Name: تسليط الضوء على المؤلف: توصيف الإنزيمات الجديدة من المحبة للأطراف المتطرفة ومسببات الأمراض الشائعة لفهم إصلاح الحمض النووي وتكراره
Uploaded: 2024-07-05T14:30:00
Description: The availability of a range of modified synthetic oligonucleotides from commercial vendors has allowed the development of sophisticated assays to ...

يتم دعم AW من قبل زمالة رذرفورد ديسكفري (20-UOW-004). RS هو المستفيد من منحة نيوزيلندا بعد القطب الجنوبي. تعترف SG و UR بالمعهد الكيميائي في جامعة ترومسو - جامعة القطب الشمالي النرويجية للدعم الفني.

1. تصميم وشراء قليل النوكليوتيدات
ملاحظة: صمم قليل النيوكليوتيدات أحادية الشريط ليتم تجميعها وتلدينها في الدوبلكس المطلوب. يجب أن يحمل واحد أو أكثر من الخيوط في دوبلكس جزءا من الفلورسنت لتتبع معالجة قليل النوكليوتيد بواسطة الإنزيم محل الاهتمام. وترد في الجدول 1...

مقايسات إنزيمات الحمض النووي باستخدام قليل النيوكليوتيدات الاصطناعية

الخطوات الحاسمة في البروتوكول تصميم وشراء قليل النوكليوتيد: عند شراء قليل النوكليوتيدات لتشكيل مزدوج ، من الضروري مراعاة تصميم التسلسل. يوصى باستخدام أداة محلل oligo للتنبؤ بخصائص تسلسل النوكليوتيدات ، مثل محتوى GC ، ودرجة حرارة الانصهار ، والبنية الثانوية ، وإمكانية dimerization ، قب?...

تتطلب جميع أشكال الحياة إنزيمات معالجة الحمض النووي لتنفيذ العمليات الحيوية الأساسية، بما في ذلك التضاعف والنسخ وإصلاح الحمض النووي (DNA). الوظائف الأنزيمية الرئيسية لهذه المسارات هي البلمرة ، التي تولد نسخا من جزيئات الحمض النووي الريبي / الحمض النووي ، والأربطة التي تنضم إلى ركائز عديد النوكليوتيد ، والنيوكليازات التي تحللها ، واللوليكات و topoisomerases ، التي تذوب دوبلكس الحمض النووي أو تغير طوبولوجيتها1،2،3،4،5،6،7،8،9،10. بالإضافة إلى ذلك ، توفر العديد من هذه الإنزيمات أدوات جزيئية أساسية لتطبيقات مثل الاستنساخ والتشخيص والتسلسل عالي الإنتاجية11،12،13،14،15.
يمكن تحديد الخصائص الوظيفية والحركية وخصائص الركيزة لهذه الإنزيمات باستخدام ركائز الحمض النووي / الحمض النووي الريبي المسماة التي تنتجها قلة النيوكليوتيدات التلدين. تم تحقيق ركائز التتبع والمنتجات تقليديا من خلال إدخال ملصق مشع (32P) إما في نهاية الشريط 5 بوصات ، والذي يمكن اكتشافه بعد ذلك بواسطة فيلم فوتوغرافي أو باستخدام نظام تصوير الفوسفور16,17. في حين أن الركائز ذات العلامات الإشعاعية توفر ميزة زيادة الحساسية التجريبية ولا تغير الخواص الكيميائية للنيوكليوتيد ، فإن المخاطر الصحية المحتملة من العمل مع النظائر المشعة شجعت على تطوير وسم الحمض النووي غير المشع لتوفير بديل أكثر أمانا للكشف عن الحمض النووي والحمض النووي الريبي18،19،20. من بين هؤلاء ، يبرز الكشف عن التألق ، بما في ذلك الكشف المباشر عن التألق ، والتألق الذي تم حله بمرور الوقت ، ومقايسات التبريد لنقل الطاقة / التألق باعتباره الأكثر تنوعا21،22،23،24. تتيح المجموعة الواسعة من الفلوروفورات تصميمات مختلفة لركائز الحمض النووي / الحمض النووي الريبي التي تتميز بمراسلين فريدين على كل قليل النوكليوتيد25. بالإضافة إلى ذلك ، فإن استقرار الفلوروفورات ، عند مقارنته بالنظائر المشعة ، يسمح للمستخدمين بإنتاج والحفاظ على كميات كبيرة من ركائز الحمض النووي الموسومة بالفلورسنت19. يمكن تحضين هذه الركائز ذات العلامات الفلوروفور بالبروتين محل الاهتمام ، جنبا إلى جنب مع مجموعات مختلفة من العوامل المساعدة للمعادن والنيوكليوتيدات ، لتحليل نشاط الارتباط و / أو الإنزيم. يمكن ملاحظة تصور الارتباط أو النشاط باستخدام قنوات صبغة الفلوروفور المختلفة مع نظام تصوير هلام. نظرا لأن قليل النيوكليوتيدات المسمى بالفلورسنت فقط سيكون مرئيا باستخدام هذه التقنية ، فإن أي زيادة أو نقصان في حجم قليل النوكليوتيد المسمى سيكون من السهل متابعته. يمكن أيضا تلطيخ المواد الهلامية بعد ذلك ، باستخدام أصباغ تلطيخ الحمض النووي لتصور جميع أشرطة الحمض النووي الموجودة على الجل.
أربطة الحمض النووي المتعددة هي إنزيمات تنضم إلى شظايا الحمض النووي / الحمض النووي الريبي ، وتحفز ختم الفواصل عن طريق تكوين رابطة فوسفاتية ثنائية الإستر بين ترميني الحمض النووي المفسفر 5 بوصات و 3 'OH من الحمض النووي. يمكن تقسيمها إلى مجموعتين وفقا لمتطلبات ركيزة النوكليوتيدات. تم العثور على الأربطة المعتمدة على NAD المحفوظة بشكل كبير في جميع البكتيريا26 بينما يمكن تحديد الإنزيمات المتنوعة هيكليا المعتمدة على ATP من خلال جميع مجالات الحياة 8,27. تلعب أربطة الحمض النووي دورا مهما في معالجة شظايا أوكازاكي أثناء النسخ المتماثل بالإضافة إلى مشاركتها في مسارات إصلاح الحمض النووي المختلفة ، مثل إصلاح النوكليوتيدات واستئصال القاعدة ، من خلال ختم النكات والخدوش التلقائية التي تترك بعد الإصلاح 8,10. تظهر أربطة الحمض النووي المختلفة قدرات متفاوتة على الانضمام إلى المطابقات المختلفة لفواصل الحمض النووي ، بما في ذلك الشقوق في دوبلكس ، وفواصل مزدوجة تقطعت بهم السبل ، وعدم تطابق ، وفجوات ، بالإضافة إلى هجين الحمض النووي الريبيوالحمض النووي 28،29،30. يمكن تجميع مجموعة متنوعة من الركائز القابلة للربط عن طريق تلدين قليل النوكليوتيدات مع فوسفات 5 'لتوليد 5' و 3' تيرميني جنبا إلى جنب في حمض نووي مزدوج31،32،33. الطريقة الأكثر شيوعا للتحليل هي الدقة بواسطة urea PAGE في تنسيق فحص نقطة النهاية. ومع ذلك ، فقد تضمنت الابتكارات الحديثة استخدام الرحلان الكهربائي للهلام الشعري ، والذي يسمح بإنتاجية عالية34 ، والتنميط الطيفيالكتلي 35 ، بالإضافة إلى مقايسة منارة جزيئية متجانسة ، والتي تسمح بالمراقبة التي تم حلهابمرور الوقت 36.
الخطوة الأولى في تفاعل الربط هي أدينيل إنزيم الليجاز بواسطة أدينوسين ثلاثي الفوسفات (ATP) أو نيكوتيناميد الأدينين ثنائي النوكليوتيد (NAD) ، مما ينتج عنه إنزيم تساهمي وسيط. الخطوة الثانية في التفاعل هي أدينيل ركيزة الحمض النووي على الطرف 5' من موقع النيك ، والذي يتبعه ربط خيوط الحمض النووي. يتم تنقية العديد من إنزيمات الليغاز التي يتم التعبير عنها بشكل مؤتلف في الإشريكية القولونية في شكل الأدينيل ، وبالتالي ، فهي قادرة على ربط الأحماض النووية بنجاح دون إضافة عامل مساعد نيوكليوتيد. وهذا يجعل من الصعب تحديد نوع العامل المساعد للنيوكليوتيدات الذي تحتاجه لربط الأحماض النووية. بالإضافة إلى وصف المقايسات لتقييم نشاط ربط الحمض النووي ، يتم أيضا تقديم طريقة لتحديد استخدام العامل المساعد بشكل موثوق عن طريق إزالة أدينيل الإنزيم باستخدام ركائز غير مصنفة.
النيوكليازات هي مجموعة كبيرة ومتنوعة من الإنزيمات المعدلة للحمض النووي / الحمض النووي الريبي والحمض النووي الريبي التحفيزي الذي يشق روابط الفوسفاتيستر بين الأحماض النووية37. وظائف إنزيم النيوكلياز مطلوبة في تكرار الحمض النووي وإصلاحه ومعالجة الحمض النووي الريبي ويمكن تصنيفها حسب خصوصية السكر للحمض النووي أو الحمض النووي الريبي أو كليهما. تحلل النوكليازات الداخلية روابط ثنائي الإستر الفوسفاتية داخل شريط الحمض النووي / الحمض النووي الريبي ، بينما تحلل إكسونوكلياز الحمض النووي / الحمض النووي الريبي نيوكليوتيد واحد في كل مرة من الطرف 3 'أو 5' وقد تفعل ذلك إما من 3' إلى 5' أو 5' إلى 3' نهاية الحمض النووي38.
في حين أن العديد من بروتينات النيوكلياز غير محددة وقد تشارك في عمليات متعددة ، فإن البعض الآخر محدد للغاية لتسلسل معين أو تلف الحمض النووي6،39،40. تستخدم النيوكليازات الخاصة بالتسلسل في مجموعة واسعة من تطبيقات التكنولوجيا الحيوية ، مثل الاستنساخ ، والطفرات ، وتحرير الجينوم. النيوكليازات الشائعة لهذه التطبيقات هي نيوكليازات التقييد41 ، نيوكليازات إصبع الزنك42 ، نيوكليازات المستجيب الشبيهة بالمنشط النسخي ، ومؤخرا ، نيوكليازات كريسبر43 الموجهة بالحمض النووي الريبي. تم تحديد النيوكليازات الخاصة بالضرر مؤخرا ، مثل EndoMS nuclease ، والتي تتميز بخصوصية عدم التطابق في الحمض النووي من خلال مجال النيوكلياز الشبيه ب RecB الخاص بعدم التطابق 5,44. تم إجراء فحوصات نشاط النيوكلياز ، تاريخيا ، كمقايسات متقطعة مع ركائز مشعة. ومع ذلك ، بالإضافة إلى عيوبها الأخرى ، لا تسمح هذه بتحديد الموقع الذي يتم قطعه بواسطة بروتين nuclease ، وهو أمر ممكن عند استخدام ركائز تحمل علامة الفلورسنت45,46. في الآونة الأخيرة ، تم تطوير مقايسات النيوكلياز المستمرة التي تعمل باستخدام أصباغ الحمض النووي المختلفة التي تتفاعل مع الحمض النووي في حالات مختلفة. على سبيل المثال ، إصدار إشارة فلورية أعلى عند التفاعل مع dsDNA مقارنة بحالته غير المنضمة ، أو الارتباط على وجه التحديد بالحمض النووي الريبي القصير47. تستخدم فحوصات النيوكلياز المستمرة الأخرى دبابيس شعر الحمض النووي مع مجموعة الفلوروفور على 5 'وإخماد في الطرف 3' بحيث يزداد التألق مع تحلل قليل النوكليوتيد بسبب فصل الفلوروفور والمروي48. في حين أن هذه المقايسات تسمح للمرء بتوصيف حركية البروتينات المهينة للحمض النووي ، فإنها تتطلب معرفة سابقة بوظيفة الإنزيم والركيزة وتقتصر أيضا على الإنزيمات التي تغير شكل الحمض النووي لإحداث اختلاف في ارتباط الصبغة. لهذا السبب ، لا تزال فحوصات نقطة النهاية التي تحل منتجات النيوكلياز الفردية مرغوبة لتوفير نظرة ثاقبة لتعديلات الحمض النووي الناتجة عن نشاط البروتين.
هنا ، يتم تقديم إجراء مفصل لتصميم قليل النيوكليوتيدات ذات العلامات الفلورية DNA / RNA والتي يمكن خلطها ومطابقتها لتوليد ركائز لاختبار نشاط إنزيمات النيوكلياز والبلمرة والليجاز الجديدة. إن التحقق من صحة هذه المجموعة الأساسية من تسلسل قليل النوكليوتيد يبسط التصميم التجريبي ويسهل التنميط الاقتصادي لمجموعة واسعة من الوظائف الأنزيمية دون الحاجة إلى شراء عدد كبير من الركائز المخصصة. يتم توفير إجراء مفصل لتشغيل مقايسة إنزيم معالجة الحمض النووي القياسية مع هذه الركائز ، باستخدام مثال نشاط ربط الحمض النووي والتعديلات لفحص وتحليل إنزيمات النيوكلياز والبلمرة. بالإضافة إلى ذلك ، يتم إعطاء اختبار معدل لتحديد خصوصية العامل المساعد لإنزيم ربط الحمض النووي بدقة عالية ، وتستخدم مجسات مزدوجة العلامات لتقييم تجميع الروابط متعددة المكونات. أخيرا ، تتم مناقشة التعديلات على تنسيق الفحص الأساسي للسماح باستخدامه لتحديد تفاعلات البروتين والحمض النووي مع نفس الركائز بواسطة مقايسة تحول الحركة الكهربية (EMSA).

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>30% Acrylamide/Bis Solution (29:1)</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>1610156</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adenosine triphosphate (ATP)</td>
			<td>Many suppliers</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium persulfate (APS)</td>
			<td>Many suppliers</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Benchtop centrifuge</td>
			<td>Many suppliers</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Borate</td>
			<td>Many suppliers</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bromophenol blue</td>
			<td>Many suppliers</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dithiothreitol (DTT)</td>
			<td>Many suppliers</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electrophoresis system with circulating water bath</td>
			<td>Many suppliers</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)</td>
			<td>Many suppliers</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluoresnence imager, e.g. iBright FL1000</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A32752</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formamide</td>
			<td>Many suppliers</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gel casting system</td>
			<td>Many suppliers</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heating block</td>
			<td>Many suppliers</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium Chloride</td>
			<td>Many suppliers</td>
			<td></td>
			<td>Other metal ions may be preferred depending on the protein studied</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge tubes (1.5 mL)</td>
			<td>Many suppliers</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micropipettes and tips</td>
			<td>Many suppliers</td>
			<td></td>
			<td>1 mL, 0.2 mL, 0.02 mL, 0.002 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nicotinamide adenine dinucleotide (NAD+)</td>
			<td>Many suppliers</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oligonucleotides</td>
			<td>Integrated DNA Technologies</td>
			<td>NA</td>
			<td>Thermo Fisher, Sigma-Aldrich,&#160; Genscript and others also supply these</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pasture pipette</td>
			<td>Many suppliers</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCR thermocycler</td>
			<td>Many suppliers</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCR tubes</td>
			<td>Many suppliers</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNAse away</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>7002PK</td>
			<td>Only needed when working with RNA oligos</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNase AWAY</td>
			<td>Merck</td>
			<td>83931-250ML</td>
			<td>Surfactant for removal of RNAse contamination on surfaces</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNAse-free water</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>B1500L</td>
			<td>Only needed when working with RNA oligos</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride</td>
			<td>Many suppliers</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SUPERase IN RNase inhibitor</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>AM2694</td>
			<td>Broad spectrum RNAse inhibitir (protein-based)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SYBR Gold</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>S11494</td>
			<td>This may be used to post-stain gels and visualise unlabelled oligonucleotides</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tetramethylethylenediamine (TMED)</td>
			<td>Many suppliers</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris, or tris(hydroxymethyl)aminomethane</td>
			<td>Many suppliers</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultrapure water (Milli-Q)</td>
			<td>Merck</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>urea</td>
			<td>Many suppliers</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortex</td>
			<td>Many suppliers</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

using modified synthetic oligonucleotides to assay nucleic acid-metabolizing enzymes

سمح توفر مجموعة من قليل النيوكليوتيدات الاصطناعية المعدلة من البائعين التجاريين بتطوير مقايسات متطورة لتوصيف الخصائص المتنوعة لإنزيمات استقلاب الحمض النووي التي يمكن تشغيلها في أي مختبر بيولوجيا جزيئية قياسي. جعل استخدام الملصقات الفلورية هذه الطرق في متناول الباحثين الذين لديهم معدات PAGE الكهربائية القياسية وجهاز تصوير يدعم الفلورسنت ، دون استخدام مواد مشعة أو الحاجة إلى مختبر مصمم لتخزين وإعداد المواد المشعة ، أي مختبر ساخن. يمكن أن تؤدي الإضافة الاختيارية للتعديلات القياسية مثل الفسفرة إلى تبسيط إعداد الفحص ، في حين يمكن استخدام الدمج المحدد للنيوكليوتيدات المعدلة التي تحاكي تلف الحمض النووي أو المواد الوسيطة لاستكشاف جوانب محددة من سلوك الإنزيم. هنا ، يتم عرض تصميم وتنفيذ المقايسات لاستجواب العديد من جوانب معالجة الحمض النووي بواسطة الإنزيمات باستخدام oligonucleotides الاصطناعية المتاحة تجاريا. وتشمل هذه قدرة الأربطة على الانضمام أو النيوكليازات على تحلل الهياكل الهجينة المختلفة للحمض النووي والحمض النووي الريبي ، واستخدام العامل المساعد التفاضلي بواسطة إنزيم ربط الحمض النووي ، وتقييم قدرة ربط الحمض النووي للإنزيمات. تتم مناقشة العوامل التي يجب مراعاتها عند تصميم ركائز النوكليوتيدات الاصطناعية ، ويتم توفير مجموعة أساسية من oligonucleotides التي يمكن استخدامها لمجموعة من فحوصات إنزيم الحمض النووي ، والبلمرة ، ومقايسات إنزيم النيوكلياز.

All life forms require nucleic acid processing enzymes to carry out fundamental biological processes, including replication, transcription, and DNA repair. Key enzymatic functionalities for these pathways are polymerases, which generate copies of RNA/DNA molecules, ligases which join polynucleotide substrates, nucleases that degrade them, and helicases and topoisomerases, which melt nucleic acid duplexes or change their topology1,2,3,4,5,6,7,8,9,10. In addition, many of these enzymes provide essential molecular tools for applications such as cloning, diagnostics, and high-throughput sequencing11,12,13,14,15.
The functional characteristics, kinetics, and substrate specificities of these enzymes can be determined using labeled DNA/RNA substrates produced by annealing oligonucleotides. Tracking substrates and products has traditionally been achieved by introducing a radioactive label (32P) at either the 5&#39; strand end, which can then be detected by photographic film or with a phosphor imaging system16,17. While radiolabeled substrates offer the benefit of increased experimental sensitivity and do not alter the chemical properties of a nucleotide, the potential health hazards from working with radioisotopes have encouraged the development of non-radioactive nucleic acid labeling to provide a safer alternative for DNA and RNA detection18,19,20. Among these, fluorescence detection, including direct fluorescence detection, time-resolved fluorescence, and energy transfer/fluorescence quenching assays stand out as the most versatile21,22,23,24. The extensive array of fluorophores enables different designs of DNA/RNA substrates featuring unique reporters on each oligonucleotide25. Additionally, the stability of fluorophores, when compared to radioisotopes, allows users to produce and preserve significant quantities of fluorescently labeled DNA substrates19. These fluorophore-labeled substrates can be incubated with the protein of interest, along with different combinations of metal and nucleotide cofactors, to analyze binding and or enzyme activity. Visualization of binding or activity can be observed using various fluorophore dye channels with a gel imaging system. As only the fluorescently labeled oligonucleotides will be visible using this technique, any increase or decrease in the size of the labeled oligonucleotide will be easy to follow. Gels can also be stained afterward, with nucleic acid staining dyes to visualize all DNA bands present on the gel.
Poly-nucleic acid ligases are enzymes that join fragments of DNA/RNA, catalyzing the sealing of breaks by the formation of a phosphodiester bond between 5&#39; phosphorylated DNA termini and the 3&#39; OH of DNA. They can be divided into two groups according to their nucleotide substrate requirement. The highly conserved NAD-dependent ligases are found in all bacteria26 while the structurally diverse ATP-dependent enzymes can be identified through all domains of life8,27. DNA ligases play an important role in Okazaki fragment processing during replication as well as being involved in various DNA repair pathways, such as nucleotide and base excision repair, through the sealing of spontaneous nicks and nicks that are left after repair8,10. Different DNA ligases exhibit varying capacities to join different conformations of DNA breaks, including nicks in a duplex, double-stranded breaks, mismatches, and gaps, as well as RNA and DNA hybrids28,29,30. A diverse range of ligatable substrates can be assembled by annealing oligonucleotides with a 5&#39; phosphate to generate juxtaposed 5&#39; and 3&#39; termini in a nucleic acid duplex31,32,33. The most common method of analysis is resolution by urea PAGE in an end-point assay format; however, recent innovations have included the use of capillary gel electrophoresis, which allows high throughput34, mass-spectrometric profiling35, as well as a homogenous molecular beacon assay, which allows time-resolved monitoring36.
The first step in a ligation reaction is the adenylation of the ligase enzyme by adenosine triphosphate (ATP) or Nicotinamide adenine dinucleotide (NAD), resulting in a covalent enzyme intermediate. The second step in the reaction is adenylation of the nucleic acid substrate on the 5&#39; end of the nick site, which is followed by ligation of the nucleic acid nick strands. Many ligase enzymes that are recombinantly expressed in E. coli are purified in the adenylated form and, therefore, are able to successfully ligate nucleic acids without the addition of a nucleotide cofactor. This makes it difficult to determine what particular type of nucleotide cofactor they require for the ligation of nucleic acids. In addition to describing assays to evaluate DNA ligase activity, a method to reliably determine the cofactor usage by de-adenylating the enzyme using unlabeled substrates is also presented.
Nucleases are a large and diverse group of DNA/RNA modifying enzymes and catalytic RNAs that cleave the phosphodiester bonds between nucleic acids37. Nuclease enzyme functionalities are required in DNA replication, repair, and RNA processing and can be classified by their sugar specificity for DNA, RNA, or both. Endonucleases hydrolyze the phosphodiester bonds within a DNA/RNA strand, while exonucleases hydrolyze DNA/RNA strands one nucleotide at a time from the 3&#39; or 5&#39; end and may do so from either the 3&#39; to 5&#39; or the 5&#39; to 3&#39; end of the DNA38.
While many nuclease proteins are non-specific and may be involved in multiple processes, others are highly specific for a particular sequence or DNA damage6,39,40. Sequence-specific nucleases are used in a wide range of biotechnological applications, such as cloning, mutagenesis, and genome editing. Popular nucleases for these applications are restriction nucleases41, zinc-finger nucleases42, transcriptional activator-like effector nucleases, and most recently, the RNA-guided engineered CRISPR nucleases43. Damage-specific nucleases have recently been identified, such as the EndoMS nuclease, which has specificity for mismatches in the DNA through its mismatch-specific RecB-like nuclease domain5,44. Nuclease activity assays, historically, have been done as discontinuous assays with radiolabeled substrates; however, in addition to their other drawbacks, these do not allow the identification of the site that is cut by a nuclease protein, which is possible when using fluorescently labeled substrates45,46. More recently, continuous nuclease assays have been developed which work by using different DNA dyes that interact with DNA in different states; for example, emitting a higher fluorescent signal when interacting with dsDNA than in its unbound state, or binding specifically to short RNAs47. Other continuous nuclease assays use DNA hairpins with a fluorophore group on the 5&#39; and a quencher on the 3&#39; end so that fluorescence increases as the oligonucleotide is degraded due to a separation of the fluorophore and the quencher48.&#160;While these assays allow one to characterize the kinetics of DNA-degrading proteins, they require previous knowledge of the enzyme&#39;s function and substrate and are also limited to enzymes that change the DNA conformation to cause a difference in dye binding. For this reason, endpoint assays that resolve individual nuclease products are still desirable to provide insight into DNA modifications caused by protein activity.
Here, a detailed procedure is presented for the design of fluorescently labeled DNA/RNA oligonucleotides that can be mixed and matched to generate substrates for testing the activity of novel nuclease, polymerase, and ligase enzymes. The validation of this basic set of oligonucleotide sequences simplifies experimental design and facilitates economical profiling of a wide range of enzymatic functionalities without needing to purchase a large number of bespoke substrates. A detailed procedure is provided for running a standard DNA-processing enzyme assay with these substrates, using the example of DNA ligase activity and modifications for assaying and analyzing nuclease and polymerase enzymes are described. In addition, a modified assay for determining the cofactor specificity of the DNA ligase enzyme with high accuracy is given, and dual-labeled probes are used to evaluate the assembly of multi-component ligations. Finally, modifications to the basic assay format are discussed to allow it to be used to determine protein-DNA interactions with the same substrates by the electrophoretic mobility shift assay (EMSA).

تسليط الضوء على المؤلف: توصيف الإنزيمات الجديدة من المحبة للأطراف المتطرفة ومسببات الأمراض الشائعة لفهم إصلاح الحمض النووي وتكراره

استخدام قليل النيوكليوتيدات الاصطناعية المعدلة لفحص إنزيمات استقلاب الحمض النووي

So my research group, we're really interested in enzymes involved in DNA replication and repair. In particular, we're studying enzymes from extremophilic microorganisms and also from pathogens because we want to understand how these enzymes let those organisms survive environmental challenges. We're interested both in the biological function of the enzymes and also in the biotechnological applications.So we work a lot with DNA and RNA ligases, and we've recently established the role of a minimal type of DNA ligase which seems to be trafficked to the outside of bacterial cell. And we've determined that this plays a role in biofilm formation in the pathogen Neisseria gonorrhoeae. We've also, together with our collaborators from ArcticZymes characterized a novel RNA-to-DNA ligase which is able to attach DNA adapters to either end of a piece of RNA.So our collaborators at ArcticZymes, who've also contributed to this protocol, are characterizing different DNA and RNA-metabolizing enzymes which have potential applications in molecular biology. And so they're using this type of protocol as a first step for understanding the spectrum of activities these enzymes have and benchmarking them relative to what's already available on the market. The protocol offers an easier and safer alternative for assaying nucleic acid metabolizing enzymes compared to the use of radiolabeled substrates.The fluorescently labeled DNA or RNA substrates make our approach more efficient, as we can mix and match the oligonucleotides to make a variety of substrates. So at the moment, we're really focused on understanding the biological function of some novel nucleases that we've discovered in an Antarctic environmental genome. These nucleases have homologs in other extremophilic organisms, and so we're trying to understand what role they play in allowing these microbes to survive.We're also really interested in the activity of some of our novel enzymes on non-natural nucleic acid analogs and their potential uses as part of a molecular biology toolkit with non-natural DNA and RNA substrates.

الربط بواسطة إنزيم ربط الحمض النووي سيؤدي النشاط الأنزيمي لإنزيم ربط الحمض النووي إلى زيادة في حجم قليل النوكليوتيد المسمى بالفلورسنت عند تصوره على هلام اليوريا PAGE. في حالة الركائز لكل من ربط الحمض النووي والحمض النووي الريبي المدرجة في الجدول 2 ، فإن هذا يتوافق مع مضا...

هنا ، يتم تقديم بروتوكول لفحص إنزيمات استقلاب الحمض النووي ، باستخدام أمثلة على إنزيمات ligase و nuclease و polymerase. يستخدم الفحص قليل النيوكليوتيدات الموسومة بالفلورسنت وغير المسماة والتي يمكن دمجها لتشكيل دوبلكس تحاكي أضرار الحمض النووي الريبي و / أو الحمض النووي أو وسيطة المسار ، مما يسمح بتوصيف سلوك الإنزيم.

The availability of a range of modified synthetic oligonucleotides from commercial vendors has allowed the development of sophisticated assays to ...

using-modified-synthetic-oligonucleotides-to-assay-nucleic-acid

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Using Modified Synthetic Oligonucleotides to Assay Nucleic Acid-Metabolizing Enzymes

The availability of a range of modified synthetic oligonucleotides from commercial vendors has allowed the development of sophisticated assays to characterize diverse properties of nucleic acid metabolizing enzymes that can be run in any standard molecular biology lab. The use of fluorescent labels has made these methods accessible to researchers with standard PAGE electrophoresis equipment and a fluorescent-enabled imager, without using radioactive materials or requiring a lab designed for the storage and preparation of radioactive materials, i.e., a Hot Lab. The optional addition of standard modifications such as phosphorylation can simplify assay setup, while the specific incorporation of modified nucleotides that mimic DNA damages or intermediates can be used to probe specific aspects of enzyme behavior. Here, the design and execution of assays to interrogate several aspects of DNA processing by enzymes using commercially available synthetic oligonucleotides are demonstrated. These include the ability of ligases to join or nucleases to degrade different DNA and RNA hybrid structures, differential cofactor usage by the DNA ligase, and evaluation of the DNA-binding capacity of enzymes. Factors to consider when designing synthetic nucleotide substrates are discussed, and a basic set of oligonucleotides that can be used for a range of nucleic acid ligase, polymerase, and nuclease enzyme assays are provided.

Here, a protocol for assaying nucleic acid metabolizing enzymes is presented, using examples of ligase, nuclease, and polymerase enzymes. The assay utilizes fluorescently labeled and unlabeled oligonucleotides that can be combined to form duplexes mimicking RNA and/or DNA damages or pathway intermediates, allowing for the characterization of enzyme behavior.

Assembling and Annealing Nucleic Acid Duplexes for Characterizing Enzymatic DNA Processing with Modified Oligonucleotides

To begin, centrifuge the lyophilized oligonucleotide-containing tube at full speed in a benchtop centrifuge for two to five minutes. Resuspend the oligonucleotides in TE buffer to prepare a master stock of 100 micromolar and gently vortex the tube. Dilute an aliquot of master stock with TE buffer to prepare a 10-micromolar stock and prepare the reaction master mix.After dispensing the mix to the required tubes, anneal the oligonucleotides in a thermocycler at 95 degrees Celsius for five minutes. Let the tube cool to room temperature for 30 minutes to one hour. Then add nucleotide co-factors and other heat-sensitive buffer components to the master mix.If required, store the mix at 20 degrees Celsius for future use. Combine 22.5 microliters of the substrate master mix with 2.5 microliters of the DNA ligase in a PCR tube. Immediately place the reaction tubes in a PCR machine at 25 degrees Celsius for 30 minutes.To quench the reaction, add five microliters of loading dye and incubate at 95 degrees Celsius for five minutes.

تجميع وتلدين دوبلكس الحمض النووي لتوصيف معالجة الحمض النووي الأنزيمي باستخدام قليل النيوكليوتيدات المعدلة

Urea-Polyacrylamide Gel Electrophoresis (PAGE) for Probing DNA Enzyme Activities Employing Commercial Oligonucleotides

To begin, prepare a stock of 20%acrylamide, seven-molar urea and 1X TBE solution. For one gel, combine 10 milliliters of acrylamide and urea solution with 100 microliters of 10%ammonium persulfate and three microliters of tetramethylethylenediamine, and cast it in a gel caster. After the gel solidifies, pre-run the gel in 1X TBE buffer for 30 minutes at 10 milliamperes per gel with external heating.Using a Pasteur pipette, flush 1X TBE into the gel wells to remove excess urea. Load 10 microliters of each reaction, and run for one to 1.5 hours at 45 to 55 degrees Celsius. Visualize the gel with the correct settings for the chosen fluorophore.Finally, quantify the band intensity of the product and the substrate using ImageJ, and calculate the percentage of the product using the formula. DNA ligase activity led to an increase in oligonucleotide size from 20 nucleotides to 40 nucleotides observed on a urea PAGE gel. The bacterial DNA ligase ligated both nicked and mismatch DNA substrates and can utilize both magnesium and manganese for ligation activity with a preference for magnesium.