Name: تسليط الضوء على المؤلف: التحليل اللاجيني الشامل للتحقيق في اللدونة الخلوية البشرية والتكيف البيئي باستخدام مقايسات التألق المناعي
Uploaded: 2024-06-28T14:25:00
Description: Various nuclear processes, such as transcriptional control, occur within discrete structures known as foci that are discernable through the ...

نحن نعترف بالمساعدة العلمية والتقنية التي قدمها مرفق التصوير INGM ، ولا سيما C. Cordiglieri و A. Fasciani ، ومرفق الفرز INGM FACS على وجه الخصوص M.C Crosti (المعهد الوطني للجينات Molecolare 'Romeo ed Enrica Invernizzi' (INGM) ، ميلانو ، إيطاليا). نعرب عن تقديرنا للسيد جياناكاري لدعمه المعلوماتي التقني. تم تمويل هذا العمل من خلال المنح التالية: مؤسسة كاريبلو (باندو جيوفاني ، منحة رقم 2018-0321) ومؤسسة AIRC (منحة رقم MFAG 29165) إلى F.M. Ricerca Finalizzata ، (منحة رقم GR-2018-12365280) ، مؤسسة AIRC (منحة رقم 2022 27066) ، مؤسسة كاريبلو (منحة رقم 2019-3416) ، مؤسسة إقليمية للبحوث الحيوية (FRRB CP2_12/2018) ،) البيانو الوطني للريبريزا و Resilienza (منحة رقم G43C22002620007) و Progetti di Rilevante Interesse Nazionale (PRIN) (منحة رقم 2022PKF9S) إلى B. B.

تمت الموافقة على استخدام العينات البشرية لأغراض البحث من قبل لجان الأخلاقيات التابعة لمؤسسة معهد البحوث والوقاية العلمية (IRCCS) Cà Granda Ospedale Maggiore Policlinico (ميلانو) ، وتم الحصول على موافقة مستنيرة من جميع الموضوعات (أرقام الترخيص: 708_2020). يتم تنظيم البروتوكول في ثلاثة أقسام أساسية: تنفيذ التألق ال...

سير عمل تحليل تلطيخ البروتين النووي في الخلايا الأولية البشرية

<ol>
	<li>Aboelnour, E., Bonev, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Decoding+the+organization,+dynamics,+and+function+of+the+4D+genome.">Decoding the organization, dynamics, and function of the 4D genome.</a> Dev Cell. 56 (11), 1562-1573 (2021).</li><li>Erdel, F., Rippe, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Formation+of+chromatin+subcompartments+by+phase+separation.">Formation of chromatin subcompartments by phase separation.</a> Biophys J. 114 (10), 2262-2270 (2018).</li><li>Henninger, J. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA-mediated+feedback+control+of+transcriptional+condensates.">RNA-mediated feedback control of transcriptional condensates.</a> Cell. 184 (1), 207-225 (2021).</li><li>Guo, Y. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pol+II+phosphorylation+regulates+a+switch+between+transcriptional+and+splicing+condensates.">Pol II phosphorylation regulates a switch between transcriptional and splicing condensates.</a> Nature. 572 (7770), 543-548 (2019).</li><li>Bhat, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=3D+genome+organization+around+nuclear+speckles+drives+mRNA+splicing+efficiency.">3D genome organization around nuclear speckles drives mRNA splicing efficiency.</a> bioRxiv. , (2023).</li><li>Spector, D. L., Lamond, A. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nuclear+speckles.">Nuclear speckles.</a> Cold Spring Harb Perspect Biol. 3 (2), a000646 (2011).</li><li>Kilic, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phase+separation+of+53BP1+determines+liquid-like+behavior+of+DNA+repair+compartments.">Phase separation of 53BP1 determines liquid-like behavior of DNA repair compartments.</a> EMBO J. 38 (16), e101379 (2019).</li><li>Parker, M. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+class+of+disordered+elements+controls+DNA+replication+through+initiator+self-assembly.">A new class of disordered elements controls DNA replication through initiator self-assembly.</a> Elife. 8, e48562 (2019).</li><li>Feric, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coexisting+liquid+phases+underlie+nucleolar+subcompartments.">Coexisting liquid phases underlie nucleolar subcompartments.</a> Cell. 165 (7), 1686-1697 (2016).</li><li>Yoneda, M., Nakagawa, T., Hattori, N., Ito, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+nucleolus+from+a+liquid+droplet+perspective.">The nucleolus from a liquid droplet perspective.</a> J Biochem. 170 (2), 153-162 (2021).</li><li>Alberti, S., Carra, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nucleolus:+A+liquid+droplet+compartment+for+misbehaving+proteins.">Nucleolus: A liquid droplet compartment for misbehaving proteins.</a> Curr Biol. 29 (19), R930-R932 (2019).</li><li>Strom, A. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phase+separation+drives+heterochromatin+domain+formation.">Phase separation drives heterochromatin domain formation.</a> Nature. 547 (7662), 241-245 (2017).</li><li>Sanulli, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HP1+reshapes+nucleosome+core+to+promote+phase+separation+of+heterochromatin.">HP1 reshapes nucleosome core to promote phase separation of heterochromatin.</a> Nature. 575 (7782), 390-394 (2019).</li><li>Hyman, A. A., Weber, C. A., Julicher, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Liquid-liquid+phase+separation+in+biology.">Liquid-liquid phase separation in biology.</a> Annu Rev Cell Dev Biol. 30, 39-58 (2014).</li><li>Feric, M., Misteli, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phase+separation+in+genome+organization+across+evolution.">Phase separation in genome organization across evolution.</a> Trends Cell Biol. 31 (8), 671-685 (2021).</li><li>Mitrea, D. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+for+physical+characterization+of+phase-separated+bodies+and+membrane-less+organelles.">Methods for physical characterization of phase-separated bodies and membrane-less organelles.</a> J Mol Biol. 430 (23), 4773-4805 (2018).</li><li>Fetter, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endogenous+gene+tagging+with+fluorescent+proteins.">Endogenous gene tagging with fluorescent proteins.</a> Methods Mol Biol. 1239, 231-240 (2015).</li><li>Alberti, S., Gladfelter, A., Mittag, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Considerations+and+challenges+in+studying+liquid-liquid+phase+separation+and+biomolecular+condensates.">Considerations and challenges in studying liquid-liquid phase separation and biomolecular condensates.</a> Cell. 176 (3), 419-434 (2019).</li><li>Galbraith, C. G., Galbraith, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Super-resolution+microscopy+at+a+glance.">Super-resolution microscopy at a glance.</a> J Cell Sci. 124 (10), 1607-1611 (2011).</li><li>Scalisi, S., Ahmad, A., D'Annunzio, S., Rousseau, D., Zippo, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+analysis+of+PcG-associated+condensates+by+stochastic+optical+reconstruction+microscopy+(STORM).">Quantitative analysis of PcG-associated condensates by stochastic optical reconstruction microscopy (STORM).</a> Methods Mol Biol. 2655, 183-200 (2023).</li><li>Shihan, M. H., Novo, S. G., Le Marchand, S. J., Wang, Y., Duncan, M. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+method+for+quantitating+confocal+fluorescent+images.">A simple method for quantitating confocal fluorescent images.</a> Biochem Biophys Rep. 25, 100916 (2021).</li><li>Herbert, A. D., Carr, A. M., Hoffmann, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FindFoci:+a+focus+detection+algorithm+with+automated+parameter+training+that+closely+matches+human+assignments,+reduces+human+inconsistencies+and+increases+speed+of+analysis.">FindFoci: a focus detection algorithm with automated parameter training that closely matches human assignments, reduces human inconsistencies and increases speed of analysis.</a> PLoS One. 9 (12), e114749 (2014).</li><li>Ollion, J., Cochennec, J., Loll, F., Escude, C., Boudier, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TANGO:+a+generic+tool+for+high-throughput+3D+image+analysis+for+studying+nuclear+organization.">TANGO: a generic tool for high-throughput 3D image analysis for studying nuclear organization.</a> Bioinformatics. 29 (14), 1840-1841 (2013).</li><li>Sabari, B. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coactivator+condensation+at+super-enhancers+links+phase+separation+and+gene+control.">Coactivator condensation at super-enhancers links phase separation and gene control.</a> Science. 361 (6400), 3958 (2018).</li><li>Jang, M. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+bromodomain+protein+Brd4+is+a+positive+regulatory+component+of+P-TEFb+and+stimulates+RNA+polymerase+II-dependent+transcription.">The bromodomain protein Brd4 is a positive regulatory component of P-TEFb and stimulates RNA polymerase II-dependent transcription.</a> Mol Cell. 19 (4), 523-534 (2005).</li><li>Pasini, D., Bracken, A. P., Jensen, M. R., Denchi, E. L., Helin, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Suz12+is+essential+for+mouse+development+and+for+EZH2+histone+methyltransferase+activity.">Suz12 is essential for mouse development and for EZH2 histone methyltransferase activity.</a> EMBO J. 23 (20), 4061-4071 (2004).</li><li>Margueron, R., Reinberg, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Polycomb+complex+PRC2+and+its+mark+in+life.">The Polycomb complex PRC2 and its mark in life.</a> Nature. 469 (7330), 343-349 (2011).</li><li>Peng, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Brd4+regulates+the+homeostasis+of+CD8(+)+T-lymphocytes+and+their+proliferation+in+response+to+antigen+stimulation.">Brd4 regulates the homeostasis of CD8(+) T-lymphocytes and their proliferation in response to antigen stimulation.</a> Front Immunol. 12, 728082 (2021).</li><li>Marasca, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=LINE1+are+spliced+in+non-canonical+transcript+variants+to+regulate+T+cell+quiescence+and+exhaustion.">LINE1 are spliced in non-canonical transcript variants to regulate T cell quiescence and exhaustion.</a> Nat Genet. 54 (2), 180-193 (2022).</li><li>Marasca, F., Cortesi, A., Bodega, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=3D+COMBO+chrRNA-DNA-ImmunoFISH.">3D COMBO chrRNA-DNA-ImmunoFISH.</a> Methods Mol Biol. 2157, 281-297 (2021).</li><li>Marasca, F., Cortesi, A., Manganaro, L., Bodega, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=3D+Multicolor+DNA+FISH+tool+to+study+nuclear+architecture+in+human+primary+cells.">3D Multicolor DNA FISH tool to study nuclear architecture in human primary cells.</a> J Vis Exp. (155), (2020).</li><li>Jakob, B., Splinter, J., Durante, M., Taucher-Scholz, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live+cell+microscopy+analysis+of+radiation-induced+DNA+double-strand+break+motion.">Live cell microscopy analysis of radiation-induced DNA double-strand break motion.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (9), 3172-3177 (2009).</li></ol>

في هذه الدراسة ، نقدم طريقة لإجراء تجارب التألق المناعي على البروتينات النووية في الخلايا الليمفاوية التائية البشرية. توفر هذه الطريقة مرونة للاستخدام مع أنواع الخلايا المختلفة من خلال تعديلات طفيفة في خطوات التثبيت والنفاذية ، كما هو موضح سابقا30,31.
<p cla...

يخضع تنظيم الجينوم حقيقي النواة لطبقات متعددة من التعديلات اللاجينية1 ، وتنسيق العديد من الوظائف النووية التي يمكن أن تحدث داخل مقصورات متخصصة تسمى الأجسام النووية أو المكثفات2. ضمن هذه الهياكل ، تتم عمليات مثل بدء النسخ3 ، ومعالجة الحمض النووي الريبي4،5،6 ، وإصلاح الحمض النووي7،8 ، والتكوين الحيوي للريبوسوم9،10،11 ، وتنظيم heterochromatin12،13. يتكيف تنظيم الأجسام النووية على كل من الأبعاد المكانية والزمانية لاستيعاب المتطلبات الخلوية ، مسترشدا بمبادئ فصل الطور14,15. وبالتالي ، تعمل هذه الهيئات كمصانع عابرة حيث تتجمع المكونات الوظيفية وتفكك ، وتخضع لتغييرات في الحجم والتوزيع المكاني. ومن ثم ، فإن فهم خصائص البروتينات النووية عن طريق الفحص المجهري ، بما في ذلك ميلها لتشكيل الأجسام وترتيبها المكاني في الظروف الخلوية المختلفة ، يوفر رؤى قيمة حول أدوارها الوظيفية. الفحص المجهري الفلوري هو طريقة مستخدمة على نطاق واسع لدراسة البروتينات النووية ، مما يسمح باكتشافها من خلال الأجسام المضادة الفلورية أو التعبير المباشر عن الأهداف باستخدام مراسل بروتين الفلورسنت16,17.
في هذا السياق ، تظهر الأجسام النووية كبؤر ساطعة أو نقاط ، مع درجة ملحوظة من الكروية ، مما يسهل تمييزها عن البيئة المحيطة16,18. تتيح التقنيات فائقة الدقة مثل STORM و PALM ، من خلال توفير دقة محسنة (تصل إلى 10 نانومتر) 19 ، توصيفا أكثر دقة لهيكل وتكوين مكثفات محددة20. ومع ذلك ، فإن إمكانية الوصول إليها محدودة بسبب نفقات المعدات والمهارات المتخصصة اللازمة لتحليل البيانات. لذلك ، يظل الفحص المجهري متحد البؤر شائعا نظرا لتوازنه الإيجابي بين الدقة والاستخدام الأوسع. يتم تسهيل هذه الشعبية من خلال الإزالة المتأصلة للضوء خارج التركيز البؤري ، مما يقلل من الحاجة إلى إجراءات ما بعد المعالجة المكثفة للتجزئة الدقيقة ، وتوافره على نطاق واسع في معاهد البحوث ، ووقت اكتسابه الفعال ، وإعداد العينات الذي عادة ما يكون فعالا. ومع ذلك ، فإن القياس الدقيق لتوزيع البروتين أو تجميعه أو انتشاره باستخدام مقايسات التألق المناعي عبر الظروف الخلوية المتنوعة يشكل تحديات ، حيث تفتقر العديد من الطرق الحالية إلى إرشادات حول اختيار المعلمات المناسبة للبروتينات ذات أنماط التوزيع المختلفة21. علاوة على ذلك ، قد يكون التعامل مع حجم البيانات الكبير الناتج أمرا شاقا للمستخدمين ذوي الخبرة المحدودة في تحليل البيانات ، مما قد يضر بالأهمية البيولوجية للنتائج.
لمواجهة هذه التحديات ، نقدم بروتوكولا مفصلا خطوة بخطوة لإعداد التألق المناعي وتحليل البيانات ، بهدف توفير طريقة غير متحيزة لقياس تلطيخ البروتين بأنماط تنظيمية مختلفة (الشكل 1). تم تصميم هذا المسار شبه الآلي للمستخدمين ذوي الخبرة المحدودة في التحليل الحسابي والتصويري. فهو يجمع بين وظائف اثنين من المكونات الإضافية فيجي المعمول بها: FindFoci22 و 3D جناح23. من خلال دمج قدرة تحديد البؤر الدقيقة ل FindFoci مع ميزات تحديد الكائنات والتجزئة في مساحة ثلاثية الأبعاد التي توفرها مجموعة 3D ، يقوم نهجنا بإنشاء ملفين CSV لكل قناة لكل مجال اكتساب. تحتوي هذه الملفات على معلومات تكميلية تسهل حساب المقاييس المناسبة لأنواع مختلفة من توزيع الإشارات ، مثل عدد البؤر لكل خلية ، ومسافة البؤر من المركز النووي ، ومعامل عدم التجانس (IC) ، الذي قدمناه لتلطيخ البروتين المنتشر. بالإضافة إلى ذلك ، نقر بأن استقراء البيانات يمكن أن يستغرق وقتا طويلا للمستخدمين ذوي المهارات المحدودة في معالجة البيانات. لتبسيط هذه العملية ، نقدم برنامج Python النصي الذي يجمع تلقائيا جميع القياسات التي تم جمعها في ملف واحد لكل تجربة. يمكن للمستخدمين تنفيذ هذا البرنامج النصي دون الحاجة إلى تثبيت أي برنامج لغة برمجة. نحن نقدم رمزا قابلا للتنفيذ على Google Colab ، وهو نظام أساسي قائم على السحابة يسمح بكتابة نصوص Python مباشرة في المتصفح. هذا يضمن أن طريقتنا بديهية ويمكن الوصول إليها بسهولة للاستخدام الفوري.
لقد أثبتنا فعالية بروتوكولنا في تحليل وقياس التغيرات في توزيع الإشارات لبروتينين نوويين: البروتين 4 المحتوي على البرومودومين (BRD4) ومثبط zeste-12 (SUZ12). BRD4 هو بروتين منشط موثق جيدا داخل مجمع الوسيط المعروف بتكوين المكثفات المرتبطة ببدء النسخ المعتمد على البلمرةII 24,25. SUZ12 هو مكون بروتيني في مجمع Polycomb القمعي 2 (PRC2) المسؤول عن تنظيم ترسب تعديل هيستون H3K27me326,27. تظهر هذه البروتينات أنماطا مختلفة داخل نوعين متميزين من الخلايا: الخلايا التائية البشرية الساذجة CD4 + المعزولة حديثا ، والتي تكون هادئة وتظهر معدلات بطيئة من نشاط النسخ ، وخلايا TH1 CD4 + المتمايزة في المختبر ، وهي خلايا مستجيبة متخصصة ومتكاثرة تظهر زيادة النسخ28.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1.5 mL Safe-Lock Tubes</td>
			<td>Eppendord</td>
			<td>#0030121503</td>
			<td>Protocol section 1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 mL Serological pipettes</td>
			<td>VWR</td>
			<td>#612-3700</td>
			<td>Protocol section 1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20 &#181;L barrier pipette tip</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>#2149P-HR</td>
			<td>Protocol section 1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL Polypropylene Conical Tube</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>#352070</td>
			<td>Protocol section 1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>200 &#181;L barrier pipette tip</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>#2069-HR</td>
			<td>Protocol section 1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>antifade solution - ProlongGlass - mountingmedia</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>#P36984</td>
			<td>Step 1.3.12</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA (Bovine Serum Albumin)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>#A7030</td>
			<td>Step 1.3.6., 1.3.8.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD4+ T Cell Isolation Kit</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>#130-096-533</td>
			<td>Step 1.1.2.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI (4,6-diamidino-2-phenylindole)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>Cat#D1306</td>
			<td>Step 1.3.10.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dry ice</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Step 1.3.1.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dynabeads Human T-activator anti-CD3/anti-CD28 bead</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>#1131D</td>
			<td>magnetic beads step 1.1.4.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EtOH</td>
			<td>Carlo Erba</td>
			<td>#4146320</td>
			<td>Step 1.2.1.1.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FACSAria SORP</td>
			<td>BD Bioscences</td>
			<td></td>
			<td>Step 1.1.3. Equipped with BD FACSDiva Software version 8.0.3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS (Fetal Bovine Serum)</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>#10270106</td>
			<td>Step 1.1.4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FICOLL PAQUE PLUS</td>
			<td>Euroclone</td>
			<td>GEH17144003F32</td>
			<td>Step 1.1.1.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FIJI Version 2.14.0</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>Protocol section 3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass coverslip (10 mm, thickness 1.5 H)</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>#72298-13</td>
			<td>Step 1.2.1.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>#G5516</td>
			<td>Step 1.2.7-1.3.1.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-Rabbit AF568 secondary antibody</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A11036</td>
			<td>Step 1.3.8.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HCl</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>#320331</td>
			<td>Step 1.3.4.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>human neutralizing anti-IL-4</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>Cat#130-095-753</td>
			<td>Step 1.1.4.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>human recombinant IL-12</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>Cat#130-096-704</td>
			<td>Step 1.1.4.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>human recombinant IL-2</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>Cat#130-097-744</td>
			<td>Step 1.1.4.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica TCS SP5 Confocal microscope</td>
			<td>Leica Microsystems</td>
			<td>-</td>
			<td>Protocol section 2, Equipped with HCX PL APO 63x, 1.40 NA oil immersion objective, with an additional 3x zoom. Pinhole size : 0.8 AU. Line average 2&#215;. Frame size 1024&#215;1024 pixel.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEM Non-Essential Amino Acids Solution</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>#11140035</td>
			<td>Step 1.1.4.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope Slides</td>
			<td>VWR</td>
			<td>#631-1552</td>
			<td>Step 1.3.12.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse monoclonal anti-Human CD4 APC-Cy7 (RPA-T4 clone)</td>
			<td>BD Bioscience</td>
			<td>#557871</td>
			<td>Step 1.1.3.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse monoclonal anti-Human CD45RA PECy5 (5H9 clone)</td>
			<td>BD Bioscience</td>
			<td>#552888</td>
			<td>Step 1.1.3.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse monoclonal anti-Human CD45RO APC (UCHL1 clone)</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>#130-113-546</td>
			<td>Step 1.1.3.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multiwell 24 well</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>#353047</td>
			<td>Protocol section 1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Normal Goat Serum</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>PCN5000</td>
			<td>Step 1.3.6., 1.3.8.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>#14190094</td>
			<td>Protocol section 1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/Streptomycin solution</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>#15070063</td>
			<td>Step 1.1.4.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PFA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>#P6148</td>
			<td>Step 1.2.4.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>poly-L-lysine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>#P8920</td>
			<td>1.2.1.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primary antibody - BRD4</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>#ab128874</td>
			<td>Step 1.3.6.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primary antibody - SUZ12</td>
			<td>Cel Signalling</td>
			<td>mAb #3737</td>
			<td>Step 1.3.6.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI 1640 W/GLUTAMAX-I</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>#61870010</td>
			<td>Step 1.1.4.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Pyruvate</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>#11360039</td>
			<td>Step 1.1.4.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>#T8787</td>
			<td>Step 1.2., 1.3.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TWEEN 20</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>#P9416</td>
			<td>Step 1.3.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tweezers</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>Protocol section 1</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a versatile pipeline for analyzing dynamic changes in nuclear bodies in a variety of cell types

تحدث العمليات النووية المختلفة ، مثل التحكم في النسخ ، داخل هياكل منفصلة تعرف باسم البؤر التي يمكن تمييزها من خلال تقنية التألق المناعي. إن التحقيق في ديناميكيات هذه البؤر في ظل ظروف خلوية متنوعة عبر الفحص المجهري يعطي رؤى قيمة حول الآليات الجزيئية التي تحكم الهوية الخلوية ووظائفها. ومع ذلك ، فإن إجراء فحوصات التألق المناعي عبر أنواع مختلفة من الخلايا وتقييم التغيرات في تجميع هذه البؤر ونشرها وتوزيعها يمثل العديد من التحديات. تشمل هذه التحديات تعقيدات في إعداد العينات ، وتحديد المعلمات لتحليل بيانات التصوير ، وإدارة أحجام البيانات الكبيرة. علاوة على ذلك ، غالبا ما يتم تصميم مهام سير عمل التصوير الحالية للمستخدمين الأكفاء ، مما يحد من إمكانية الوصول إلى جمهور أوسع.
في هذه الدراسة ، نقدم بروتوكول تألق مناعي محسن مصمم خصيصا للتحقيق في البروتينات النووية في أنواع مختلفة من الخلايا التائية الأولية البشرية التي يمكن تخصيصها لأي بروتين مهم ونوع الخلية. علاوة على ذلك ، نقدم طريقة لقياس تلطيخ البروتين بشكل غير متحيز ، سواء كانت تشكل بؤرا متميزة أو تظهر توزيعا نوويا منتشرا.
تقدم طريقتنا المقترحة دليلا شاملا ، من التلوين الخلوي إلى التحليل ، والاستفادة من خط أنابيب شبه آلي تم تطويره في Jython وقابل للتنفيذ في فيجي. علاوة على ذلك ، نقدم نصا برمجيا سهل الاستخدام من Python لتبسيط إدارة البيانات ، ويمكن الوصول إليه بشكل عام على دفتر ملاحظات Google Colab. وقد أثبت نهجنا فعاليته في إنتاج تحليلات عالية الإثراء للبروتينات ذات الأنماط المتنوعة للتنظيم النووي عبر سياقات مختلفة.

The organization of the eukaryotic genome is governed by multiple layers of epigenetic modifications1, coordinating several nuclear functions that can occur within specialized compartments called nuclear bodies or condensates2. Within these structures, processes such as transcription initiation3, RNA processing4,5,6, DNA repair7,8, ribosome biogenesis9,10,11, and heterochromatin regulation12,13 take place. The regulation of nuclear bodies adjusts over both spatial and temporal dimensions to accommodate cellular requirements, guided by principles of phase separation14,15. Consequently, these bodies function as transient factories where functional components assemble and disassemble, undergoing changes in size and spatial distribution. Hence, understanding the characteristics of nuclear proteins by microscopy, including their propensity to form bodies and their spatial arrangement in different cellular conditions, offers valuable insights into their functional roles. Fluorescence microscopy is a widely used method for studying nuclear proteins, allowing their detection through fluorescent antibodies or directly expressing targets with a fluorescent protein reporter16,17.
In this context, nuclear bodies appear as bright foci or puncta, with a notable degree of sphericity, making them easily distinguishable from the surrounding environment16,18. Super-resolution techniques like STORM and PALM, by providing improved resolution (up to 10 nm)19, enable more precise characterization of the structure and composition of specific condensates20. However, their accessibility is limited by equipment expenses and the specialized skills needed for data analysis. Therefore, confocal microscopy remains popular due to its favorable balance between resolution and wider usage. Such popularity is facilitated by the inherent removal of out-of-focus light, which diminishes the requirement for extensive post-processing procedures for accurate segmentation, its widespread availability in research institutes, its effective acquisition time, and sample preparation that is typically efficient. However, accurately measuring protein distribution, assembly, or diffusion using immunofluorescence assays across diverse cellular conditions poses challenges, as many existing methods lack guidance on selecting suitable parameters for proteins with varying distribution patterns21. Moreover, handling the resulting large data volume can be daunting for users with limited experience in data analysis, potentially compromising the biological significance of the results.
To address these challenges, we introduce a detailed step-by-step protocol for immunofluorescence preparation and data analysis, aiming to provide an unbiased method for quantifying protein staining with various organization patterns (Figure 1). This semi-automated pipeline is designed for users with limited expertise in computational and imaging analysis. It combines the functionalities of two established Fiji plugins: FindFoci22 and 3D suite23. By integrating the precise foci identification capability of FindFoci with the object identification and segmentation features in 3D space offered by 3D suite, our approach generates two CSV files per channel for each field of acquisition. These files contain complementary information that facilitates the calculation of metrics suitable for various types of signal distribution, such as the count of foci per cell, the distance of foci from the nuclear centroid, and the inhomogeneity coefficient (IC), which we have introduced for diffuse protein staining. In addition, we acknowledge that data extrapolation can be time-consuming for users with limited data handling skills. To streamline this process, we provide a Python script that automatically compiles all collected measurements into a single file for each experiment. Users can execute this script without the need to install any programming language software. We provide an executable code on Google Colab, a cloud-based platform that allows the writing of Python scripts directly in the browser. This ensures that our method is intuitive and readily accessible for immediate use.
We demonstrate the effectiveness of our protocol in analyzing and quantifying alterations in signal distribution of two nuclear proteins: Bromodomain-containing protein 4 (BRD4) and Suppressor of zeste-12 (SUZ12). BRD4 is a well-documented coactivator protein within the Mediator complex known to form condensates associated with polymerase II-dependent transcriptional initiation24,25. SUZ12 is a protein component of the Polycomb Repressive Complex 2 (PRC2) responsible for regulating the deposition of H3K27me3 histone modification26,27. These proteins exhibit different patterns within two distinct cell types: freshly isolated human CD4+ na&#239;ve T cells, which are quiescent and exhibit slow rates of transcriptional activity, and in vitro differentiated TH1 CD4+ cells, which are specialized, proliferating effector cells showing increased transcription28.

تسليط الضوء على المؤلف: التحليل اللاجيني الشامل للتحقيق في اللدونة الخلوية البشرية والتكيف البيئي باستخدام مقايسات التألق المناعي

خط أنابيب متعدد الاستخدامات لتحليل التغيرات الديناميكية في الأجسام النووية في مجموعة متنوعة من أنواع الخلايا

Our main research interest is an epigenetic mechanism that regulates human cellular elasticity and environmental adaptation. I am currently focusing on studying how changes in chromatization within a nuclear condensate three pathological cellular conditions. I believe that studying the biophysical properties of chromatization opens a new field and offers unique opportunities for developing novel therapeutic approaches.Immunofluorescence assays are valuable for screening protein organization in nuclear condensates. However, human genetics can be challenging due to parameter selection issues and large data volume when studying multiple conditions. We offer a comprehensive with guidance on how to use the right parameters and automated analysis pipeline to streamline the process.Our protocol guides user from sample preparation to the analysis. We provided a simulated pipeline design through Doza with limited computation and image analysis expertise. The workflow is accessible to everyone at no cost, and leveraging widely adoptable software like Imogene and Python and the free cloud based service Google Colab.

يسهل البروتوكول المبين في هذه الطريقة تصور وقياس التغيرات في تلطيخ البروتين النووي داخل الخلايا التائية الأولية البشرية ، ويمكن تخصيصه لأنواع الخلايا المتنوعة وأهداف البروتين. كدراسات حالة ، أجرينا وحللنا تلطيخ BRD4 و SUZ12 في الخلايا الساذجة و TH1 CD4 + .
يعرض BRD4 نمط ت...

تصف هذه الطريقة بروتوكول التألق المناعي وخط أنابيب القياس الكمي لتقييم توزيع البروتين مع أنماط تنظيم نووية متنوعة في الخلايا الليمفاوية التائية البشرية. يوفر هذا البروتوكول إرشادات خطوة بخطوة ، بدءا من إعداد العينات والاستمرار في تنفيذ التحليل شبه الآلي في فيجي ، وينتهي بمعالجة البيانات بواسطة دفتر ملاحظات Google Colab.

Various nuclear processes, such as transcriptional control, occur within discrete structures known as foci that are discernable through the ...

a-versatile-pipeline-for-analyzing-dynamic-changes-nuclear-bodies

Research

JoVE Journal

Genetics

A Versatile Pipeline for Analyzing Dynamic Changes in Nuclear Bodies in a Variety of Cell Types

Various nuclear processes, such as transcriptional control, occur within discrete structures known as foci that are discernable through the immunofluorescence technique. Investigating the dynamics of these foci under diverse cellular conditions via microscopy yields valuable insights into the molecular mechanisms governing cellular identity and functions. However, performing immunofluorescence assays across different cell types and assessing alterations in the assembly, diffusion, and distribution of these foci present numerous challenges. These challenges encompass complexities in sample preparation, determination of parameters for analyzing imaging data, and management of substantial data volumes. Moreover, existing imaging workflows are often tailored for proficient users, thereby limiting accessibility to a broader audience.
In this study, we introduce an optimized immunofluorescence protocol tailored for investigating nuclear proteins in different human primary T cell types that can be customized for any protein of interest and cell type. Furthermore, we present a method for unbiasedly quantifying protein staining, whether they form distinct foci or exhibit a diffuse nuclear distribution.
Our proposed method offers a comprehensive guide, from cellular staining to analysis, leveraging a semi-automated pipeline developed in Jython and executable in Fiji. Furthermore, we provide a user-friendly Python script to streamline data management, publicly accessible on a Google Colab notebook. Our approach has demonstrated efficacy in yielding highly informative immunofluorescence analyses for proteins with diverse patterns of nuclear organization across different&#160;contexts.

This method describes an immunofluorescence protocol and quantification pipeline for evaluating protein distribution with varied nuclear organization patterns in human T lymphocytes. This protocol provides step-by-step guidance, starting from sample preparation and continuing through the execution of semi-automated analysis in Fiji, concluding with data handling by a Google Colab notebook.

Quantification Pipeline for Evaluating Protein Distribution with Varied Nuclear Organization Patterns in Human T Lymphocytes

To begin, download and install the latest version of Fiji on a computer. After downloading the convert_to_TIFF. py script, drag and drop the script on Fiji and run the code.Browse to the path where the experiment is stored. The converted TIFF files are created within the same experimental folder. Click on plugins, then 3D Suite, and open the 3D manager options.Within the 3D manager window, select the check boxes corresponding to the volume in unit, mean gray value, bounding box in pixel, standard deviation gray value, centroid in pixel, and centroid in unit. Tick the exclude objects on edges XY, and exclude objects on edges Z.Then, click okay. Open the fluorescent image of human T-lymphocytes.Click Control Shift D to duplicate the protein channel, including the stack. Check the hyper stack checkbox. Specify the appropriate channel number within the channels box and rename it accordingly.To launch the Fiji macro recorder, navigate to the plugins, then macros, and select record. Then, to open the FindFoci plugin, sequentially click on plugins GDSC, FindFoci, and FindFoci GUI. From the image dropdown menu, select the image to be analyzed.Set the Gaussian blur to 1.5, background method to standard deviation above mean, background parameter to nine, search method to fraction of peak background, search parameter to 0.7, peak method to relative above background, peak parameter to 0.2, and minimum size to five. Set the max peaks to high numbers to include all foci in the image. To enhance foci identification, adjust the Gaussian blur close to the foci diameter, and increase the values of the background parameter to impose more stringent thresholds.Then, decrease the values of the search parameter to include areas farther away from the fluorescence peak and decrease the values of the peak parameter for the separation of peaks. Run FindFoci and copy the string that appears in the recorder window. The string contains the selected parameters, excluding the quotation marks.After downloading the nuclear_prod_q. py script, drag and drop the script on Fiji, and click run to execute the code. In the nucleus channel, enter the number corresponding to the channel of DAPI.For nucleus Gaussian blur, enter the value of sigma needed to blur the image for segmentation. Then, enter the number corresponding to the channel of the staining of interest for the protein channel. In the FindFoci parameter, paste the string representing the macro recording of the selected parameters.Tick the visual check box and click browse to select the directory where the images are stored. Once all boxes are compiled, click okay to continue the execution. From the ROI list in the ROI manager 3D window, select the nuclei channel, and click live ROI to on.Select the ROI belonging to the same nucleus and press merge. And for undesired nuclei, press delete. Again, click live ROI to on, select all, and confirm that all nuclei are correctly segmented.From the quantification folder, open the TXT file with records of the parameters used for the analysis. Open Google Colab in a browser. Then, from the file, select open notebook, and upload the final nuclear protein metrics.ipynb script. Upload all the folders containing the CSV files of each image field into a folder of preference in Google Drive. In the notebook, indicate the path of the folder where the results sub-folders are stored and run all cells.When the code has finished compiling, open the final spreadsheet file containing all the compiled data.