De auteurs erkennen U19 AI157984, U01 DK103168, U19 AI144297, P30 DK56338, P01 AI057788, U19 AI116497 subsidies en NASA Cooperative Agreement Notice/TRISH NNX16AO69A.

De organoïdelijnen die hier worden gebruikt, zijn verkregen van het Texas Medical Center Digestive Disease Center GEMS Core. In het kort, om in eerste instantie organoïde lijnen vast te stellen, werden donorweefselmonsters gewassen en enzymatisch verteerd om de darmcrypten vrij te maken. Crypten werden ingebed in een basaalmembraan en gekweekt in een medium. De Institutional Review Board van het Baylor College of Medicine keurde het onderzoeksprotocol goed om weefselmonsters te verkrijgen waaruit organoïdelijnen werde...

Integratie van single-cell transcriptomics met menselijke darmorganoïden

<ol>
	<li>Sato, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+expansion+of+epithelial+organoids+from+human+colon,+adenoma,+adenocarcinoma,+and+Barrett's+epithelium.">Long-term expansion of epithelial organoids from human colon, adenoma, adenocarcinoma, and Barrett's epithelium.</a> Gastroenterology. 141 (5), 1762-1772 (2011).</li><li>Blutt, S. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gastrointestinal+microphysiological+systems.">Gastrointestinal microphysiological systems.</a> Exp Biol Med. 242 (16), 1633-1642 (2017).</li><li>VanDussen, K. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+an+enhanced+human+gastrointestinal+epithelial+culture+system+to+facilitate+patient-based+assays.">Development of an enhanced human gastrointestinal epithelial culture system to facilitate patient-based assays.</a> Gut. 64 (6), 911-920 (2015).</li><li>Elmentaite, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cells+of+the+human+intestinal+tract+mapped+across+space+and+time.">Cells of the human intestinal tract mapped across space and time.</a> Nature. 597 (7875), 250-255 (2021).</li><li>Hickey, J. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organization+of+the+human+intestine+at+single-cell+resolution.">Organization of the human intestine at single-cell resolution.</a> Nature. 619 (7970), 572-584 (2023).</li><li>Burclaff, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+proximal-to-distal+survey+of+healthy+adult+human+small+intestine+and+colon+epithelium+by+single-cell+transcriptomics.">A proximal-to-distal survey of healthy adult human small intestine and colon epithelium by single-cell transcriptomics.</a> Cell Mol Gastroenterol Hepatol. 13 (5), 1554-1589 (2022).</li><li>Triana, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+transcriptomics+reveals+immune+response+of+intestinal+cell+types+to+viral+infection.">Single-cell transcriptomics reveals immune response of intestinal cell types to viral infection.</a> Mol Syst Biol. 17 (7), e9833 (2021).</li><li>Triana, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+analyses+reveal+SARS-CoV-2+interference+with+intrinsic+immune+response+in+the+human+gut.">Single-cell analyses reveal SARS-CoV-2 interference with intrinsic immune response in the human gut.</a> Mol Syst Biol. 17 (4), e10232 (2021).</li><li>Fujii, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+intestinal+organoids+maintain+self-renewal+capacity+and+cellular+diversity+in+niche-inspired+culture+condition.">Human intestinal organoids maintain self-renewal capacity and cellular diversity in niche-inspired culture condition.</a> Cell Stem Cell. 23 (6), 787-793 (2021).</li><li>Beumer, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BMP+gradient+along+the+intestinal+villus+axis+controls+zonated+enterocyte+and+goblet+cell+states.">BMP gradient along the intestinal villus axis controls zonated enterocyte and goblet cell states.</a> Cell Rep. 38 (9), 110438 (2022).</li><li>Beumer, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-resolution+mRNA+and+secretome+atlas+of+human+enteroendocrine+cells.">High-resolution mRNA and secretome atlas of human enteroendocrine cells.</a> Cell. 182 (4), 1062-1064 (2020).</li><li>Busslinger, G. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+gastrointestinal+epithelia+of+the+esophagus,+stomach,+and+duodenum+resolved+at+single-cell+resolution.">Human gastrointestinal epithelia of the esophagus, stomach, and duodenum resolved at single-cell resolution.</a> Cell Rep. 34 (10), 108819 (2021).</li><li>Luecken, M. D., Theis, F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Current+best+practices+in+single-cell+RNA-seq+analysis:+a+tutorial.">Current best practices in single-cell RNA-seq analysis: a tutorial.</a> Mol Syst Biol. 15 (6), e8746 (2019).</li><li>Heumos, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Best+practices+for+single-cell+analysis+across+modalities.">Best practices for single-cell analysis across modalities.</a> Nat Rev Genet. 24 (8), 550-572 (2023).</li></ol>

De auteurs hebben geen belangenconflicten.

Met behulp van eencellige genomics-platforms kunnen complexe biologische systemen, zoals weefselafgeleide HIO-culturen die het darmepitheel modelleren, worden afgebroken om individuele cellulaire bijdragen aan de algehele biologische respons te leveren 4,5,6. Cellulaire heterogeniteit en zeldzame celpopulaties kunnen ook worden geïdentificeerd en ondervraagd. Mobiele invoer moet worden geoptimaliseerd om de uitvoer te maximalis...

Het epitheel van de dunne darm heeft twee verschillende zones: de crypte die de intestinale stamcel (ISC) herbergt en de villus, die bestaat uit gedifferentieerde cellen van de secretoire en absorberende lijnen. Deze complexiteit wordt nog vergroot door de regionale specificiteit van het epitheel dat unieke functionele eigenschappen biedt tussen de regio's van de dunne darm. Baanbrekend werk bracht kweekomstandigheden tot stand waarin zowel de menselijke dunne darmcrypte als de villuszones ex vivo kunnen worden gegenereerd uit chirurgisch weefsel of weefselbiopsieën1. Deze culturen overbruggen de kloof tussen dierstudies en klinische proeven en onthullen voorheen niet-herkende celbiologie, biochemie en fysiologie van het maagdarmkanaal. De HIO's worden gepropageerd als 3D-sferische structuren met behulp van een medium met groeifactoren die de levensvatbaarheid van stamcellen bevorderen en extracellulaire ondersteuningsmatrices. Deze omstandigheden resulteren in een crypte-achtig HIO-model dat voornamelijk bestaat uit voorlopercellen en stamcellen. Verwijdering van de groeifactoren bevordert ISC-differentiatie (villusachtig model) en productie van rijpe darmepitheelcellen (beker, entero-endocriene, plukje, enterocyt) in de juiste verhoudingen, samen met celproliferatie en -differentiatie, polarisatie, barrière-integriteit, regionale specifieke kenmerken en passende fysiologische reacties2. HIO-culturen zijn genetisch stabiel en kunnen voor onbepaalde tijd worden vermeerderd in hun crypte-achtige staat. Gemakkelijke toegang tot het apicale oppervlak van deze culturen wordt geboden door kweekomstandigheden die groei in een monolaagformaatmogelijk maken 3. HIO's maken het ook mogelijk om overwegingen van individuele variabiliteit van de gastheer, zoals genetica, leeftijd, geslacht, etniciteit en ziektestatus, op te nemen in biologische analyses. Analytische en functionele beoordelingsinstrumenten zijn identiek aan die welke worden gebruikt in benaderingen die gericht zijn op getransformeerde cellijnen en omvatten een verscheidenheid aan moleculaire technieken zoals flowcytometrie, microscopie, transcriptomics, proteomics en metabolomics.
Single cell transcriptomics brengt een revolutie teweeg in ons begrip van de biologie en fysiologie van de dunne darm door inzicht te geven in de individuele bijdragen van elk celtype aan een biologisch proces. Baanbrekend werk met behulp van deze technologie heeft een landschap opgeleverd van de celtypen die aanwezig zijn in de inheemse menselijke darm 4,5,6. Platforms voor transcriptionele profilering van afzonderlijke cellen maken verkenning van het transcriptionele landschap van individuele cellen mogelijk, waardoor celheterogeniteit op de voorgrond van wetenschappelijke exploratie kan komen. In sommige transcriptionele profileringsplatforms voor één cel worden microfluïdische partitionering en barcodering gebruikt om cDNA-bibliotheken te genereren uit cellulaire gepolyadenyleerde mRNA's die zijn verkregen uit maximaal 10.000 cellen per monster. Op dit platform vormen druppeltjes met enkele cellen, oligonucleotiden met streepjescode, reverse transcriptiereagentia en olie een reactieblaasje dat ertoe leidt dat alle cDNA's van een enkele cel dezelfde streepjescode hebben. De cDNA's met streepjescodes kunnen vervolgens efficiënt worden gesequenced met behulp van sequencing van de volgende generatie. Gegenereerde gegevens kunnen worden verwerkt via software en visualisatietools, die de sequenties met streepjescodes omzetten in visualisatiekaarten en transcriptieprofielen van één cel. Celpopulaties kunnen worden geïdentificeerd met behulp van openbaar beschikbare databases van humaan dunne darmepitheel 4,5,6. Hoewel veel studies dit platform hebben gebruikt om darmorganoïden van muizen op celniveau te ondervragen, is de analyse van transcriptionele responsen van HIO's op basis van één cel achtergebleven bij 7,8,9,10,11,12.
Hier bieden we een stapsgewijze handleiding voor het isoleren van levensvatbare cellen uit HIO's in de dunne darm voor verwerking op transcriptionele profileringsplatforms voor één cel (Figuur 1). We bieden richtlijnen voor kweek en differentiatie, samen met mediacomponenten die zijn geoptimaliseerd voor epitheliale differentiatie. We schetsen celherstelmethoden voor drie verschillende kweekformaten: driedimensionale (3D) en monolaagculturen op plastic of op membraancelcultuurinzetstukken. We bieden steekproefclusteringgegevens die zijn verkregen met behulp van open-source software om differentieel tot expressie gebrachte genen in elk cluster af te leiden.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>[Leu15]-Gastrin I</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G9145</td>
			<td>10 nM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.05% Trypsin-EDTA</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>25300054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.4% Trypan blue</td>
			<td>Millipore-Sigma</td>
			<td>T8154</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.5 M EDTA</td>
			<td>Corning</td>
			<td>46-034-CI</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1x PBS Ca- Mg-</td>
			<td>Corning</td>
			<td>21-040-CM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24 mm Transwell</td>
			<td>Costar</td>
			<td>3412</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24 well Nunclon delta surface tissue culture dish</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>142475</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>40 &#181;m cell strainer</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>352340</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>40 &#181;m Flowmi tip strainer</td>
			<td>SP Bel-Art Labware</td>
			<td>H13680-0040</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>70 &#181;m Flowmi tip strainer</td>
			<td>SP Bel-Art Labware</td>
			<td>H13680-0070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96 well plate</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3595</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>A-83-01</td>
			<td>Tocris</td>
			<td>2939</td>
			<td>500 nM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Accutase</td>
			<td>StemCell Technologies</td>
			<td>7920</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Advanced DMEM/F12</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>12634-028</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B27 supplement</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>17504-044</td>
			<td>1X</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chromium Next GEM Single Cell 3&#8217; GEM, Library &#38; Gel Bead Kit v3.1</td>
			<td>10x Genomics</td>
			<td>PN-1000128</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagen IV</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C5533-5MG</td>
			<td>33 &#181;g/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning Cell Recovery Solution&#160;</td>
			<td>VWR</td>
			<td>354253</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS (Mg2-, Ca2-)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>14190-136</td>
			<td>1X</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GlutaMAX-I</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>35050-061</td>
			<td>2 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES 1M</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15630-080</td>
			<td>10 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-WRN conditioned media</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CRL-3276</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matrigel, GFR, phenol free</td>
			<td>Corning</td>
			<td>356231</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mouse recombinant EGF</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>PMG8043</td>
			<td>50 ng/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N2 supplement</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>17502-048</td>
			<td>1X</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-Acetylcysteine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A9165-5G</td>
			<td>500 &#181;M</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nicotinamide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>N0636</td>
			<td>10 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SB202190</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S7067</td>
			<td>10 &#181;M</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transwell</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3413</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Y27632</td>
			<td>Stem Cell Technologies</td>
			<td>72308</td>
			<td>10 &#181;M</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

using human intestinal organoids to understand the small intestine epithelium at the single cell transcriptional level

Single cell transcriptomics heeft een revolutie teweeggebracht in ons begrip van de celbiologie van het menselijk lichaam. State-of-the-art menselijke organoïdeculturen in de dunne darm bieden ex vivo modelsystemen die de kloof tussen diermodellen en klinische studies overbruggen. De toepassing van single cell transcriptomics op menselijke intestinale organoïde (HIO) modellen onthult voorheen niet-herkende celbiologie, biochemie en fysiologie van het maagdarmkanaal. De geavanceerde single cell transcriptomics-platforms maken gebruik van microfluïdische partitionering en barcodering om cDNA-bibliotheken te genereren. Deze cDNA's met streepjescodes kunnen eenvoudig worden gesequenced door sequencingplatforms van de volgende generatie en worden gebruikt door verschillende visualisatietools om kaarten te genereren. Hier beschrijven we methoden om HIO's van menselijke dunne darm in verschillende formaten te kweken en te differentiëren en procedures voor het isoleren van levensvatbare cellen uit deze formaten die geschikt zijn voor gebruik in transcriptionele profileringsplatforms voor één cel. Deze protocollen en procedures vergemakkelijken het gebruik van HIO's in de dunne darm om een beter begrip te krijgen van de cellulaire respons van humaan darmepitheel op transcriptioneel niveau in de context van een verscheidenheid aan verschillende omgevingen.

The small intestinal epithelium has two distinct zones: the crypt that houses the intestinal stem cell (ISC) and the villus, which is comprised of differentiated cells of the secretory and absorptive lineages. Adding to this complexity is the regional specificity of the epithelium that provides unique functional properties between the regions of the small intestine. Pioneering work established culture conditions in which both the human small intestinal crypt and villus zones can be generated ex vivo from surgical tissues or tissue biopsies1. These cultures are bridging the gap between animal studies and clinical trials and are revealing previously unrecognized cell biology, biochemistry, and physiology of the gastrointestinal tract. The HIOs are propagated as 3D spherical structures using a media with growth factors that promote stem cell viability and extracellular support matrices. These conditions result in a crypt-like HIO model that consists mostly of progenitors and stem cells. Removal of the growth factors promotes ISC differentiation (villus-like model) and production of mature intestinal epithelial cells (goblet, enteroendocrine, tuft, enterocyte) in appropriate ratios along with cell proliferation and differentiation, polarization, barrier integrity, regional specific features, and appropriate physiological responses2. HIO cultures are genetically stable and can be propagated indefinitely in their crypt-like state. Easy access to the apical surface of these cultures is provided by culture conditions that allow growth in a monolayer format3. HIOs also allow considerations of host individual variability such as genetics, age, sex, ethnicity, and disease status to be included in biological analyses. Analytic and functional assessment tools are identical to those used in approaches centered on transformed cell lines and include a variety of molecular techniques such as flow cytometry, microscopy, transcriptomics, proteomics, and metabolomics.
Single cell transcriptomics is revolutionizing our understanding of the biology and physiology of the small intestine by providing insight into the individual contributions of each cell type to a biological process. Pioneering work using this technology has provided a landscape of the cell types present in the native human intestine4,5,6. Single cell transcriptional profiling platforms allow exploration of the transcriptional landscape of individual cells, allowing cell heterogeneity to come to the forefront of scientific exploration. In some single cell transcriptional profiling platforms, microfluidic partitioning and barcoding are used to generate cDNA libraries from cellular polyadenylated mRNAs obtained from up to 10,000 cells per sample. On this platform, droplets containing single cells, barcoded oligonucleotides, reverse transcription reagents, and oil form a reaction vesicle that results in all cDNAs from a single cell having the same barcode. The barcoded cDNAs can then be efficiently sequenced using next generation sequencing. Data generated can be handled through software and visualization tools, which convert the barcoded sequences into visualization maps and single cell transcriptional profiles. Cell populations can be identified using publicly available databases of human small intestinal epithelium4,5,6. Although many studies have utilized this platform to interrogate murine intestinal organoids at the single cell level, the analysis of single cell transcriptional responses of HIOs has lagged behind7,8,9,10,11,12.
Here, we provide a step-by-step guide to isolating viable cells from small intestinal HIOs for processing on single cell transcriptional profiling platforms (Figure 1). We provide culturing and differentiation guidelines along with media components that have been optimized for epithelial differentiation. We outline cell recovery methods for three different culture formats: three dimensional (3D) and monolayer cultures either on plastic or on membrane cell culture inserts. We provide sample clustering data obtained using open-source software to derive differentially expressed genes in each cluster.

Auteur in de schijnwerpers: integratie van single-cell transcriptomics met organoïde culturen voor geavanceerd onderzoek en therapeutische inzichten

Menselijke darmorganoïden gebruiken om het epitheel van de dunne darm te begrijpen op transcriptioneel niveau van één cel

We are integrating single-cell transcriptomics and organoid technology to better understand the biology of the small intestine. These technologies are allowing us deeper insight into the cellular heterogeneity that exists within that tissue. The tools that improve the throughput, sensitivity, and the resolutions are the keys that advanced research in the field.Some examples are improved computational methods and the technological innovations. Cost reductions also a major focus. The process of preparing and sequencing the libraries of samples can cause transcription variations, which is one challenge.For organoids, specific challenges include limited spatial context or information about temporal dynamics. Single-cell analysis of the human intestinal organoids provides previously unattainable information into the cell types that make up the intestinal epithelium. This, thereby, opens the window to the transcriptional landscape of those cells.We are using these technologies to identify biomarkers and mechanisms of human intestinal diseases. These biomarkers and mechanisms will advance our ability to utilize personalized medicine-based approaches to treat human disease and improve human health overall.

Eencellige suspensies werden samengevoegd uit 2-3 putjes van membraancelcultuurinsert, monolaag en 3D HIO's om voldoende celopbrengst te garanderen en well-to-well-variatie te verminderen. Bibliotheken met één cel werden voorbereid met behulp van reagentia die specifiek zijn voor het transcriptionele profileringsplatform voor één cel. en gesequenced met gepaarde eindlezingen op een sequencingplatform van de volgende generatie, 30.000 lezingen/cel. Metingen werden in kaart gebracht, geteld en geanalyseerd met behulp v...

Het protocol combineert menselijke darmorganoïdetechnologie met transcriptomische analyse van één cel om aanzienlijk inzicht te geven in voorheen onontgonnen darmbiologie.

Single cell transcriptomics has revolutionized our understanding of the cell biology of the human body. State-of-the-art human small intestinal organoid ...

using-human-intestinal-organoids-to-understand-small-intestine

Research

JoVE Journal

Biology

Using Human Intestinal Organoids to Understand the Small Intestine Epithelium at the Single Cell Transcriptional Level

339 Views.  Baylor College of Medicine. We are integrating single-cell transcriptomics and organoid technology to better understand the biology of the small intestine. These technologies are allowing us deeper insight into the cellular heterogeneity that exists within that tissue. The tools that improve the throughput, sensitivity, and the resolutions are the keys that advanced research in the field.Some examples are improved computational methods and the technological innovations. Cost reductions also a major focus. The pro...