Les auteurs reconnaissent les subventions U19 AI157984, U01 DK103168, U19 AI144297, P30 DK56338, P01 AI057788, U19 AI116497 et l’avis d’accord de coopération de la NASA / TRISH NNX16AO69A.

Les lignées organoïdes utilisées ici ont été obtenues à partir du GEMS Core du Texas Medical Center Digestive Disease Center. En bref, pour établir initialement des lignées d’organoïdes, des échantillons de tissus du donneur ont été lavés et digérés par voie enzymatique pour libérer les cryptes intestinales. Les cryptes ont été encastrées dans une membrane basale et cultivées dans un milieu. Le conseil d’examen institutionnel du Baylor College of Medicine a approuvé le protocole d’étude pour o...

Intégration de la transcriptomique unicellulaire avec les organoïdes intestinaux humains

<ol>
	<li>Sato, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+expansion+of+epithelial+organoids+from+human+colon,+adenoma,+adenocarcinoma,+and+Barrett's+epithelium.">Long-term expansion of epithelial organoids from human colon, adenoma, adenocarcinoma, and Barrett's epithelium.</a> Gastroenterology. 141 (5), 1762-1772 (2011).</li><li>Blutt, S. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gastrointestinal+microphysiological+systems.">Gastrointestinal microphysiological systems.</a> Exp Biol Med. 242 (16), 1633-1642 (2017).</li><li>VanDussen, K. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+an+enhanced+human+gastrointestinal+epithelial+culture+system+to+facilitate+patient-based+assays.">Development of an enhanced human gastrointestinal epithelial culture system to facilitate patient-based assays.</a> Gut. 64 (6), 911-920 (2015).</li><li>Elmentaite, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cells+of+the+human+intestinal+tract+mapped+across+space+and+time.">Cells of the human intestinal tract mapped across space and time.</a> Nature. 597 (7875), 250-255 (2021).</li><li>Hickey, J. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organization+of+the+human+intestine+at+single-cell+resolution.">Organization of the human intestine at single-cell resolution.</a> Nature. 619 (7970), 572-584 (2023).</li><li>Burclaff, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+proximal-to-distal+survey+of+healthy+adult+human+small+intestine+and+colon+epithelium+by+single-cell+transcriptomics.">A proximal-to-distal survey of healthy adult human small intestine and colon epithelium by single-cell transcriptomics.</a> Cell Mol Gastroenterol Hepatol. 13 (5), 1554-1589 (2022).</li><li>Triana, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+transcriptomics+reveals+immune+response+of+intestinal+cell+types+to+viral+infection.">Single-cell transcriptomics reveals immune response of intestinal cell types to viral infection.</a> Mol Syst Biol. 17 (7), e9833 (2021).</li><li>Triana, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+analyses+reveal+SARS-CoV-2+interference+with+intrinsic+immune+response+in+the+human+gut.">Single-cell analyses reveal SARS-CoV-2 interference with intrinsic immune response in the human gut.</a> Mol Syst Biol. 17 (4), e10232 (2021).</li><li>Fujii, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+intestinal+organoids+maintain+self-renewal+capacity+and+cellular+diversity+in+niche-inspired+culture+condition.">Human intestinal organoids maintain self-renewal capacity and cellular diversity in niche-inspired culture condition.</a> Cell Stem Cell. 23 (6), 787-793 (2021).</li><li>Beumer, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BMP+gradient+along+the+intestinal+villus+axis+controls+zonated+enterocyte+and+goblet+cell+states.">BMP gradient along the intestinal villus axis controls zonated enterocyte and goblet cell states.</a> Cell Rep. 38 (9), 110438 (2022).</li><li>Beumer, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-resolution+mRNA+and+secretome+atlas+of+human+enteroendocrine+cells.">High-resolution mRNA and secretome atlas of human enteroendocrine cells.</a> Cell. 182 (4), 1062-1064 (2020).</li><li>Busslinger, G. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+gastrointestinal+epithelia+of+the+esophagus,+stomach,+and+duodenum+resolved+at+single-cell+resolution.">Human gastrointestinal epithelia of the esophagus, stomach, and duodenum resolved at single-cell resolution.</a> Cell Rep. 34 (10), 108819 (2021).</li><li>Luecken, M. D., Theis, F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Current+best+practices+in+single-cell+RNA-seq+analysis:+a+tutorial.">Current best practices in single-cell RNA-seq analysis: a tutorial.</a> Mol Syst Biol. 15 (6), e8746 (2019).</li><li>Heumos, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Best+practices+for+single-cell+analysis+across+modalities.">Best practices for single-cell analysis across modalities.</a> Nat Rev Genet. 24 (8), 550-572 (2023).</li></ol>

Les auteurs n’ont aucun conflit d’intérêts.

À l’aide de plateformes de génomique unicellulaire, des systèmes biologiques complexes, tels que les cultures HIO dérivées de tissus qui modélisent l’épithélium intestinal, peuvent être décomposés pour produire des contributions cellulaires individuelles à la réponse biologique globale 4,5,6. L’hétérogénéité cellulaire et les populations cellulaires rares peuvent également être identifiées et interrog?...

L’épithélium de l’intestin grêle comporte deux zones distinctes : la crypte qui abrite les cellules souches intestinales (CSI) et les villosités, qui sont composées de cellules différenciées des lignées sécrétoires et absorbantes. À cette complexité s’ajoute la spécificité régionale de l’épithélium qui offre des propriétés fonctionnelles uniques entre les régions de l’intestin grêle. Des travaux pionniers ont permis d’établir des conditions de culture dans lesquelles la crypte de l’intestin grêle humain et les zones villosités peuvent être générées ex vivo à partir de tissus chirurgicaux ou de biopsies tissulaires1. Ces cultures comblent le fossé entre les études animales et les essais cliniques et révèlent la biologie cellulaire, la biochimie et la physiologie du tractus gastro-intestinal jusqu’alors inconnues. Les HIO se propagent sous forme de structures sphériques 3D à l’aide d’un milieu avec des facteurs de croissance qui favorisent la viabilité des cellules souches et des matrices de soutien extracellulaires. Ces conditions se traduisent par un modèle HIO semblable à une crypte qui se compose principalement de progéniteurs et de cellules souches. L’élimination des facteurs de croissance favorise la différenciation de l’ISC (modèle de type villosité) et la production de cellules épithéliales intestinales matures (caliciforme, entéroendocrine, touffe, entérocytes) dans des proportions appropriées, ainsi que la prolifération et la différenciation cellulaires, la polarisation, l’intégrité de la barrière, les caractéristiques spécifiques régionales et les réponses physiologiquesappropriées2. Les cultures HIO sont génétiquement stables et peuvent être propagées indéfiniment dans leur état de crypte. L’accès facile à la surface apicale de ces cultures est fourni par des conditions de culture qui permettent la croissance dans un format monocouche3. Les DOI permettent également d’inclure dans les analyses biologiques des considérations relatives à la variabilité individuelle de l’hôte, comme la génétique, l’âge, le sexe, l’origine ethnique et le statut pathologique. Les outils d’évaluation analytique et fonctionnelle sont identiques à ceux utilisés dans les approches centrées sur les lignées cellulaires transformées et comprennent une variété de techniques moléculaires telles que la cytométrie en flux, la microscopie, la transcriptomique, la protéomique et la métabolomique.
La transcriptomique unicellulaire révolutionne notre compréhension de la biologie et de la physiologie de l’intestin grêle en fournissant un aperçu des contributions individuelles de chaque type de cellule à un processus biologique. Des travaux pionniers utilisant cette technologie ont fourni un paysage des types de cellules présentes dans l’intestin humain natif 4,5,6. Les plateformes de profilage transcriptionnel unicellulaire permettent d’explorer le paysage transcriptionnel des cellules individuelles, permettant à l’hétérogénéité cellulaire d’être à l’avant-garde de l’exploration scientifique. Dans certaines plateformes de profilage transcriptionnel unicellulaire, le partitionnement microfluidique et le codage à barres sont utilisés pour générer des banques d’ADNc à partir d’ARNm cellulaires polyadénylés obtenus à partir d’un maximum de 10 000 cellules par échantillon. Sur cette plate-forme, des gouttelettes contenant des cellules uniques, des oligonucléotides à code-barres, des réactifs de transcription inverse et de l’huile forment une vésicule réactionnelle qui fait que tous les ADNc d’une seule cellule ont le même code-barres. Les ADNc à code-barres peuvent ensuite être séquencés efficacement à l’aide du séquençage de nouvelle génération. Les données générées peuvent être traitées à l’aide de logiciels et d’outils de visualisation, qui convertissent les séquences de code-barres en cartes de visualisation et en profils transcriptionnels unicellulaires. Les populations cellulaires peuvent être identifiées à l’aide de bases de données publiques sur l’épithélium 4,5,6 de l’intestin grêle humain. Bien que de nombreuses études aient utilisé cette plateforme pour interroger les organoïdes intestinaux murins au niveau de la cellule unique, l’analyse des réponses transcriptionnelles des HIO sur cellule unique a pris du retard par rapport à 7,8,9,10,11,12.
Nous présentons ici un guide étape par étape pour isoler des cellules viables à partir d’OHI de l’intestin grêle afin de les traiter sur des plateformes de profilage transcriptionnel unicellulaire (Figure 1). Nous fournissons des directives de culture et de différenciation ainsi que des composants de milieux qui ont été optimisés pour la différenciation épithéliale. Nous décrivons des méthodes de récupération cellulaire pour trois formats de culture différents : les cultures tridimensionnelles (3D) et monocouches, sur plastique ou sur des inserts de culture cellulaire à membrane. Nous fournissons des échantillons de données de regroupement obtenus à l’aide d’un logiciel open source pour dériver des gènes exprimés de manière différentielle dans chaque grappe.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>[Leu15]-Gastrin I</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G9145</td>
			<td>10 nM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.05% Trypsin-EDTA</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>25300054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.4% Trypan blue</td>
			<td>Millipore-Sigma</td>
			<td>T8154</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.5 M EDTA</td>
			<td>Corning</td>
			<td>46-034-CI</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1x PBS Ca- Mg-</td>
			<td>Corning</td>
			<td>21-040-CM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24 mm Transwell</td>
			<td>Costar</td>
			<td>3412</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24 well Nunclon delta surface tissue culture dish</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>142475</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>40 &#181;m cell strainer</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>352340</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>40 &#181;m Flowmi tip strainer</td>
			<td>SP Bel-Art Labware</td>
			<td>H13680-0040</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>70 &#181;m Flowmi tip strainer</td>
			<td>SP Bel-Art Labware</td>
			<td>H13680-0070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96 well plate</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3595</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>A-83-01</td>
			<td>Tocris</td>
			<td>2939</td>
			<td>500 nM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Accutase</td>
			<td>StemCell Technologies</td>
			<td>7920</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Advanced DMEM/F12</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>12634-028</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B27 supplement</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>17504-044</td>
			<td>1X</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chromium Next GEM Single Cell 3&#8217; GEM, Library &#38; Gel Bead Kit v3.1</td>
			<td>10x Genomics</td>
			<td>PN-1000128</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagen IV</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C5533-5MG</td>
			<td>33 &#181;g/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning Cell Recovery Solution&#160;</td>
			<td>VWR</td>
			<td>354253</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS (Mg2-, Ca2-)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>14190-136</td>
			<td>1X</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GlutaMAX-I</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>35050-061</td>
			<td>2 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES 1M</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15630-080</td>
			<td>10 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-WRN conditioned media</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CRL-3276</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matrigel, GFR, phenol free</td>
			<td>Corning</td>
			<td>356231</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mouse recombinant EGF</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>PMG8043</td>
			<td>50 ng/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N2 supplement</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>17502-048</td>
			<td>1X</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-Acetylcysteine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A9165-5G</td>
			<td>500 &#181;M</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nicotinamide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>N0636</td>
			<td>10 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SB202190</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S7067</td>
			<td>10 &#181;M</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transwell</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3413</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Y27632</td>
			<td>Stem Cell Technologies</td>
			<td>72308</td>
			<td>10 &#181;M</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

using human intestinal organoids to understand the small intestine epithelium at the single cell transcriptional level

La transcriptomique sur cellule unique a révolutionné notre compréhension de la biologie cellulaire du corps humain. Des cultures d’organoïdes de l’intestin grêle humain à la pointe de la technologie fournissent des systèmes modèles ex vivo qui comblent le fossé entre les modèles animaux et les études cliniques. L’application de la transcriptomique sur cellule unique à des modèles d’organoïdes intestinaux humains (HIO) révèle la biologie cellulaire, la biochimie et la physiologie du tractus gastro-intestinal jusqu’alors inconnues. Les plateformes avancées de transcriptomique de cellules uniques utilisent le partitionnement microfluidique et le codage à barres pour générer des banques d’ADNc. Ces ADNc à code-barres peuvent être facilement séquencés par des plateformes de séquençage de nouvelle génération et utilisés par divers outils de visualisation pour générer des cartes. Ici, nous décrivons des méthodes de culture et de différenciation des HIO de l’intestin grêle humain dans différents formats et des procédures pour isoler des cellules viables à partir de ces formats qui conviennent à une utilisation dans des plateformes de profilage transcriptionnel unicellulaire. Ces protocoles et procédures facilitent l’utilisation des HIO de l’intestin grêle afin d’obtenir une meilleure compréhension de la réponse cellulaire de l’épithélium intestinal humain au niveau transcriptionnel dans le contexte d’une variété d’environnements différents.

The small intestinal epithelium has two distinct zones: the crypt that houses the intestinal stem cell (ISC) and the villus, which is comprised of differentiated cells of the secretory and absorptive lineages. Adding to this complexity is the regional specificity of the epithelium that provides unique functional properties between the regions of the small intestine. Pioneering work established culture conditions in which both the human small intestinal crypt and villus zones can be generated ex vivo from surgical tissues or tissue biopsies1. These cultures are bridging the gap between animal studies and clinical trials and are revealing previously unrecognized cell biology, biochemistry, and physiology of the gastrointestinal tract. The HIOs are propagated as 3D spherical structures using a media with growth factors that promote stem cell viability and extracellular support matrices. These conditions result in a crypt-like HIO model that consists mostly of progenitors and stem cells. Removal of the growth factors promotes ISC differentiation (villus-like model) and production of mature intestinal epithelial cells (goblet, enteroendocrine, tuft, enterocyte) in appropriate ratios along with cell proliferation and differentiation, polarization, barrier integrity, regional specific features, and appropriate physiological responses2. HIO cultures are genetically stable and can be propagated indefinitely in their crypt-like state. Easy access to the apical surface of these cultures is provided by culture conditions that allow growth in a monolayer format3. HIOs also allow considerations of host individual variability such as genetics, age, sex, ethnicity, and disease status to be included in biological analyses. Analytic and functional assessment tools are identical to those used in approaches centered on transformed cell lines and include a variety of molecular techniques such as flow cytometry, microscopy, transcriptomics, proteomics, and metabolomics.
Single cell transcriptomics is revolutionizing our understanding of the biology and physiology of the small intestine by providing insight into the individual contributions of each cell type to a biological process. Pioneering work using this technology has provided a landscape of the cell types present in the native human intestine4,5,6. Single cell transcriptional profiling platforms allow exploration of the transcriptional landscape of individual cells, allowing cell heterogeneity to come to the forefront of scientific exploration. In some single cell transcriptional profiling platforms, microfluidic partitioning and barcoding are used to generate cDNA libraries from cellular polyadenylated mRNAs obtained from up to 10,000 cells per sample. On this platform, droplets containing single cells, barcoded oligonucleotides, reverse transcription reagents, and oil form a reaction vesicle that results in all cDNAs from a single cell having the same barcode. The barcoded cDNAs can then be efficiently sequenced using next generation sequencing. Data generated can be handled through software and visualization tools, which convert the barcoded sequences into visualization maps and single cell transcriptional profiles. Cell populations can be identified using publicly available databases of human small intestinal epithelium4,5,6. Although many studies have utilized this platform to interrogate murine intestinal organoids at the single cell level, the analysis of single cell transcriptional responses of HIOs has lagged behind7,8,9,10,11,12.
Here, we provide a step-by-step guide to isolating viable cells from small intestinal HIOs for processing on single cell transcriptional profiling platforms (Figure 1). We provide culturing and differentiation guidelines along with media components that have been optimized for epithelial differentiation. We outline cell recovery methods for three different culture formats: three dimensional (3D) and monolayer cultures either on plastic or on membrane cell culture inserts. We provide sample clustering data obtained using open-source software to derive differentially expressed genes in each cluster.

Pleins feux sur l’auteur : Intégration de la transcriptomique unicellulaire aux cultures d’organoïdes pour une recherche avancée et des connaissances thérapeutiques

Utilisation d’organoïdes intestinaux humains pour comprendre l’épithélium de l’intestin grêle au niveau transcriptionnel d’une seule cellule

We are integrating single-cell transcriptomics and organoid technology to better understand the biology of the small intestine. These technologies are allowing us deeper insight into the cellular heterogeneity that exists within that tissue. The tools that improve the throughput, sensitivity, and the resolutions are the keys that advanced research in the field.Some examples are improved computational methods and the technological innovations. Cost reductions also a major focus. The process of preparing and sequencing the libraries of samples can cause transcription variations, which is one challenge.For organoids, specific challenges include limited spatial context or information about temporal dynamics. Single-cell analysis of the human intestinal organoids provides previously unattainable information into the cell types that make up the intestinal epithelium. This, thereby, opens the window to the transcriptional landscape of those cells.We are using these technologies to identify biomarkers and mechanisms of human intestinal diseases. These biomarkers and mechanisms will advance our ability to utilize personalized medicine-based approaches to treat human disease and improve human health overall.

Des suspensions unicellulaires ont été regroupées à partir de 2 à 3 puits d’insert de culture cellulaire membranaire, de monocouche et de HIO 3D pour assurer un rendement cellulaire suffisant et réduire les variations d’un puits à l’autre. Des banques de cellules uniques ont été préparées à l’aide de réactifs spécifiques à la plateforme de profilage transcriptionnel de cellule unique. et séquencé avec des lectures d’extrémité appariées sur une plate-forme de séquençage de nouvelle généra...

Le protocole combine la technologie des organoïdes intestinaux humains avec l’analyse transcriptomique d’une seule cellule pour fournir des informations significatives sur la biologie intestinale jusqu’alors inexplorée.

Single cell transcriptomics has revolutionized our understanding of the cell biology of the human body. State-of-the-art human small intestinal organoid ...

using-human-intestinal-organoids-to-understand-small-intestine

Research

JoVE Journal

Biology

Using Human Intestinal Organoids to Understand the Small Intestine Epithelium at the Single Cell Transcriptional Level

339 Views.  Baylor College of Medicine. We are integrating single-cell transcriptomics and organoid technology to better understand the biology of the small intestine. These technologies are allowing us deeper insight into the cellular heterogeneity that exists within that tissue. The tools that improve the throughput, sensitivity, and the resolutions are the keys that advanced research in the field.Some examples are improved computational methods and the technological innovations. Cost reductions also a major focus. The pro...