Forfatterne anerkjenner U19 AI157984, U01 DK103168, U19 AI144297, P30 DK56338, P01 AI057788, U19 AI116497 og NASA Cooperative Agreement Notice/TRISH NNX16AO69A.

Organoidlinjene som ble brukt her ble hentet fra Texas Medical Center Digestive Disease Center GEMS Core. Kort sagt, for først å etablere organoidlinjer, ble donorvevsprøver vasket og enzymatisk fordøyd for å frigjøre tarmkrypterne. Krypter ble innebygd i en kjellermembran og dyrket i et medium. Institutional Review Board ved Baylor College of Medicine godkjente studieprotokollen for å få vevsprøver som organoidlinjer ble etablert fra, og informert samtykke ble innhentet fra alle givere for å etablere organoidl...

Integrering av encellet transkriptomikk med humane tarmorganoider

<ol>
	<li>Sato, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+expansion+of+epithelial+organoids+from+human+colon,+adenoma,+adenocarcinoma,+and+Barrett's+epithelium.">Long-term expansion of epithelial organoids from human colon, adenoma, adenocarcinoma, and Barrett's epithelium.</a> Gastroenterology. 141 (5), 1762-1772 (2011).</li><li>Blutt, S. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gastrointestinal+microphysiological+systems.">Gastrointestinal microphysiological systems.</a> Exp Biol Med. 242 (16), 1633-1642 (2017).</li><li>VanDussen, K. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+an+enhanced+human+gastrointestinal+epithelial+culture+system+to+facilitate+patient-based+assays.">Development of an enhanced human gastrointestinal epithelial culture system to facilitate patient-based assays.</a> Gut. 64 (6), 911-920 (2015).</li><li>Elmentaite, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cells+of+the+human+intestinal+tract+mapped+across+space+and+time.">Cells of the human intestinal tract mapped across space and time.</a> Nature. 597 (7875), 250-255 (2021).</li><li>Hickey, J. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organization+of+the+human+intestine+at+single-cell+resolution.">Organization of the human intestine at single-cell resolution.</a> Nature. 619 (7970), 572-584 (2023).</li><li>Burclaff, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+proximal-to-distal+survey+of+healthy+adult+human+small+intestine+and+colon+epithelium+by+single-cell+transcriptomics.">A proximal-to-distal survey of healthy adult human small intestine and colon epithelium by single-cell transcriptomics.</a> Cell Mol Gastroenterol Hepatol. 13 (5), 1554-1589 (2022).</li><li>Triana, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+transcriptomics+reveals+immune+response+of+intestinal+cell+types+to+viral+infection.">Single-cell transcriptomics reveals immune response of intestinal cell types to viral infection.</a> Mol Syst Biol. 17 (7), e9833 (2021).</li><li>Triana, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+analyses+reveal+SARS-CoV-2+interference+with+intrinsic+immune+response+in+the+human+gut.">Single-cell analyses reveal SARS-CoV-2 interference with intrinsic immune response in the human gut.</a> Mol Syst Biol. 17 (4), e10232 (2021).</li><li>Fujii, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+intestinal+organoids+maintain+self-renewal+capacity+and+cellular+diversity+in+niche-inspired+culture+condition.">Human intestinal organoids maintain self-renewal capacity and cellular diversity in niche-inspired culture condition.</a> Cell Stem Cell. 23 (6), 787-793 (2021).</li><li>Beumer, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BMP+gradient+along+the+intestinal+villus+axis+controls+zonated+enterocyte+and+goblet+cell+states.">BMP gradient along the intestinal villus axis controls zonated enterocyte and goblet cell states.</a> Cell Rep. 38 (9), 110438 (2022).</li><li>Beumer, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-resolution+mRNA+and+secretome+atlas+of+human+enteroendocrine+cells.">High-resolution mRNA and secretome atlas of human enteroendocrine cells.</a> Cell. 182 (4), 1062-1064 (2020).</li><li>Busslinger, G. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+gastrointestinal+epithelia+of+the+esophagus,+stomach,+and+duodenum+resolved+at+single-cell+resolution.">Human gastrointestinal epithelia of the esophagus, stomach, and duodenum resolved at single-cell resolution.</a> Cell Rep. 34 (10), 108819 (2021).</li><li>Luecken, M. D., Theis, F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Current+best+practices+in+single-cell+RNA-seq+analysis:+a+tutorial.">Current best practices in single-cell RNA-seq analysis: a tutorial.</a> Mol Syst Biol. 15 (6), e8746 (2019).</li><li>Heumos, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Best+practices+for+single-cell+analysis+across+modalities.">Best practices for single-cell analysis across modalities.</a> Nat Rev Genet. 24 (8), 550-572 (2023).</li></ol>

Forfatterne har ingen interessekonflikter.

Ved å bruke enkeltcellegenomikkplattformer kan komplekse biologiske systemer, for eksempel vevsavledede HIO-kulturer som modellerer tarmepitelet, brytes ned for å gi individuelle cellulære bidrag til total biologisk respons 4,5,6. Cellulær heterogenitet og sjeldne cellepopulasjoner kan også identifiseres og avhøres. Cellulær inngang må optimaliseres for å maksimere utdata ved hjelp av enkeltcelle transkriptomiske basert...

Tynntarmepitelet har to distinkte soner: krypten som huser tarmstamcellen (ISC) og villus, som består av differensierte celler fra sekretoriske og absorptive avstamninger. I tillegg til denne kompleksiteten er den regionale spesifisiteten til epitelet som gir unike funksjonelle egenskaper mellom regionene i tynntarmen. Banebrytende arbeid etablerte kulturforhold der både den menneskelige tynntarmskrypten og villussonene kan genereres ex vivo fra kirurgisk vev eller vevsbiopsier1. Disse kulturene bygger bro mellom dyrestudier og kliniske studier og avslører tidligere ukjent cellebiologi, biokjemi og fysiologi i mage-tarmkanalen. HIO-ene forplantes som 3D sfæriske strukturer ved hjelp av et medium med vekstfaktorer som fremmer stamcellelevedyktighet og ekstracellulære støttematriser. Disse forholdene resulterer i en kryptlignende HIO-modell som hovedsakelig består av forfedre og stamceller. Fjerning av vekstfaktorene fremmer ISC-differensiering (villus-lignende modell) og produksjon av modne tarmepitelceller (beger, enteroendokrine, tuft, enterocytt) i passende forhold sammen med celleproliferasjon og differensiering, polarisering, barriereintegritet, regionale spesifikke egenskaper og passende fysiologiske responser2. HIO-kulturer er genetisk stabile og kan forplantes på ubestemt tid i sin kryptlignende tilstand. Enkel tilgang til den apikale overflaten til disse kulturene er gitt av kulturforhold som tillater vekst i et monolagsformat3. HIO-er tillater også at vurderinger av vertsindividuell variasjon som genetikk, alder, kjønn, etnisitet og sykdomsstatus inkluderes i biologiske analyser. Analytiske og funksjonelle vurderingsverktøy er identiske med de som brukes i tilnærminger sentrert om transformerte cellelinjer og inkluderer en rekke molekylære teknikker som flowcytometri, mikroskopi, transkriptomikk, proteomikk og metabolomikk.
Enkeltcelletranskriptomikk revolusjonerer vår forståelse av tynntarmens biologi og fysiologi ved å gi innsikt i de individuelle bidragene til hver celletype til en biologisk prosess. Banebrytende arbeid ved bruk av denne teknologien har gitt et landskap av celletypene som er tilstede i den opprinnelige menneskelige tarmen 4,5,6. Enkeltcelle transkripsjonsprofileringsplattformer tillater utforskning av transkripsjonslandskapet til individuelle celler, slik at celleheterogenitet kan komme i forkant av vitenskapelig utforskning. I noen enkeltcelletranskripsjonsprofileringsplattformer brukes mikrofluidisk partisjonering og strekkoding for å generere cDNA-biblioteker fra cellulære polyadenylerte mRNA-er oppnådd fra opptil 10 000 celler per prøve. På denne plattformen danner dråper som inneholder enkeltceller, strekkodede oligonukleotider, revers transkripsjonsreagenser og olje en reaksjonsvesikkel som resulterer i at alle cDNA fra en enkelt celle har samme strekkode. De strekkodede cDNA-ene kan deretter sekvenseres effektivt ved hjelp av neste generasjons sekvensering. Data som genereres kan håndteres gjennom programvare og visualiseringsverktøy, som konverterer de strekkkodede sekvensene til visualiseringskart og enkeltcelletranskripsjonsprofiler. Cellepopulasjoner kan identifiseres ved hjelp av offentlig tilgjengelige databaser av humant tynntarmsepitel 4,5,6. Selv om mange studier har brukt denne plattformen til å undersøke murine tarmorganoider på enkeltcellenivå, har analysen av enkeltcelletranskripsjonsresponser fra HIOer ligget bak 7,8,9,10,11,12.
Her gir vi en trinn-for-trinn-guide for å isolere levedyktige celler fra tynntarms-HIOer for prosessering på enkeltcelletranskripsjonsprofileringsplattformer (figur 1). Vi gir retningslinjer for dyrking og differensiering sammen med mediekomponenter som er optimalisert for epiteldifferensiering. Vi skisserer cellegjenopprettingsmetoder for tre forskjellige kulturformater: tredimensjonale (3D) og monolagskulturer enten på plast eller på membrancellekulturinnsatser. Vi gir eksempler på klyngedata innhentet ved hjelp av åpen kildekode-programvare for å utlede differensielt uttrykte gener i hver klynge.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>[Leu15]-Gastrin I</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G9145</td>
			<td>10 nM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.05% Trypsin-EDTA</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>25300054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.4% Trypan blue</td>
			<td>Millipore-Sigma</td>
			<td>T8154</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.5 M EDTA</td>
			<td>Corning</td>
			<td>46-034-CI</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1x PBS Ca- Mg-</td>
			<td>Corning</td>
			<td>21-040-CM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24 mm Transwell</td>
			<td>Costar</td>
			<td>3412</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24 well Nunclon delta surface tissue culture dish</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>142475</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>40 &#181;m cell strainer</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>352340</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>40 &#181;m Flowmi tip strainer</td>
			<td>SP Bel-Art Labware</td>
			<td>H13680-0040</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>70 &#181;m Flowmi tip strainer</td>
			<td>SP Bel-Art Labware</td>
			<td>H13680-0070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96 well plate</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3595</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>A-83-01</td>
			<td>Tocris</td>
			<td>2939</td>
			<td>500 nM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Accutase</td>
			<td>StemCell Technologies</td>
			<td>7920</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Advanced DMEM/F12</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>12634-028</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B27 supplement</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>17504-044</td>
			<td>1X</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chromium Next GEM Single Cell 3&#8217; GEM, Library &#38; Gel Bead Kit v3.1</td>
			<td>10x Genomics</td>
			<td>PN-1000128</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagen IV</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C5533-5MG</td>
			<td>33 &#181;g/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning Cell Recovery Solution&#160;</td>
			<td>VWR</td>
			<td>354253</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS (Mg2-, Ca2-)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>14190-136</td>
			<td>1X</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GlutaMAX-I</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>35050-061</td>
			<td>2 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES 1M</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15630-080</td>
			<td>10 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-WRN conditioned media</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CRL-3276</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matrigel, GFR, phenol free</td>
			<td>Corning</td>
			<td>356231</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mouse recombinant EGF</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>PMG8043</td>
			<td>50 ng/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N2 supplement</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>17502-048</td>
			<td>1X</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-Acetylcysteine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A9165-5G</td>
			<td>500 &#181;M</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nicotinamide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>N0636</td>
			<td>10 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SB202190</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S7067</td>
			<td>10 &#181;M</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transwell</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3413</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Y27632</td>
			<td>Stem Cell Technologies</td>
			<td>72308</td>
			<td>10 &#181;M</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

using human intestinal organoids to understand the small intestine epithelium at the single cell transcriptional level

Enkeltcelletranskriptomikk har revolusjonert vår forståelse av cellebiologien til menneskekroppen. Toppmoderne humane tynntarmsorganoidkulturer gir ex vivo-modellsystemer som bygger bro mellom dyremodeller og kliniske studier. Anvendelsen av enkeltcelletranskriptomikk på humane tarmorganoidmodeller (HIO) avslører tidligere ukjent cellebiologi, biokjemi og fysiologi i mage-tarmkanalen. De avanserte enkeltcelletranskriptomikkplattformene bruker mikrofluidisk partisjonering og strekkoding for å generere cDNA-biblioteker. Disse strekkodede cDNA-ene kan enkelt sekvenseres av neste generasjons sekvenseringsplattformer og brukes av ulike visualiseringsverktøy for å generere kart. Her beskriver vi metoder for å dyrke og differensiere humane tynntarms-HIOer i forskjellige formater og prosedyrer for å isolere levedyktige celler fra disse formatene som er egnet for bruk i encellede transkripsjonsprofileringsplattformer. Disse protokollene og prosedyrene letter bruken av tynntarms-HIOer for å oppnå en økt forståelse av den cellulære responsen til humant tarmepitel på transkripsjonsnivå i sammenheng med en rekke forskjellige miljøer.

The small intestinal epithelium has two distinct zones: the crypt that houses the intestinal stem cell (ISC) and the villus, which is comprised of differentiated cells of the secretory and absorptive lineages. Adding to this complexity is the regional specificity of the epithelium that provides unique functional properties between the regions of the small intestine. Pioneering work established culture conditions in which both the human small intestinal crypt and villus zones can be generated ex vivo from surgical tissues or tissue biopsies1. These cultures are bridging the gap between animal studies and clinical trials and are revealing previously unrecognized cell biology, biochemistry, and physiology of the gastrointestinal tract. The HIOs are propagated as 3D spherical structures using a media with growth factors that promote stem cell viability and extracellular support matrices. These conditions result in a crypt-like HIO model that consists mostly of progenitors and stem cells. Removal of the growth factors promotes ISC differentiation (villus-like model) and production of mature intestinal epithelial cells (goblet, enteroendocrine, tuft, enterocyte) in appropriate ratios along with cell proliferation and differentiation, polarization, barrier integrity, regional specific features, and appropriate physiological responses2. HIO cultures are genetically stable and can be propagated indefinitely in their crypt-like state. Easy access to the apical surface of these cultures is provided by culture conditions that allow growth in a monolayer format3. HIOs also allow considerations of host individual variability such as genetics, age, sex, ethnicity, and disease status to be included in biological analyses. Analytic and functional assessment tools are identical to those used in approaches centered on transformed cell lines and include a variety of molecular techniques such as flow cytometry, microscopy, transcriptomics, proteomics, and metabolomics.
Single cell transcriptomics is revolutionizing our understanding of the biology and physiology of the small intestine by providing insight into the individual contributions of each cell type to a biological process. Pioneering work using this technology has provided a landscape of the cell types present in the native human intestine4,5,6. Single cell transcriptional profiling platforms allow exploration of the transcriptional landscape of individual cells, allowing cell heterogeneity to come to the forefront of scientific exploration. In some single cell transcriptional profiling platforms, microfluidic partitioning and barcoding are used to generate cDNA libraries from cellular polyadenylated mRNAs obtained from up to 10,000 cells per sample. On this platform, droplets containing single cells, barcoded oligonucleotides, reverse transcription reagents, and oil form a reaction vesicle that results in all cDNAs from a single cell having the same barcode. The barcoded cDNAs can then be efficiently sequenced using next generation sequencing. Data generated can be handled through software and visualization tools, which convert the barcoded sequences into visualization maps and single cell transcriptional profiles. Cell populations can be identified using publicly available databases of human small intestinal epithelium4,5,6. Although many studies have utilized this platform to interrogate murine intestinal organoids at the single cell level, the analysis of single cell transcriptional responses of HIOs has lagged behind7,8,9,10,11,12.
Here, we provide a step-by-step guide to isolating viable cells from small intestinal HIOs for processing on single cell transcriptional profiling platforms (Figure 1). We provide culturing and differentiation guidelines along with media components that have been optimized for epithelial differentiation. We outline cell recovery methods for three different culture formats: three dimensional (3D) and monolayer cultures either on plastic or on membrane cell culture inserts. We provide sample clustering data obtained using open-source software to derive differentially expressed genes in each cluster.

Forfatter Spotlight: Integrering av encellet transkriptomikk med organoidkulturer for avansert forskning og terapeutisk innsikt

Bruke humane tarmorganoider for å forstå tynntarmsepitelet på enkeltcelletranskripsjonsnivå

We are integrating single-cell transcriptomics and organoid technology to better understand the biology of the small intestine. These technologies are allowing us deeper insight into the cellular heterogeneity that exists within that tissue. The tools that improve the throughput, sensitivity, and the resolutions are the keys that advanced research in the field.Some examples are improved computational methods and the technological innovations. Cost reductions also a major focus. The process of preparing and sequencing the libraries of samples can cause transcription variations, which is one challenge.For organoids, specific challenges include limited spatial context or information about temporal dynamics. Single-cell analysis of the human intestinal organoids provides previously unattainable information into the cell types that make up the intestinal epithelium. This, thereby, opens the window to the transcriptional landscape of those cells.We are using these technologies to identify biomarkers and mechanisms of human intestinal diseases. These biomarkers and mechanisms will advance our ability to utilize personalized medicine-based approaches to treat human disease and improve human health overall.

Encellede suspensjoner ble samlet fra 2-3 brønner med membrancellekulturinnsats, monolag og 3D HIOer for å sikre tilstrekkelig celleutbytte og redusere brønn-til-brønn-variasjon. Enkeltcellebiblioteker ble fremstilt ved hjelp av reagenser som er spesifikke for enkeltcelletranskripsjonsprofileringsplattformen. og sekvensert med sammenkoblede sluttavlesninger på en neste generasjons sekvenseringsplattform, 30 000 avlesninger/celle. Avlesninger ble kartlagt, telt og analysert ved hjelp av analytiske verktøy for enkelt...

Protokollen kombinerer human tarmorganoidteknologi med enkeltcelle transkriptomisk analyse for å gi betydelig innsikt i tidligere uutforsket tarmbiologi.

Single cell transcriptomics has revolutionized our understanding of the cell biology of the human body. State-of-the-art human small intestinal organoid ...

using-human-intestinal-organoids-to-understand-small-intestine

Research

JoVE Journal

Biology

Using Human Intestinal Organoids to Understand the Small Intestine Epithelium at the Single Cell Transcriptional Level

339 Views.  Baylor College of Medicine. We are integrating single-cell transcriptomics and organoid technology to better understand the biology of the small intestine. These technologies are allowing us deeper insight into the cellular heterogeneity that exists within that tissue. The tools that improve the throughput, sensitivity, and the resolutions are the keys that advanced research in the field.Some examples are improved computational methods and the technological innovations. Cost reductions also a major focus. The pro...