たちのプロトコルは、動物の噛みつきプロセスを正確にシミュレートすることを目的としており、現在の方法論は制御不能であるか、信頼できる方法で再現できないか、場合によっては完全に不正確です。私たちの仕事の影響は2つあります。1つ目は、他の研究者が独自のカスタムバイオハイブリッドAFMカンチレバーを製造できるようにするプロトコルを作成することです。第二に、私たちの仕事は、より現実的な試験シナリオを作成するために、試験システムと生物学的材料を融合させた他のプロトコルを作成する道を開きます。

development-bio-hybrid-mosquito-stinger-based-atomic-force-microscopy

Research

JoVE Journal

Engineering

Development of a Bio-Hybrid Mosquito Stinger-Based Atomic Force Microscopy Probe

Mosquitoes, notorious as the deadliest animals to humans due to their capacity to transmit diseases, pose a persistent challenge to public health. The primary prevention strategy currently in use involves chemical repellents, which often prove ineffective as mosquitoes rapidly develop resistance. Consequently, the invention of new preventive methods is crucial. Such development hinges on a thorough understanding of mosquito biting behaviors, necessitating an experimental setup that accurately replicates actual biting scenarios with controllable testing parameters and quantitative measurements. To bridge this gap, a bio-hybrid atomic force microscopy (AFM) probe was engineered, featuring a biological stinger - specifically, a mosquito labrum - as its tip. This bio-hybrid probe, compatible with standard AFM systems, enables a near-authentic simulation of mosquito penetration behaviors. This method marks a step forward in the quantitative study of biting mechanisms, potentially leading to the creation of effective barriers against vector-borne diseases (VBDs) and opening new avenues in the fight against mosquito-transmitted illnesses.

Quantitative and controlled investigations into insect biting behaviors are crucial for devising effective strategies to combat vector-borne diseases. In this context, a method for fabricating a bio-hybrid atomic force microscopy (AFM) probe is introduced.