ويدعم هذا العمل رابطة تشجيع الابتكار للشباب CAS (2021084) وصندوق دعم مشروع النشر الرئيسي لخطة العمل الثلاثية لمعهد علم الأحياء الدقيقة ، الأكاديمية الصينية للعلوم.

1. تحضير نباتات N. benthamiana
<ol><li>ضع كتل الشتلات في صينية ، أضف 1 لتر من الماء وانقعه لمدة 2 ساعة تقريبا حتى يتشبع تماما.</li>
	<li>يرش بالتساوي بذور N. benthamiana من النوع البري على كتل الشتلات ، ويغطى بغطاء ، وينبت لمدة 1 أسبوع. تنمو N. benthamiana في دفيئة مع فترة ضوئية 1...

كفاءة استخراج وتنقية GFP-HIS من أوراق N. benthamiana

<ol>
	<li>Zahmanova, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Green+biologics:+Harnessing+the+power+of+plants+to+produce+pharmaceuticals.">Green biologics: Harnessing the power of plants to produce pharmaceuticals.</a> Int J Mol Sci. 24 (24), 1757 (2023).</li><li>PREVAIL Writing Group. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+randomized,+controlled+trial+of+ZMapp+for+Ebola+virus+infection.">A randomized, controlled trial of ZMapp for Ebola virus infection.</a> N Engl J Med. 375 (15), 1448-1456 (2016).</li><li>Ma, J. K. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulatory+approval+and+a+first-in-human+phase+I+clinical+trial+of+a+monoclonal+antibody+produced+in+transgenic+tobacco+plants.">Regulatory approval and a first-in-human phase I clinical trial of a monoclonal antibody produced in transgenic tobacco plants.</a> Plant Biotechnol J. 13 (8), 1106-1120 (2015).</li><li>Shanmugaraj, B., Rattanapisit, K., Manopwisedjaroen, S., Thitithanyanont, A., Phoolcharoen, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monoclonal+antibodies+B38+and+H4+produced+in+Nicotiana+benthamiana+neutralize+SARS-CoV-2+in+vitro.">Monoclonal antibodies B38 and H4 produced in Nicotiana benthamiana neutralize SARS-CoV-2 in vitro.</a> Front Plant Sci. 11, 589995 (2020).</li><li>Takeyama, N., Kiyono, H., Yuki, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plant-based+vaccines+for+animals+and+humans:+Recent+advances+in+technology+and+clinical+trials.">Plant-based vaccines for animals and humans: Recent advances in technology and clinical trials.</a> Ther Adv Vaccines. 3 (5-6), 139-154 (2015).</li><li>Ward, B. J., S&#233;guin, A., Couillard, J., Tr&#233;panier, S., Landry, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phase+III:+Randomized+observer-blind+trial+to+evaluate+lot-to-lot+consistency+of+a+new+plant-derived+quadrivalent+virus+like+particle+influenza+vaccine+in+adults+18-49+years+of+age.">Phase III: Randomized observer-blind trial to evaluate lot-to-lot consistency of a new plant-derived quadrivalent virus like particle influenza vaccine in adults 18-49 years of age.</a> Vaccine. 39 (10), 1528-1533 (2021).</li><li>Siriwattananon, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plant-produced+receptor-binding+domain+of+SARS-CoV-2+elicits+potent+neutralizing+responses+in+mice+and+non-human+primates.">Plant-produced receptor-binding domain of SARS-CoV-2 elicits potent neutralizing responses in mice and non-human primates.</a> Front Plant Sci. 12, 682953 (2021).</li><li>Leblanc, Z., Waterhouse, P., Bally, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plant-based+vaccines:+The+way+ahead.">Plant-based vaccines: The way ahead.</a> Viruses. 13 (1), 5 (2020).</li><li>Sethi, L., Kumari, K., Dey, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineering+of+plants+for+efficient+production+of+therapeutics.">Engineering of plants for efficient production of therapeutics.</a> Mol Biotechnol. 63 (12), 1125-1137 (2021).</li><li>Webster, D. E., Thomas, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Post-translational+modification+of+plant-made+foreign+proteins;+glycosylation+and+beyond.">Post-translational modification of plant-made foreign proteins; glycosylation and beyond.</a> Biotechnol Adv. 30 (2), 410-418 (2012).</li><li>Streatfield, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Approaches+to+achieve+high-level+heterologous+protein+production+in+plants.">Approaches to achieve high-level heterologous protein production in plants.</a> Plant Biotechnol J. 5 (1), 2-15 (2007).</li><li>Nandi, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Process+development+and+economic+evaluation+of+recombinant+human+lactoferrin+expressed+in+rice+grain.">Process development and economic evaluation of recombinant human lactoferrin expressed in rice grain.</a> Transgenic Res. 14 (3), 237-249 (2005).</li><li>Ullrich, K. K., Hiss, M., Rensing, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Means+to+optimize+protein+expression+in+transgenic+plants.">Means to optimize protein expression in transgenic plants.</a> Curr Opin Biotechnol. 32, 61-67 (2015).</li><li>Su, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plant-made+vaccines+against+viral+diseases+in+humans+and+farm+animals.">Plant-made vaccines against viral diseases in humans and farm animals.</a> Front Plant Sci. 14, 1170815 (2023).</li><li>Agrawal, G. K., Jwa, N. S., Lebrun, M. H., Job, D., Rakwal, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plant+secretome:+Unlocking+secrets+of+the+secreted+proteins.">Plant secretome: Unlocking secrets of the secreted proteins.</a> Proteomics. 10 (4), 799-827 (2010).</li><li>Kim, T., Gondr&#233;-Lewis, M. C., Arnaoutova, I., Loh, Y. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dense-core+secretory+granule+biogenesis.">Dense-core secretory granule biogenesis.</a> Physiology. 21, 124-133 (2006).</li><li>Menkhaus, T. J., Bai, Y., Zhang, C., Nikolov, Z. L., Glatz, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Considerations+for+the+recovery+of+recombinant+proteins+from+plants.">Considerations for the recovery of recombinant proteins from plants.</a> Biotechnol Prog. 20 (4), 1001-1014 (2004).</li><li>Kim, S. T., Cho, K. S., Jang, Y. S., Kang, K. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two-dimensional+electrophoretic+analysis+of+rice+proteins+by+polyethylene+glycol+fractionation+for+protein+arrays.">Two-dimensional electrophoretic analysis of rice proteins by polyethylene glycol fractionation for protein arrays.</a> Electrophoresis. 22 (10), 2103-2109 (2001).</li><li>Xi, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polyethylene+glycol+fractionation+improved+detection+of+low-abundant+proteins+by+two-dimensional+electrophoresis+analysis+of+plant+proteome.">Polyethylene glycol fractionation improved detection of low-abundant proteins by two-dimensional electrophoresis analysis of plant proteome.</a> Phytochemistry. 67 (21), 2341-2348 (2006).</li><li>Dani, V., Simon, W. J., Duranti, M., Croy, R. R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Changes+in+the+tobacco+leaf+apoplast+proteome+in+response+to+salt+stress.">Changes in the tobacco leaf apoplast proteome in response to salt stress.</a> Proteomics. 5 (3), 737-745 (2005).</li><li>Delaunois, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Uncovering+plant-pathogen+crosstalk+through+apoplastic+proteomic+studies.">Uncovering plant-pathogen crosstalk through apoplastic proteomic studies.</a> Front Plant Sci. 5, 249 (2014).</li><li>Andreasson, E., Abreha, K. B., Resj&#246;, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+apoplast.">Isolation of apoplast.</a> Methods Mol. Biol. 1511, 233-240 (2017).</li><li>Lohaus, G., Pennewiss, K., Sattelmacher, B., Hussmann, M., Hermann, M. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Is+the+infiltration-centrifugation+technique+appropriate+for+the+isolation+of+apoplastic+fluid?+A+critical+evaluation+with+different+plant+species.">Is the infiltration-centrifugation technique appropriate for the isolation of apoplastic fluid? A critical evaluation with different plant species.</a> Physiol Plant. 111 (4), 457-465 (2001).</li><li>Nouchi, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Overcoming+the+difficulties+in+collecting+apoplastic+fluid+from+rice+leaves+by+the+infiltration-centrifugation+method.">Overcoming the difficulties in collecting apoplastic fluid from rice leaves by the infiltration-centrifugation method.</a> Plant Cell Physiol. 53 (9), 1659-1668 (2012).</li><li>Rumyantseva, N. I., Valieva, A. I., Kostyukova, Y. A., Ageeva, M. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effect+of+leaf+plasticity+on+the+isolation+of+apoplastic+fluid+from+leaves+of+tartary+buckwheat+plants+grown+in+vivo+and+in+vitro.">The effect of leaf plasticity on the isolation of apoplastic fluid from leaves of tartary buckwheat plants grown in vivo and in vitro.</a> Plants. 12 (23), 4048 (2023).</li><li>Ekanayake, G., Gohmann, R., Mackey, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+method+for+quantitation+of+apoplast+hydration+in+Arabidopsis+leaves+reveals+water-soaking+activity+of+effectors+of+Pseudomonas+syringae+during+biotrophy.">A method for quantitation of apoplast hydration in Arabidopsis leaves reveals water-soaking activity of effectors of Pseudomonas syringae during biotrophy.</a> Sci Rep. 12 (1), 18363 (2022).</li><li>Preston, G. M., Fones, H. N., Mccraw, S., Rico, A., O'leary, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+infiltration-centrifugation+technique+for+extraction+of+apoplastic+fluid+from+plant+leaves+using+phaseolus+vulgaris+as+an+example.">The infiltration-centrifugation technique for extraction of apoplastic fluid from plant leaves using phaseolus vulgaris as an example.</a> J Vis Exp. (94), e52113 (2014).</li><li>Nandi, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Process+development+and+economic+evaluation+of+recombinant+human+lactoferrin+expressed+in+rice+grain.">Process development and economic evaluation of recombinant human lactoferrin expressed in rice grain.</a> Transgenic Res. 14 (3), 237-249 (2005).</li><li>Menkhaus, T. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Considerations+for+the+recovery+of+recombinant+proteins+from+plants.">Considerations for the recovery of recombinant proteins from plants.</a> Biotechnol Prog. 20 (4), 1001-1014 (2004).</li><li>Streatfield, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Approaches+to+achieve+high-level+heterologous+protein+production+in+plants.">Approaches to achieve high-level heterologous protein production in plants.</a> Plant Biotechnol J. 5 (1), 2-15 (2007).</li><li>Yamamoto, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improvement+of+the+transient+expression+system+for+production+of+recombinant+proteins+in+plants.">Improvement of the transient expression system for production of recombinant proteins in plants.</a> Sci Rep. 8 (1), 4755 (2018).</li><li>Zhao, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wheat+Apoplast-localized+lipid+transfer+protein+TaLTP3+enhances+defense+responses+against+Puccinia+triticina.">Wheat Apoplast-localized lipid transfer protein TaLTP3 enhances defense responses against Puccinia triticina.</a> Front Plant Sci. 12, 771806 (2021).</li><li>Venkataraman, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recent+advances+in+expression+and+purification+strategies+for+plant+made+vaccines.">Recent advances in expression and purification strategies for plant made vaccines.</a> Front Plant Sci. 14, 1273958 (2023).</li><li>Witzel, K., Shahzad, M., Matros, A., Mock, H. P., M&#252;hling, K. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+evaluation+of+extraction+methods+for+apoplastic+proteins+from+maize+leaves.">Comparative evaluation of extraction methods for apoplastic proteins from maize leaves.</a> Plant Meth. 7, 48 (2011).</li></ol>

يعلن أصحاب البلاغ عدم وجود تضارب في المصالح.

توسع استخدام النباتات لإنتاج البروتينات العلاجية بسرعة في السنوات الأخيرة1،2،3،4،5،6. يتم استنساخ الجينات المشفرة للبروتين في ناقلات التعبير وتسليمها إلى أنسجة النبات عن طريق الار...

في الوقت الحاضر ، هناك العديد من البروتينات العلاجية المؤتلفة المنتجة في النباتات قيد الدراسة ، بما في ذلك الأجسام المضادة واللقاحات والبروتينات النشطة بيولوجيا والإنزيمات والببتيدات الصغيرة1،2،3،4،5،6. أصبحت النباتات منصة مستخدمة بشكل متزايد لإنتاج البروتينات العلاجية نظرا لسلامتها وتكلفتها المنخفضة وقدرتها على توسيع نطاق الإنتاج بسرعة 7,8. يعد التعبير عن البروتين وتعديله في الأنظمة النباتية ، إلى جانب تنقية البروتين ، من العوامل الحاسمة التي تحدد إنتاجية المفاعلات الحيوية النباتية 9,10. يعد تعزيز إنتاجية النبات والحصول على بروتينات مستهدفة عالية النقاء من التحديات الأساسية التي تواجه أنظمة الإنتاج النباتية11,12.
يعتمد توطين البروتينات تحت الخلوية وتعديلها على ببتيد الإشارة المحدد المشفر في N-terminus ، والذي يستهدف البروتين إلى وجهته العضية النهائية أثناء التعبير الجيني. تم تصميم البروتينات المؤتلفة للتوطين في apoplast أو الشبكة الإندوبلازمية (ER) أو البلاستيدات الخضراء أو الفجوة أو السيتوبلازم ، بناء على خصائصها الفريدة13. بالنسبة للمستضدات والأجسام المضادة ، يفضل البروتينات المفرزة. قبل الإفراز ، تتقدم البروتينات من خلال ER و Golgi للطي الصحيح والتعديلات اللاحقةللترجمة 14،15،16.
بعد الإنتاج في النباتات ، يجب تنقية البروتينات المؤتلفة من المستخلصات النباتية. عادة ، يتم تنقية البروتينات من المستخلصات النباتية الكلية القابلة للذوبان ، والتي تحتوي على بروتينات وفيرة داخل الخلايا ، ومنتجات غير مطوية وغير معدلة ، والسيتوكرومات17. لإزالة الشوائب ، تخضع المستخلصات النباتية لتجزئة واسعة النطاق ، بما في ذلك كروماتوغرافيا التقارب الخاصة بالريبولوز -1،5-ثنائي فوسفات الكربوكسيلاز / الأكسجين (RuBisCO) ، ترسيب الفيتات ، ترسيب البولي إيثيلين جلايكول ، وتعديل درجة الحرارة ودرجة الحموضة18,19. خطوات إزالة الشوائب هذه شاقة ويمكن أن تضر بجودة البروتين.
تعرف الحجرة الخلوية للنبات الواقعة خارج الغشاء البلازمي بأنها البلاستيدات الأبوبلية، وتشمل الجدار الخلوي، والفراغات بين الخلوية، ونسيجالخشب 20. يطلق على المرحلة المائية عادة اسم سائل غسيل apoplast (AWF). يحتوي AWF على جزيئات تفرزها الخلايا لتنظيم العديد من التطورات البيولوجية مثل النقل ، واستقلاب جدار الخلية ، واستجابات الإجهاد 21,22. على عكس TSP ، فإن المكونات الجزيئية ل AWF أقل تعقيدا. قد يؤدي استخراج البروتينات المؤتلفة من AWF إلى تجنب التلوث بالبروتينات داخل الخلايا والمنتجات غير المطوية والبقايا السيتوبلازمية. باختصار ، تدخل دهون الاستخراج الأوراق عبر الثغور تحت ضغط سلبي ، ويتم جمع AWF عن طريق الطرد المركزي اللطيف23. في حين يتم استخدام عزل AWF على نطاق واسع لدراسة التقدم البيولوجي داخل apoplast24،25،26،27 ، لم يتم استغلاله في أنظمة الإنتاج النباتية.
يعد تحسين إنتاجية النبات والحصول على بروتينات مستهدفة عالية النقاء من التحديات الرئيسية لأنظمة الإنتاج النباتي28. عادة ، يتم تنقية البروتينات من إجمالي المستخلصات النباتية القابلة للذوبان التي تحتوي على كميات كبيرة من البروتينات داخل الخلايا ، والمنتجات غير المطوية وغير المعدلة ، والسيتوكرومات29 ، والتي تتطلب تكاليف كبيرة للتنقية اللاحقة30. يمكن أن يؤدي استخدام طرق استخراج البروتين AWF لاستخراج البروتينات الخارجية المؤتلفة التي تفرز في apoplast إلى تحسين تجانس البروتينات المؤتلفة بشكل فعال وتقليل تكلفة تنقية البروتين. هنا ، نستخدم إشارة الببتيد PR1a لتمكين إفراز البروتين الخارجي في فضاء apoplast وإدخال طريقة مفصلة لتنقية البروتين المؤتلف من AWF من N. benthamiana.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>100 mesh nylon fine mesh yarn</td>
			<td>Guangzhou Huayu Trading limited company</td>
			<td>hy-230724-2</td>
			<td>For AWF protein extraction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 ml centrifuge tubes</td>
			<td>Vazyme</td>
			<td>TCF00150</td>
			<td>For centrifuge</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ClonExpress II one step cloning kit</td>
			<td>Vazyme</td>
			<td>C112-02</td>
			<td>For clone</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FastDigest Sac1</td>
			<td>NEB</td>
			<td>R3156S</td>
			<td>For clone</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FastDigest XbaI</td>
			<td>NEB</td>
			<td>FD0685</td>
			<td>For clone</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImageJ 1.5.0</td>
			<td>/</td>
			<td>/</td>
			<td>For greyscale analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Large filter</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>NEST</td>
			<td>For filtering</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laser scanning confocal microscopy</td>
			<td>Leica SP8</td>
			<td></td>
			<td>For subcellular localization</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ni sepharose excel</td>
			<td>Cytiva</td>
			<td>10339806</td>
			<td>For protein purification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Precast protein plus gel</td>
			<td>YEASEN</td>
			<td>36246ES10</td>
			<td>For SDS-PAGE</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Small filter</td>
			<td>Nalgene</td>
			<td>1660045</td>
			<td>For filtering</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SuperSignal West Femto Substrate Trial Kit</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>34076</td>
			<td>For western blotting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>SCR</td>
			<td>30188928</td>
			<td>To configure the extraction buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Type rotaryvang vacuum pump</td>
			<td>Zhejiang taizhouqiujing vacuum pump limited company</td>
			<td>2XZ-2</td>
			<td>For vacuum infiltration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vertical mixer</td>
			<td>Haimen Qilinbel Instrument Manufacturing limited company</td>
			<td>BE-1200</td>
			<td>For mixing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#946;-mercaptoethanol</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>BCBK8223V</td>
			<td>To configure the extraction buffer</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

apoplast-extraction based method to improve the purity of plant produced recombinant protein  

النباتات هي نظام تعبير حقيقي النواة تم تطويره حديثا يتم استكشافه لإنتاج بروتينات علاجية. تعد تنقية البروتينات المؤتلفة من النباتات واحدة من أهم الخطوات في عملية الإنتاج. عادة ، تم تنقية البروتينات من البروتينات الكلية القابلة للذوبان (TSP) ، ويشكل وجود بروتينات متنوعة داخل الخلايا والسيتوكرومات تحديات لخطوات تنقية البروتين اللاحقة. علاوة على ذلك ، يتم إفراز معظم البروتينات العلاجية مثل المستضدات والأجسام المضادة للحصول على الجليكوزيل المناسب ، ويؤدي وجود البروتينات المعدلة بشكل غير كامل إلى عدم اتساق هياكل المستضد أو الأجسام المضادة. يقدم هذا العمل طريقة أكثر فعالية للحصول على بروتينات مؤتلفة عالية النقاء من الفضاء اللدائن للنبات. تم تصميم البروتين الفلوري الأخضر المؤتلف (GFP) ليتم إفرازه في منطقة نيكوتيانا بينثاميانا ثم يتم استخراجه باستخدام طريقة الطرد المركزي للتسلل. ثم يتم تنقية GFP-His من apoplast المستخرج بواسطة كروماتوغرافيا تقارب النيكل. على عكس الطرق التقليدية من TSP ، ينتج التنقية من apoplast بروتينات مؤتلفة عالية النقاء. وهذا يمثل تحسنا تكنولوجيا هاما لنظم الإنتاج النباتي.

Nowadays, various plant-produced recombinant therapeutic proteins are under study, including antibodies, vaccines, bioactive proteins, enzymes, and small polypeptides1,2,3,4,5,6. Plants are becoming an increasingly utilized platform for producing therapeutic proteins due to their safety, low cost, and ability to rapidly scale production7,8. Protein expression and modification in plant systems, along with protein purification, are critical factors determining the productivity of plant bioreactors9,10. Enhancing plant productivity and obtaining high-purity target proteins are core challenges facing plant-based production systems11,12.
The subcellular localization and modification of recombinant proteins depends on the specific signal peptide encoded at the N-terminus, which targets the protein to its final organelle destination during gene expression. Recombinant proteins are designed to localize to the apoplast, endoplasmic reticulum (ER), chloroplast, vacuole, or cytoplasm, based on their unique properties13. For antigens and antibodies, secreted proteins are preferred. Before secretion, proteins progress through ER and Golgi for correct folding and post-translational modifications14,15,16.
After production in plants, recombinant proteins must be purified from plant extracts. Typically, proteins are purified from total soluble plant extracts, which contain abundant intracellular proteins, misfolded and unmodified products, and cytochromes17. To remove impurities, plant extracts undergo extensive fractionation, including ribulose-1,5-bisphosphate carboxylase/oxygenase (RuBisCO)-specific affinity chromatography, phytate precipitation, polyethylene glycol precipitation, and adjustment of temperature and pH18,19. Such impurity-removal steps are laborious and can compromise protein quality.
The plant cell compartment beyond the plasma membrane is defined as the apoplast, encompassing the cell wall, intercellular spaces, and xylem20. The aqueous phase is commonly called apoplast washing fluid (AWF). AWF contains molecules secreted by cells to regulate numerous biological progresses like transport, cell wall metabolism, and stress responses21,22. In contrast to TSP, the molecular constituents of AWF are less complex. Extracting recombinant proteins from AWF may avoid contamination by intracellular proteins, misfolded products, and cytoplasmic remnants. Briefly, extraction lipid enters leaves through the stomata under negative pressure, and the AWF is collected by gentle centrifugation23. While isolation of AWF is widely employed to study the biological progress inside apoplast24,25,26,27, it has not been exploited in plant-based production systems.
Improving plant productivity and obtaining high purity target proteins are central challenges for plant production systems28. Typically, proteins are purified from total soluble plant extracts containing large amounts of intracellular proteins, misfolded and unmodified products, and cytochromes29, which require great costs for subsequent purification30. The use of AWF protein extraction methods for the extraction of exogenous recombinant proteins secreted into apoplast can effectively improve the homogeneity of recombinant proteins and reduce the cost of protein purification. Here, we use a signal peptide PR1a to enable exogenous protein secretion into the apoplast space and introduce a detailed method for recombinant protein purification from the AWF of N. benthamiana.

تسليط الضوء على المؤلف: تحسين استخراج بروتين أبوبلاست من أجل الاسترداد الفعال للبروتينات المؤتلفة من الخلايا النباتية

طريقة قائمة على استخراج أبوبلاست لتحسين نقاء البروتين المؤتلف المنتج من النبات  

We investigated how to extract recombinant proteins from plant cells more efficiently. We answered the question of whether the apoplast protein extraction method is feasible when applied to the recombinant proteins. This extraction method extracts proteins secreted into the apoplast, so they have homogeneity.There is no need for cell disruption, which reduce the interference from intracellular proteins and the subsequent purification costs. We will focus on how to increase the secretion of recombinant proteins in the apoplast space to further improve the efficiency of the apoplast protein extraction method.

يستهدف GFP-His للإفراز في الفضاء الأوسلجي ل N. benthamiana تم استنساخ GFP في بلازميد pCAMBIA1300 مع ببتيد إشارة PR1a N-terminal للإفراز وعلامة His-terminal C للتنقية ، مما يولد p35s-PR1a-GFP-HIS (الشكل 1 أ). تم التعبير عن البروتين المؤتلف بشكل عابر في N. benthamiana وتم الكشف عن نطاق 30 كيلو ...

عادة ما تواجه البروتينات النباتية تحديا في تنقية البروتينات المؤتلفة من الأنظمة النباتية. يوفر هذا العمل طريقة لاستخراج وتنقية البروتين المؤتلف المفرز بشكل فعال من أبوبلاست نيكوتيانا بينثاميانا.

Plants are a newly developing eukaryotic expression system being explored to produce therapeutic proteins. Purification of recombinant proteins from ...

apoplast-extraction-based-method-to-improve-purity-plant-produced

Research

JoVE Journal

Biology

Apoplast-Extraction Based Method to Improve the Purity of Plant Produced Recombinant Protein  

625 Views.  Shandong First Medical University. We investigated how to extract recombinant proteins from plant cells more efficiently. We answered the question of whether the apoplast protein extraction method is feasible when applied to the recombinant proteins. This extraction method extracts proteins secreted into the apoplast, so they have homogeneity.There is no need for cell disruption, which reduce the interference from intracellular proteins and the subsequent purification costs. We will focus on how to increase the secretio...