Name: В центре внимания автора: Разработка биогибридных консолей АСМ для количественного анализа механизмов укуса комаров
Uploaded: 2024-04-26T14:40:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Author Spotlight: Development of Bio-Hybrid AFM Cantilevers for Quantitative Analysis of Mosquito Biting Mechanisms at JoVE.com

Авторы выражают признательность за финансовую поддержку со стороны канадского Фонда новых рубежей в исследованиях (NFRF), программы Discovery Совета по естественным наукам и инженерным исследованиям Канады (NSERC) и магистерских стипендий Фонда исследований природы и технологий Квебека (FRQNT). Авторы также хотели бы поблагодарить группу профессора Яо Яо Чжао в Университете Макгилла за их техническую поддержку в 3D-печати некоторых компонентов.

Вид комаров, используемый для этого протокола, представляет собой неинфицированную взрослую самку Aedes aegypti (A. aegypti), полученную в замороженном виде и хранящуюся в морозильной камере при температуре -20 °C. Вид был предоставлен Ресурсным центром NIH/NIAID по исследованию филяриатозны...

Биогибридный зонд AFM с губой комара для изучения поведения при укусах

<ol>
	<li>World Health Organization. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+vector+control+response+2017&#8211;2030.">Global vector control response 2017&#8211;2030.</a> World Health Organization. , (2017).</li><li>Gurera, D., Bhushan, B., Kumar, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lessons+from+mosquitoes&#8217;+painless+piercing.">Lessons from mosquitoes&#8217; painless piercing.</a> J Mech Behav Biomed Mater. 84, 178-187 (2018).</li><li>Ma, G., Wu, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microneedle,+bio-microneedle+and+bio-inspired+microneedle:+A+review.">Microneedle, bio-microneedle and bio-inspired microneedle: A review.</a> Journ of Contr Relea. 251, 11-23 (2017).</li><li>Kong, X., Wu, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Micronano+structure+and+mechanics+behavior+of+mosquito&#8217;s+proboscis+biomaterials+with+applications+to+microneedle+design.">Micronano structure and mechanics behavior of mosquito&#8217;s proboscis biomaterials with applications to microneedle design.</a> Advan Mater Res. 299-300, 376-379 (2011).</li><li>Li, A. D. R., Putra, K. B., Chen, L., Montgomery, J. S., Shih, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mosquito+proboscis-inspired+needle+insertion+to+reduce+tissue+deformation+and+organ+displacement.">Mosquito proboscis-inspired needle insertion to reduce tissue deformation and organ displacement.</a> Sci Rep. 10 (1), 12248 (2020).</li><li>Meyer, E., Hug, H. J., Bennewitz, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Introduction+to+Scanning+Probe+Microscopy.">Introduction to Scanning Probe Microscopy.</a> Scanning Probe Microscopy. 1, 1-13 (2004).</li><li>Garc&#237;a, R., Per&#233;z, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+atomic+force+microscopy+methods.">Dynamic atomic force microscopy methods.</a> Surf Sci Rep. 47 (6), 197-301 (2002).</li><li>Thurner, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Atomic+force+microscopy+and+indentation+force+measurement+of+bone.">Atomic force microscopy and indentation force measurement of bone.</a> WIREs Nanomed and Nanobio. 1 (6), 624-649 (2009).</li><li>M&#252;ller, D. J., Dufr&#234;ne, Y. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Atomic+force+microscopy+as+a+multifunctional+molecular+toolbox+in+nanobiotechnology.">Atomic force microscopy as a multifunctional molecular toolbox in nanobiotechnology.</a> Nat Nanotech. 3 (5), 261-269 (2008).</li><li>Hussain, D., Ahmad, K., Song, J., Xie, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advances+in+the+atomic+force+microscopy+for+-critical+dimension+metrology.">Advances in the atomic force microscopy for -critical dimension metrology.</a> Meas Sci Technol. 28 (1), 012001 (2017).</li><li>Kong, X. Q., Wu, C. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mosquito+proboscis:+An+elegant+biomicroelectromechanical+system.">Mosquito proboscis: An elegant biomicroelectromechanical system.</a> Phys Rev E. 82 (1), 011910 (2010).</li><li>Kong, X. Q., Wu, C. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measurement+and+prediction+of+insertion+force+for+the+mosquito.">Measurement and prediction of insertion force for the mosquito.</a> J Bionic Eng. 6 (2), 143-152 (2009).</li><li>Ramasubramanian, M. K., Barham, O. M., Swaminathan, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanics+of+a+mosquito+bite+with+applications+to+microneedle+design.">Mechanics of a mosquito bite with applications to microneedle design.</a> Bioinspir Biomim. 3 (4), 046001 (2008).</li><li>Dai, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanoscale+surface+measurements+at+sidewalls+of+nano-+and+micro-structures.">Nanoscale surface measurements at sidewalls of nano- and micro-structures.</a> Measur Sci and Technol. 18 (2), 334-341 (2007).</li></ol>

Шаг 1 протокола предназначен для очистки биологического образца от нежелательной половой губы. Для этого делается разрез на половой губе, но не на пучке, которая находится непосредственно под половой губой (рис. 1). Поскольку пучок и губа не соединены вместе на их стыке (т....

Всемирная организация здравоохранения (ВОЗ) сообщила, что трансмиссивные болезни (ВБД) составляют более 17% всех инфекционных заболеваний, которые вызывают более 7 000 000 смертей в год во всем мире. Например, будучи самым смертоносным животным в мире, комары распространяют многочисленные патогены, такие как лихорадка денге, малярия и вирус Зика, через кровососущих членистоногих, что приводит к 700 миллионам инфекций каждый год. Исследования в направлении разработки эффективных мер по предотвращению ВБД имеют решающее значение, включая имитацию поведения комаров при проникновении для изучения механизмов их укуса и изучение потенциальных барьеров, чтобы доказать их эффективность в предотвращении проникновения. Одна из ключевых задач заключается в разработке надлежащих подходов к проведению таких расследований. В литературе были предприняты усилия, в том числе разработка микромасштабных игл, напоминающих геометрию жала комара; однако многие материалы, используемые для изготовления этих микроигл (т.е. вязкоупругие материалы2, кремний (Si), стекло, керамика3 и т.д.), имеют другие механические свойства, чем биологический материал хоботка комара. Инженерные материалы могут быть хрупкими и склонными к разрушению и изгибу 3,4, в то время как хоботок комара может лучше выдерживать перелом или коробление4. Преимущество наличия биогибридного зонда, использующего губу комара вместо инженерных материалов, заключается в том, что он может быть более точным представлением механизма прокалывания комаров. Кроме того, специализированные инструменты должны быть интегрированы с микроиглами для выполнения количественных исследований, таких как точное измерение силы5, что нелегко достижимо при индивидуальной настройке с использованием специальных микроигл.
Подход, основанный на атомно-силовой микроскопии (АСМ), является многообещающим в том смысле, что он работает с использованием кантилевера с ультратонким наконечником, который аккуратно расположен близко к поверхности образца. Наконечник может либо сканировать поперек, либо прижиматься к поверхности, испытывая различные силы притяжения или отталкивания из-за его взаимодействия с образцом6. Эти взаимодействия приводят к отклонению консоли, которое отслеживается отражением лазерного луча от верхней части консоли на фотодетектор6. Исключительная чувствительность системы к движению позволяет АСМ проводить широкий спектр измерений, включая, помимо прочего, морфологическое картирование с точностью пикометра, измерения сил в диапазоне от пиконьютонов до микроньютонов и комплексные мультифизические исследования7. Например, вдавливание АСМ может быть выполнено для точной оценки реакции на приложенную силу образца, а также для измерения твердости, эластичности и других механических свойств образца путем сопряжения с соответствующими аналитическими моделями8. Зонд АСМ чаще всего изготавливается из кремния (Si) или нитрида кремния (Si3N4)8 длиной 20-300 мкм9 и радиусом наконечника порядка нескольких до десятков нанометров10. Радиус наконечника в нанометровом масштабе может быть идеальным для таких приложений, как визуализация с высоким разрешением; однако он не обладает характеристиками биологических жал для исследований, которые пытаются имитировать поведение проникновения с точки зрения жесткости, радиуса, формы и соотношения сторон. Например, микроигольчатая структура комара представляет собой пучок, который имеет соотношение сторон ~6011 (длина ~ 1,5 мм до 2 мм; диаметр ~ 30 мкм)12. Хотя можно предположить, что обычный зонд АСМ напоминает биологическое жало, такое как лабрум, его отличительные свойства материала и размеры не будут отражать реальную ситуацию во время укуса.
Чтобы обеспечить количественные исследования проникающего поведения, имитирующего биологические укусы насекомых или других животных с жалами, здесь разработан процесс изготовления биогибридных консолей AFM с биологическим жалом в качестве наконечника. В качестве примера была успешно продемонстрирована консоль AFM с прикрепленным кончиком губы комара. Используя существующую информацию из литературы о типичных силах введения, которые комар использует для прокалывания кожи жертвы12,13, этот биогибридный кантилевер АСМ потенциально может обеспечить почти реальную имитацию укусов комаров при обычном АСМ. Протокол использования микробиологических стингеров для изготовления биогибридных консолей АСМ также может быть применен для разработки других биогибридных кантилеверов АСМ на основе острых жал для количественных исследований различных механизмов укуса.
Термины Схема хоботка и его компонентов, представляющих интерес, показана на рисунке 1, и их определения следующие: (1) Хоботок: часть тела комара изо рта, которая позволяет комару питаться, со структурой сердцевины и раковины, состоящей из пучка (сердцевины) и лабиума (раковины), (2) Губа: темный и тупой внешний покров хоботка2, (3) Пучок: группа тонких игл, содержащихся внутри половых губ, включая две верхние челюсти, две челюсти, гипофаринкс и губу2, (4) Гипофаринкс: отвечает за секрецию слюны в кровоток хозяина2, (5) Верхние челюсти: зубчатый член, помогающий в механизме питания2, (5) Нижние челюсти: подобно верхней челюсти, они помогают комару в механизме питания и имеют острый кончик2, (6) Губа: основной элемент для проникновения в кожу жертвы, который намного больше, чем верхние челюсти, мандибулы и глотка. Он также имеет сенсорные структуры, которые позволяют ему находить кровеносные сосуды и внутренние каналы под кожей2, (7) Манипулятор: узел с тремя степенями свободы и точностью в микронном масштабе для позиционирования, позволяющий двигаться в направлениях XYZ, (8) Зажим в сборе: изготовленный на заказ зажим из 2 частей, установленный на манипуляторе, используемом для зажима консольного АСМ без наконечника во время эксперимента.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>&#160;5-SA-SE Straight Tapered Ultra Fine-Pointed Tweezers</td>
			<td>Excelta</td>
			<td>N/A</td>
			<td>For manipulating/dissecting the proboscis.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C-4D Probe station</td>
			<td>Everbeing Int&#8217;l Corp&#160;</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Used for AFM assembly.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tipless Tapping Mode Cantilever</td>
			<td>NanoAndMore USA</td>
			<td>TL-NCH</td>
			<td>AFM cantilever used for mounting the labrum. 
			Specs are shown here: 
			 
			Shape: Beam 
			Force Constant: 42 N/m (10 - 130 N/m) 
			Resonance Frequency: 330 kHz (204 - 497 kHz) 
			Length: 125 &#181;m (115 - 135 &#181;m) 
			Width: 30 &#181;m (22.5 - 37.5 &#181;m) 
			Thickness: 4 &#181;m ( 3 - 5 &#181;m)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UV Expoxy</td>
			<td>Let&#39;s resin</td>
			<td>ALR00146</td>
			<td>For stinger attachment.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

development of a bio-hybrid mosquito stinger-based atomic force microscopy probe

Комары, печально известные как самые смертоносные животные для человека из-за их способности передавать болезни, представляют собой постоянную проблему для общественного здравоохранения. Основная стратегия профилактики, используемая в настоящее время, включает химические репелленты, которые часто оказываются неэффективными, поскольку комары быстро развивают резистентность. Следовательно, изобретение новых методов профилактики имеет решающее значение. Такое развитие зависит от глубокого понимания поведения комаров, требующих экспериментальной установки, которая точно воспроизводит реальные сценарии укусов с контролируемыми параметрами тестирования и количественными измерениями. Чтобы восполнить этот пробел, был разработан зонд биогибридной атомно-силовой микроскопии (АСМ) с биологическим жалом, а именно губой комара в качестве наконечника. Этот биогибридный зонд, совместимый со стандартными системами АСМ, позволяет практически точно моделировать поведение комаров. Этот метод знаменует собой шаг вперед в количественном изучении механизмов укусов, потенциально ведущий к созданию эффективных барьеров против трансмиссивных болезней (ВБД) и открывающий новые возможности в борьбе с болезнями, передаваемыми комарами.

World Health Organization (WHO) reported that vector-borne diseases (VBDs) account for over 17% of all infectious diseases, which cause more than 7,00,000 deaths per year globally. For example, as the deadliest animal in the world, mosquitoes spread numerous pathogens, such as dengue, malaria, and Zika, through blood-feeding arthropods, resulting in 700 million infections each year1. Explorations toward the development of effective measures to prevent VBDs are of crucial importance, including mimicking the penetration behaviors of mosquitoes to investigate their biting mechanisms and studies of potential barriers to prove their efficacy in preventing penetration. One key challenge is to develop proper approaches to perform such investigations. Efforts have been made in the literature, including the development of micro-scale needles that resemble the geometry of a mosquito stinger; however, many of the materials used to make these microneedles (i.e., viscoelastic materials2, silicon (Si), glass, ceramic3, etc.) have different mechanical properties than the biological material of the mosquito&#39;s proboscis. The engineered materials can be brittle and prone to fracture and buckling3,4, whereas the mosquito&#39;s proboscis can withstand fracture or buckling better4. The benefit of having a bio-hybrid probe using the labrum of a mosquito instead of engineered materials is that it can be a more accurate representation of the piercing mechanism of mosquitoes. Also, specialized tools must be integrated with micro needles to perform quantitative studies, such as the accurate measurement of force5, which is not easily achievable with customized setups using engineered microneedles.
Atomic force microscopy (AFM)-based approach is promising in that it operates by employing a cantilever with an ultra-fine tip that is carefully positioned close to a sample&#39;s surface. The tip can either scan across or be pressed towards/into a surface, experiencing varying attractive or repulsive forces due to its interactions with a sample6. These interactions lead to the cantilever&#39;s deflection, which is tracked by the reflection of a laser beam from the cantilever&#39;s top onto a photodetector6. The exceptional sensitivity to movement of the system enables AFM to conduct a diverse range of measurements, including but not limited to morphological mapping with picometer accuracy, force measurements ranging from piconewtons to micronewtons, and comprehensive multiphysics investigations7. For example, AFM indentations can be performed to precisely assess the response to the applied force of a sample and also to measure the hardness, elasticity, and other mechanical properties of a sample by coupling with appropriate analytical models8. The probe of the AFM is most commonly made of silicon (Si) or silicon nitride (Si3N4)8 with a length of 20-300 &#181;m9 and a tip radius on the order of several to tens of nanometers10. The nanometer scale tip radius can be ideal for applications such as high-resolution imaging; however, it does not possess the characteristics of biological stingers for studies that try to mimic penetration behaviors in terms of stiffness, radius, shape, and aspect ratio. For example, the microneedle structure of a mosquito is the fascicle, which has an aspect ratio of ~6011 (length ~1.5 mm to 2 mm; diameter ~30 &#181;m)12. While a conventional AFM probe can be assumed to resemble a biological stinger like a labrum, its distinct material properties and dimensions will not reflect the real situation during a bite.
To enable quantitative investigations of penetration behaviors mimicking biological bites of insects or other animals with stingers, here, a process to fabricate bio-hybrid AFM cantilevers with a biological stinger as its tip is developed. As a case study, an AFM cantilever with a mosquito labrum&#39;s tip attached was successfully demonstrated. Harnessing existing information from literature on the typical insertion forces that a mosquito uses to pierce through a victim&#39;s skin12,13, this bio-hybrid AFM cantilever can potentially allow near-real mimicry of mosquito bites under a regular AFM. The protocol of leveraging micro biological stingers to fabricate bio-hybrid AFM cantilevers can also be applied to the development of other sharp stinger-based biohybrid AFM cantilevers for quantitative investigations of a variety of biting mechanisms.
Terminologies 
A schematic of a proboscis and its components of interest are shown in Figure 1, and their definitions are (1) Proboscis: a body part from the mouth of a mosquito that allows the mosquito to feed itself, with a core-shell structure composed of the fascicle(core) and the labium(shell), (2) Labium: the dark and blunt outer cover of a proboscis2, (3) Fascicle: a group of slender needles contained inside of the labium, including two maxillae, two mandibles, a hypopharynx, and a labrum2, (4) Hypopharynx: responsible for secreting saliva into the host&#39;s bloodstream2, (5) Maxillae: serrated member assisting in the feeding mechanism2, (5) Mandibles: similar to the maxilla, they help the mosquito in the feeding mechanism and have a sharp tip2, (6) Labrum: the main member for penetrating the skin of a victim, which is much bigger than the maxillae, mandibles and hypopharynx. It also has sensory structures that allow it to find blood vessels and internal channels under the skin2, (7) Manipulator: an assembly with three degrees of freedom and micron-scale accuracy for positioning, allowing movement in XYZ directions, (8) Clamp assembly: a custom-made 2-part clamp mounted to the manipulator used to clamp the tipless AFM cantilever during the experiment.

В центре внимания автора: Разработка биогибридных консолей АСМ для количественного анализа механизмов укуса комаров

Разработка биогибридного зонда атомно-силовой микроскопии на основе укуса комара

We're looking to develop an AFM cantilever to potentially quantitatively study the biting mechanisms of the mosquito. Our protocol offers a new method for creating accurate, controllable, and reliable AFM probes in order to study animal biting or stinging processes. Our protocol aims at accurately simulating the animal biting process, causing current methodologies to either be uncontrollable, unreproducible in a reliable manner, or in certain cases completely inaccurate.The impact of our work is twofold. The first, we create a protocol that enables other researchers to fabricate their own custom bio-hybrid AFM cantilevers. Secondly, our work paves the way for creating other protocols that merge testing systems with biological material for creating more realistic testing scenarios.

Изображения сканирующей электронной микроскопии (СЭМ) изготовленного биогибридного зонда АСМ можно найти на рисунке 7. Конец лабрума был успешно приклеен к консольной балке без опрокидывания. Из-за естественной кривизны жал комаров и ручного управления представленным...

Watch this Scientific Journal Video about Author Spotlight: Development of Bio-Hybrid AFM Cantilevers for Quantitative Analysis of Mosquito Biting Mechanisms at JoVE.com

Количественные и контролируемые исследования поведения насекомых при укусах имеют решающее значение для разработки эффективных стратегий борьбы с трансмиссивными болезнями. В этом контексте представлен способ изготовления биогибридного зонда для атомно-силовой микроскопии (АСМ).

Mosquitoes, notorious as the deadliest animals to humans due to their capacity to transmit diseases, pose a persistent challenge to public health. The ...

Мы хотим разработать консоль АСМ для потенциального количественного изучения механизмов укуса комара. Наш протокол предлагает новый метод создания точных, контролируемых и надежных зондов АСМ для изучения процессов укуса или укуса животных. Наш протокол направлен на точное моделирование процесса кусания животных, в результате чего существующие методологии либо неконтролируемы, либо невоспроизводимы надежным образом, либо в некоторых случаях полностью неточны.Влияние нашей работы двоякое. Во-первых, мы создаем протокол, который позволяет другим исследователям изготавливать свои собственные биогибридные консоли АСМ. Во-вторых, наша работа прокладывает путь к созданию других протоколов, которые объединяют тест-системы с биологическим материалом для создания более реалистичных сценариев тестирования.

development-bio-hybrid-mosquito-stinger-based-atomic-force-microscopy

Research

JoVE Journal

Engineering

Development of a Bio-Hybrid Mosquito Stinger-Based Atomic Force Microscopy Probe

Mosquitoes, notorious as the deadliest animals to humans due to their capacity to transmit diseases, pose a persistent challenge to public health. The primary prevention strategy currently in use involves chemical repellents, which often prove ineffective as mosquitoes rapidly develop resistance. Consequently, the invention of new preventive methods is crucial. Such development hinges on a thorough understanding of mosquito biting behaviors, necessitating an experimental setup that accurately replicates actual biting scenarios with controllable testing parameters and quantitative measurements. To bridge this gap, a bio-hybrid atomic force microscopy (AFM) probe was engineered, featuring a biological stinger - specifically, a mosquito labrum - as its tip. This bio-hybrid probe, compatible with standard AFM systems, enables a near-authentic simulation of mosquito penetration behaviors. This method marks a step forward in the quantitative study of biting mechanisms, potentially leading to the creation of effective barriers against vector-borne diseases (VBDs) and opening new avenues in the fight against mosquito-transmitted illnesses.

Quantitative and controlled investigations into insect biting behaviors are crucial for devising effective strategies to combat vector-borne diseases. In this context, a method for fabricating a bio-hybrid atomic force microscopy (AFM) probe is introduced.