Name: Auteur in de schijnwerpers: het karakteriseren van nieuwe enzymen van extremofielen en veel voorkomende ziekteverwekkers om DNA-reparatie en -replicatie te begrijpen
Uploaded: 2024-07-05T14:30:00
Description: The availability of a range of modified synthetic oligonucleotides from commercial vendors has allowed the development of sophisticated assays to ...

AW wordt ondersteund door een Rutherford Discovery Fellowship (20-UOW-004). RS is de ontvanger van een Nieuw-Zeelandse Post Antarctic Scholarship. SG en UR erkennen het Chemisch Instituut van de Universiteit van Tromsø - de Noorse Arctische Universiteit voor technische ondersteuning.

1. Ontwerp en aankoop van oligonucleotiden
OPMERKING: Ontwerp enkelstrengs oligonucleotiden die moeten worden geassembleerd en gegloeid tot de gewenste duplexen. Een of meer van de strengen in een duplex moeten een fluorescerend deel dragen om de verwerking van oligonucleotide door het betreffende enzym te kunnen volgen. Tabel 1 bevat een basisset van enkelstrengs sequenties die voor een reeks activiteiten kunnen worden samengesteld.
<ol><li>Neem de specifie...

Testen voor DNA-enzymen met behulp van synthetische oligonucleotiden

Cruciale stappen in het protocol Ontwerp en aankoop van oligonucleotide: Bij de aankoop van de oligonucleotiden voor duplexvorming is het essentieel om rekening te houden met het sequentieontwerp. Het wordt aanbevolen om een oligo-analysetool te gebruiken om eigenschappen van de nucleotidesequentie te voorspellen, zoals GC-gehalte, smelttemperatuur, secundaire structuur en dimerisatiepotentieel, voordat u57 bestelt.
Assemblage en gloeien van nucleïn...

Alle levensvormen hebben nucleïnezuurverwerkende enzymen nodig om fundamentele biologische processen uit te voeren, waaronder replicatie, transcriptie en DNA-reparatie. De belangrijkste enzymatische functionaliteiten voor deze routes zijn polymerasen, die kopieën van RNA/DNA-moleculen genereren, ligases die zich aansluiten bij polynucleotidesubstraten, nucleasen die ze afbreken, en helicasen en topoisomerasen, die nucleïnezuurduplexen smelten of hun topologie veranderen 1,2,3,4,5,6,7,8,9,10 . Bovendien bieden veel van deze enzymen essentiële moleculaire hulpmiddelen voor toepassingen zoals klonen, diagnostiek en high-throughput sequencing 11,12,13,14,15.
De functionele kenmerken, kinetiek en substraatspecificiteiten van deze enzymen kunnen worden bepaald met behulp van gelabelde DNA/RNA-substraten die worden geproduceerd door oligonucleotiden te gloeien. Het traceren van substraten en producten wordt van oudsher bereikt door het aanbrengen van een radioactief label (32P) aan het uiteinde van de 5'-streng, dat vervolgens kan worden gedetecteerd met fotografische film of met een fosforbeeldvormingssysteem16,17. Hoewel radioactief gelabelde substraten het voordeel bieden van een verhoogde experimentele gevoeligheid en de chemische eigenschappen van een nucleotide niet veranderen, hebben de potentiële gezondheidsrisico's van het werken met radio-isotopen de ontwikkeling van niet-radioactieve nucleïnezuuretikettering aangemoedigd om een veiliger alternatief te bieden voor DNA- en RNA-detectie 18,19,20 . Hiervan vallen fluorescentiedetectie, inclusief directe fluorescentiedetectie, tijdopgeloste fluorescentie en energieoverdracht/fluorescentie-afschriktesten op als de meest veelzijdige 21,22,23,24. Het uitgebreide scala aan fluoroforen maakt verschillende ontwerpen van DNA/RNA-substraten mogelijk met unieke reporters op elk oligonucleotide25. Bovendien stelt de stabiliteit van fluoroforen, in vergelijking met radio-isotopen, gebruikers in staat om aanzienlijke hoeveelheden fluorescerend gelabelde DNA-substraten te produceren en te bewaren19. Deze met fluorofoor gelabelde substraten kunnen worden geïncubeerd met het eiwit van belang, samen met verschillende combinaties van metaal- en nucleotide-cofactoren, om bindings- en/of enzymactiviteit te analyseren. Visualisatie van binding of activiteit kan worden waargenomen met behulp van verschillende fluorofoorkleurkanalen met een gelbeeldvormingssysteem. Aangezien met deze techniek alleen de fluorescerend gelabelde oligonucleotiden zichtbaar zullen zijn, zal elke toename of afname van de grootte van het gelabelde oligonucleotide gemakkelijk te volgen zijn. Gels kunnen daarna ook worden gekleurd, met nucleïnezuurkleuringskleurstoffen om alle DNA-banden die op de gel aanwezig zijn te visualiseren.
Polynucleïnezuurligases zijn enzymen die fragmenten van DNA/RNA samenvoegen en de afdichting van breuken katalyseren door de vorming van een fosfodiësterbinding tussen 5' gefosforyleerde DNA-termini en de 3' OH van DNA. Ze kunnen in twee groepen worden verdeeld op basis van hun nucleotidesubstraatvereiste. De sterk geconserveerde NAD-afhankelijke ligases worden aangetroffen in alle bacteriën26, terwijl de structureel diverse ATP-afhankelijke enzymen in alle domeinen van het leven kunnen worden geïdentificeerd 8,27. DNA-ligases spelen een belangrijke rol bij de verwerking van Okazaki-fragmenten tijdens replicatie en zijn ook betrokken bij verschillende DNA-herstelroutes, zoals nucleotide- en base-excisiereparatie, door het afdichten van spontane inkepingen en inkepingen die overblijven na reparatie 8,10. Verschillende DNA-ligases vertonen verschillende capaciteiten om verschillende conformaties van DNA-breuken te verbinden, waaronder inkepingen in een duplex, dubbelstrengs breuken, mismatches en hiaten, evenals RNA- en DNA-hybriden 28,29,30. Een breed scala aan ligeerbare substraten kan worden geassembleerd door oligonucleotiden te gloeien met een 5'-fosfaat om naast elkaar geplaatste 5'- en 3'-termini te genereren in een nucleïnezuurduplex 31,32,33. De meest gebruikelijke analysemethode is resolutie door ureum PAGE in een eindpuntanalyseformaat; Recente innovaties zijn echter het gebruik van capillaire gelelektroforese, die een hoge doorvoer mogelijk maakt34, massaspectrometrische profilering35, evenals een homogene moleculaire bakentest, die tijdopgeloste monitoring mogelijk maakt36.
De eerste stap in een ligatiereactie is de adenylering van het ligase-enzym door adenosinetrifosfaat (ATP) of nicotinamide-adeninedinucleotide (NAD), wat resulteert in een covalent enzymtussenproduct. De tweede stap in de reactie is adenylering van het nucleïnezuursubstraat aan het 5'-uiteinde van de nick-plaats, gevolgd door ligatie van de nucleïnezuur-nick-strengen. Veel ligase-enzymen die recombinant tot expressie worden gebracht in E. coli worden gezuiverd in de geadenyleerde vorm en zijn daarom in staat om nucleïnezuren met succes te ligeren zonder de toevoeging van een nucleotide-cofactor. Dit maakt het moeilijk om te bepalen welk specifiek type nucleotide-cofactor ze nodig hebben voor de ligatie van nucleïnezuren. Naast het beschrijven van assays om de activiteit van DNA-ligase te evalueren, wordt ook een methode gepresenteerd om het cofactorgebruik betrouwbaar te bepalen door het enzym te de-adenyleren met behulp van niet-gelabelde substraten.
Nucleasen zijn een grote en diverse groep DNA/RNA-modificerende enzymen en katalytische RNA's die de fosfodiësterbindingen tussen nucleïnezuren splitsen37. Nuclease-enzymfunctionaliteiten zijn vereist bij DNA-replicatie, -reparatie en RNA-verwerking en kunnen worden geclassificeerd op basis van hun suikerspecificiteit voor DNA, RNA of beide. Endonucleasen hydrolyseren de fosfodiësterbindingen binnen een DNA/RNA-streng, terwijl exonucleasen DNA/RNA-strengen één nucleotide tegelijk hydrolyseren vanaf het 3' of 5' uiteinde en dit kunnen doen van het 3' tot 5' of het 5' tot 3' uiteinde van het DNA38.
Hoewel veel nuclease-eiwitten niet-specifiek zijn en bij meerdere processen betrokken kunnen zijn, zijn andere zeer specifiek voor een bepaalde sequentie of DNA-schade 6,39,40. Sequentiespecifieke nucleasen worden gebruikt in een breed scala aan biotechnologische toepassingen, zoals klonen, mutagenese en genoombewerking. Populaire nucleasen voor deze toepassingen zijn restrictienucleasen41, zinkvingernucleasen42, transcriptionele activator-achtige effectornucleasen en meest recentelijk de RNA-geleide gemanipuleerde CRISPR-nucleasen43. Schadespecifieke nucleasen zijn onlangs geïdentificeerd, zoals het EndoMS-nuclease, dat specifiek is voor mismatches in het DNA via zijn mismatch-specifieke RecB-achtige nucleasedomein 5,44. Nuclease-activiteitstesten zijn in het verleden uitgevoerd als discontinue tests met radioactief gelabelde substraten; Naast hun andere nadelen maken deze echter niet de identificatie mogelijk van de plaats die wordt doorsneden door een nuclease-eiwit, wat mogelijk is bij gebruik van fluorescerend geëtiketteerde substraten45,46. Meer recentelijk zijn continue nuclease-assays ontwikkeld die werken door verschillende DNA-kleurstoffen te gebruiken die in verschillende toestanden met DNA interageren; bijvoorbeeld het uitzenden van een hoger fluorescerend signaal bij interactie met dsDNA dan in zijn ongebonden toestand, of specifiek binden aan korte RNA's47. Andere continue nucleasetesten maken gebruik van DNA-haarspelden met een fluorofoorgroep aan de 5' en een quencher aan het 3'-uiteinde, zodat de fluorescentie toeneemt naarmate het oligonucleotide wordt afgebroken als gevolg van een scheiding van de fluorofoor en de quencher48. Hoewel deze tests het mogelijk maken om de kinetiek van DNA-afbrekende eiwitten te karakteriseren, vereisen ze voorkennis van de functie en het substraat van het enzym en zijn ze ook beperkt tot enzymen die de DNA-conformatie veranderen om een verschil in kleurstofbinding te veroorzaken. Om deze reden zijn endpoint-assays die individuele nucleaseproducten oplossen nog steeds wenselijk om inzicht te geven in DNA-modificaties veroorzaakt door eiwitactiviteit.
Hier wordt een gedetailleerde procedure gepresenteerd voor het ontwerp van fluorescerend gelabelde DNA/RNA-oligonucleotiden die kunnen worden gemengd en gematcht om substraten te genereren voor het testen van de activiteit van nieuwe nuclease-, polymerase- en ligase-enzymen. De validatie van deze basisset van oligonucleotidesequenties vereenvoudigt het experimentele ontwerp en vergemakkelijkt de economische profilering van een breed scala aan enzymatische functionaliteiten zonder dat een groot aantal op maat gemaakte substraten hoeft te worden aangeschaft. Er wordt een gedetailleerde procedure gegeven voor het uitvoeren van een standaard DNA-verwerkende enzymtest met deze substraten, met behulp van het voorbeeld van DNA-ligase-activiteit en modificaties voor het testen en analyseren van nuclease- en polymerase-enzymen worden beschreven. Bovendien wordt een gewijzigde test gegeven voor het bepalen van de cofactorspecificiteit van het DNA-ligase-enzym met hoge nauwkeurigheid, en worden dubbel gelabelde sondes gebruikt om de assemblage van ligaties met meerdere componenten te evalueren. Ten slotte worden aanpassingen aan het basistestformaat besproken om het mogelijk te maken om eiwit-DNA-interacties met dezelfde substraten te bepalen door middel van de elektroforetische mobiliteitsverschuivingstest (EMSA).

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>30% Acrylamide/Bis Solution (29:1)</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>1610156</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adenosine triphosphate (ATP)</td>
			<td>Many suppliers</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium persulfate (APS)</td>
			<td>Many suppliers</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Benchtop centrifuge</td>
			<td>Many suppliers</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Borate</td>
			<td>Many suppliers</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bromophenol blue</td>
			<td>Many suppliers</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dithiothreitol (DTT)</td>
			<td>Many suppliers</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electrophoresis system with circulating water bath</td>
			<td>Many suppliers</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)</td>
			<td>Many suppliers</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluoresnence imager, e.g. iBright FL1000</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A32752</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formamide</td>
			<td>Many suppliers</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gel casting system</td>
			<td>Many suppliers</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heating block</td>
			<td>Many suppliers</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium Chloride</td>
			<td>Many suppliers</td>
			<td></td>
			<td>Other metal ions may be preferred depending on the protein studied</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge tubes (1.5 mL)</td>
			<td>Many suppliers</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micropipettes and tips</td>
			<td>Many suppliers</td>
			<td></td>
			<td>1 mL, 0.2 mL, 0.02 mL, 0.002 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nicotinamide adenine dinucleotide (NAD+)</td>
			<td>Many suppliers</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oligonucleotides</td>
			<td>Integrated DNA Technologies</td>
			<td>NA</td>
			<td>Thermo Fisher, Sigma-Aldrich,&#160; Genscript and others also supply these</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pasture pipette</td>
			<td>Many suppliers</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCR thermocycler</td>
			<td>Many suppliers</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCR tubes</td>
			<td>Many suppliers</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNAse away</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>7002PK</td>
			<td>Only needed when working with RNA oligos</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNase AWAY</td>
			<td>Merck</td>
			<td>83931-250ML</td>
			<td>Surfactant for removal of RNAse contamination on surfaces</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNAse-free water</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>B1500L</td>
			<td>Only needed when working with RNA oligos</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride</td>
			<td>Many suppliers</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SUPERase IN RNase inhibitor</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>AM2694</td>
			<td>Broad spectrum RNAse inhibitir (protein-based)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SYBR Gold</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>S11494</td>
			<td>This may be used to post-stain gels and visualise unlabelled oligonucleotides</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tetramethylethylenediamine (TMED)</td>
			<td>Many suppliers</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris, or tris(hydroxymethyl)aminomethane</td>
			<td>Many suppliers</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultrapure water (Milli-Q)</td>
			<td>Merck</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>urea</td>
			<td>Many suppliers</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortex</td>
			<td>Many suppliers</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

using modified synthetic oligonucleotides to assay nucleic acid-metabolizing enzymes

De beschikbaarheid van een reeks gemodificeerde synthetische oligonucleotiden van commerciële leveranciers heeft de ontwikkeling mogelijk gemaakt van geavanceerde assays om diverse eigenschappen van nucleïnezuurmetaboliserende enzymen te karakteriseren die in elk standaard moleculair-biologisch laboratorium kunnen worden uitgevoerd. Het gebruik van fluorescerende labels heeft deze methoden toegankelijk gemaakt voor onderzoekers met standaard PAGE-elektroforese-apparatuur en een fluorescerende imager, zonder radioactieve materialen te gebruiken of een laboratorium nodig te hebben dat is ontworpen voor de opslag en bereiding van radioactieve materialen, d.w.z. een Hot Lab. De optionele toevoeging van standaardmodificaties zoals fosforylering kan het instellen van de test vereenvoudigen, terwijl de specifieke opname van gemodificeerde nucleotiden die DNA-schade of tussenproducten nabootsen, kan worden gebruikt om specifieke aspecten van enzymgedrag te onderzoeken. Hier worden het ontwerp en de uitvoering gedemonstreerd van tests om verschillende aspecten van DNA-verwerking door enzymen te ondervragen met behulp van in de handel verkrijgbare synthetische oligonucleotiden. Deze omvatten het vermogen van ligases om zich te verbinden of nucleasen om verschillende DNA- en RNA-hybride structuren af te breken, differentieel cofactorgebruik door de DNA-ligase en evaluatie van het DNA-bindende vermogen van enzymen. Factoren waarmee rekening moet worden gehouden bij het ontwerpen van synthetische nucleotidesubstraten worden besproken en er wordt een basisset oligonucleotiden verstrekt die kunnen worden gebruikt voor een reeks nucleïnezuurligase-, polymerase- en nuclease-enzymassays.

All life forms require nucleic acid processing enzymes to carry out fundamental biological processes, including replication, transcription, and DNA repair. Key enzymatic functionalities for these pathways are polymerases, which generate copies of RNA/DNA molecules, ligases which join polynucleotide substrates, nucleases that degrade them, and helicases and topoisomerases, which melt nucleic acid duplexes or change their topology1,2,3,4,5,6,7,8,9,10. In addition, many of these enzymes provide essential molecular tools for applications such as cloning, diagnostics, and high-throughput sequencing11,12,13,14,15.
The functional characteristics, kinetics, and substrate specificities of these enzymes can be determined using labeled DNA/RNA substrates produced by annealing oligonucleotides. Tracking substrates and products has traditionally been achieved by introducing a radioactive label (32P) at either the 5&#39; strand end, which can then be detected by photographic film or with a phosphor imaging system16,17. While radiolabeled substrates offer the benefit of increased experimental sensitivity and do not alter the chemical properties of a nucleotide, the potential health hazards from working with radioisotopes have encouraged the development of non-radioactive nucleic acid labeling to provide a safer alternative for DNA and RNA detection18,19,20. Among these, fluorescence detection, including direct fluorescence detection, time-resolved fluorescence, and energy transfer/fluorescence quenching assays stand out as the most versatile21,22,23,24. The extensive array of fluorophores enables different designs of DNA/RNA substrates featuring unique reporters on each oligonucleotide25. Additionally, the stability of fluorophores, when compared to radioisotopes, allows users to produce and preserve significant quantities of fluorescently labeled DNA substrates19. These fluorophore-labeled substrates can be incubated with the protein of interest, along with different combinations of metal and nucleotide cofactors, to analyze binding and or enzyme activity. Visualization of binding or activity can be observed using various fluorophore dye channels with a gel imaging system. As only the fluorescently labeled oligonucleotides will be visible using this technique, any increase or decrease in the size of the labeled oligonucleotide will be easy to follow. Gels can also be stained afterward, with nucleic acid staining dyes to visualize all DNA bands present on the gel.
Poly-nucleic acid ligases are enzymes that join fragments of DNA/RNA, catalyzing the sealing of breaks by the formation of a phosphodiester bond between 5&#39; phosphorylated DNA termini and the 3&#39; OH of DNA. They can be divided into two groups according to their nucleotide substrate requirement. The highly conserved NAD-dependent ligases are found in all bacteria26 while the structurally diverse ATP-dependent enzymes can be identified through all domains of life8,27. DNA ligases play an important role in Okazaki fragment processing during replication as well as being involved in various DNA repair pathways, such as nucleotide and base excision repair, through the sealing of spontaneous nicks and nicks that are left after repair8,10. Different DNA ligases exhibit varying capacities to join different conformations of DNA breaks, including nicks in a duplex, double-stranded breaks, mismatches, and gaps, as well as RNA and DNA hybrids28,29,30. A diverse range of ligatable substrates can be assembled by annealing oligonucleotides with a 5&#39; phosphate to generate juxtaposed 5&#39; and 3&#39; termini in a nucleic acid duplex31,32,33. The most common method of analysis is resolution by urea PAGE in an end-point assay format; however, recent innovations have included the use of capillary gel electrophoresis, which allows high throughput34, mass-spectrometric profiling35, as well as a homogenous molecular beacon assay, which allows time-resolved monitoring36.
The first step in a ligation reaction is the adenylation of the ligase enzyme by adenosine triphosphate (ATP) or Nicotinamide adenine dinucleotide (NAD), resulting in a covalent enzyme intermediate. The second step in the reaction is adenylation of the nucleic acid substrate on the 5&#39; end of the nick site, which is followed by ligation of the nucleic acid nick strands. Many ligase enzymes that are recombinantly expressed in E. coli are purified in the adenylated form and, therefore, are able to successfully ligate nucleic acids without the addition of a nucleotide cofactor. This makes it difficult to determine what particular type of nucleotide cofactor they require for the ligation of nucleic acids. In addition to describing assays to evaluate DNA ligase activity, a method to reliably determine the cofactor usage by de-adenylating the enzyme using unlabeled substrates is also presented.
Nucleases are a large and diverse group of DNA/RNA modifying enzymes and catalytic RNAs that cleave the phosphodiester bonds between nucleic acids37. Nuclease enzyme functionalities are required in DNA replication, repair, and RNA processing and can be classified by their sugar specificity for DNA, RNA, or both. Endonucleases hydrolyze the phosphodiester bonds within a DNA/RNA strand, while exonucleases hydrolyze DNA/RNA strands one nucleotide at a time from the 3&#39; or 5&#39; end and may do so from either the 3&#39; to 5&#39; or the 5&#39; to 3&#39; end of the DNA38.
While many nuclease proteins are non-specific and may be involved in multiple processes, others are highly specific for a particular sequence or DNA damage6,39,40. Sequence-specific nucleases are used in a wide range of biotechnological applications, such as cloning, mutagenesis, and genome editing. Popular nucleases for these applications are restriction nucleases41, zinc-finger nucleases42, transcriptional activator-like effector nucleases, and most recently, the RNA-guided engineered CRISPR nucleases43. Damage-specific nucleases have recently been identified, such as the EndoMS nuclease, which has specificity for mismatches in the DNA through its mismatch-specific RecB-like nuclease domain5,44. Nuclease activity assays, historically, have been done as discontinuous assays with radiolabeled substrates; however, in addition to their other drawbacks, these do not allow the identification of the site that is cut by a nuclease protein, which is possible when using fluorescently labeled substrates45,46. More recently, continuous nuclease assays have been developed which work by using different DNA dyes that interact with DNA in different states; for example, emitting a higher fluorescent signal when interacting with dsDNA than in its unbound state, or binding specifically to short RNAs47. Other continuous nuclease assays use DNA hairpins with a fluorophore group on the 5&#39; and a quencher on the 3&#39; end so that fluorescence increases as the oligonucleotide is degraded due to a separation of the fluorophore and the quencher48.&#160;While these assays allow one to characterize the kinetics of DNA-degrading proteins, they require previous knowledge of the enzyme&#39;s function and substrate and are also limited to enzymes that change the DNA conformation to cause a difference in dye binding. For this reason, endpoint assays that resolve individual nuclease products are still desirable to provide insight into DNA modifications caused by protein activity.
Here, a detailed procedure is presented for the design of fluorescently labeled DNA/RNA oligonucleotides that can be mixed and matched to generate substrates for testing the activity of novel nuclease, polymerase, and ligase enzymes. The validation of this basic set of oligonucleotide sequences simplifies experimental design and facilitates economical profiling of a wide range of enzymatic functionalities without needing to purchase a large number of bespoke substrates. A detailed procedure is provided for running a standard DNA-processing enzyme assay with these substrates, using the example of DNA ligase activity and modifications for assaying and analyzing nuclease and polymerase enzymes are described. In addition, a modified assay for determining the cofactor specificity of the DNA ligase enzyme with high accuracy is given, and dual-labeled probes are used to evaluate the assembly of multi-component ligations. Finally, modifications to the basic assay format are discussed to allow it to be used to determine protein-DNA interactions with the same substrates by the electrophoretic mobility shift assay (EMSA).

Auteur in de schijnwerpers: het karakteriseren van nieuwe enzymen van extremofielen en veel voorkomende ziekteverwekkers om DNA-reparatie en -replicatie te begrijpen

Gebruik van gemodificeerde synthetische oligonucleotiden om nucleïnezuurmetaboliserende enzymen te testen

So my research group, we're really interested in enzymes involved in DNA replication and repair. In particular, we're studying enzymes from extremophilic microorganisms and also from pathogens because we want to understand how these enzymes let those organisms survive environmental challenges. We're interested both in the biological function of the enzymes and also in the biotechnological applications.So we work a lot with DNA and RNA ligases, and we've recently established the role of a minimal type of DNA ligase which seems to be trafficked to the outside of bacterial cell. And we've determined that this plays a role in biofilm formation in the pathogen Neisseria gonorrhoeae. We've also, together with our collaborators from ArcticZymes characterized a novel RNA-to-DNA ligase which is able to attach DNA adapters to either end of a piece of RNA.So our collaborators at ArcticZymes, who've also contributed to this protocol, are characterizing different DNA and RNA-metabolizing enzymes which have potential applications in molecular biology. And so they're using this type of protocol as a first step for understanding the spectrum of activities these enzymes have and benchmarking them relative to what's already available on the market. The protocol offers an easier and safer alternative for assaying nucleic acid metabolizing enzymes compared to the use of radiolabeled substrates.The fluorescently labeled DNA or RNA substrates make our approach more efficient, as we can mix and match the oligonucleotides to make a variety of substrates. So at the moment, we're really focused on understanding the biological function of some novel nucleases that we've discovered in an Antarctic environmental genome. These nucleases have homologs in other extremophilic organisms, and so we're trying to understand what role they play in allowing these microbes to survive.We're also really interested in the activity of some of our novel enzymes on non-natural nucleic acid analogs and their potential uses as part of a molecular biology toolkit with non-natural DNA and RNA substrates.

Ligatie door DNA-ligase De enzymatische activiteit van DNA-ligase zal resulteren in een toename van de grootte van het fluorescerend gelabelde oligonucleotide wanneer het wordt gevisualiseerd op een ureum PAGE-gel. In het geval van de substraten voor zowel DNA- als RNA-ligatie die in tabel 2 zijn vermeld, komt dit overeen met een verdubbeling in grootte van 20 nt naar 40 nt (figuur 3A). Optimale enzymactiviteit kan worden bepaald door veranderende omstand...

Hier wordt een protocol gepresenteerd voor het bepalen van nucleïnezuurmetaboliserende enzymen, met behulp van voorbeelden van ligase-, nuclease- en polymerase-enzymen. De test maakt gebruik van fluorescerend gelabelde en niet-gelabelde oligonucleotiden die kunnen worden gecombineerd om duplexen te vormen die RNA- en/of DNA-schade of tussenproducten van de route nabootsen, waardoor het enzymgedrag kan worden gekarakteriseerd.

The availability of a range of modified synthetic oligonucleotides from commercial vendors has allowed the development of sophisticated assays to ...

using-modified-synthetic-oligonucleotides-to-assay-nucleic-acid

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Using Modified Synthetic Oligonucleotides to Assay Nucleic Acid-Metabolizing Enzymes

The availability of a range of modified synthetic oligonucleotides from commercial vendors has allowed the development of sophisticated assays to characterize diverse properties of nucleic acid metabolizing enzymes that can be run in any standard molecular biology lab. The use of fluorescent labels has made these methods accessible to researchers with standard PAGE electrophoresis equipment and a fluorescent-enabled imager, without using radioactive materials or requiring a lab designed for the storage and preparation of radioactive materials, i.e., a Hot Lab. The optional addition of standard modifications such as phosphorylation can simplify assay setup, while the specific incorporation of modified nucleotides that mimic DNA damages or intermediates can be used to probe specific aspects of enzyme behavior. Here, the design and execution of assays to interrogate several aspects of DNA processing by enzymes using commercially available synthetic oligonucleotides are demonstrated. These include the ability of ligases to join or nucleases to degrade different DNA and RNA hybrid structures, differential cofactor usage by the DNA ligase, and evaluation of the DNA-binding capacity of enzymes. Factors to consider when designing synthetic nucleotide substrates are discussed, and a basic set of oligonucleotides that can be used for a range of nucleic acid ligase, polymerase, and nuclease enzyme assays are provided.

Here, a protocol for assaying nucleic acid metabolizing enzymes is presented, using examples of ligase, nuclease, and polymerase enzymes. The assay utilizes fluorescently labeled and unlabeled oligonucleotides that can be combined to form duplexes mimicking RNA and/or DNA damages or pathway intermediates, allowing for the characterization of enzyme behavior.

Assembling and Annealing Nucleic Acid Duplexes for Characterizing Enzymatic DNA Processing with Modified Oligonucleotides

To begin, centrifuge the lyophilized oligonucleotide-containing tube at full speed in a benchtop centrifuge for two to five minutes. Resuspend the oligonucleotides in TE buffer to prepare a master stock of 100 micromolar and gently vortex the tube. Dilute an aliquot of master stock with TE buffer to prepare a 10-micromolar stock and prepare the reaction master mix.After dispensing the mix to the required tubes, anneal the oligonucleotides in a thermocycler at 95 degrees Celsius for five minutes. Let the tube cool to room temperature for 30 minutes to one hour. Then add nucleotide co-factors and other heat-sensitive buffer components to the master mix.If required, store the mix at 20 degrees Celsius for future use. Combine 22.5 microliters of the substrate master mix with 2.5 microliters of the DNA ligase in a PCR tube. Immediately place the reaction tubes in a PCR machine at 25 degrees Celsius for 30 minutes.To quench the reaction, add five microliters of loading dye and incubate at 95 degrees Celsius for five minutes.

Assemblage en gloeien van nucleïnezuurduplexen voor het karakteriseren van enzymatische DNA-verwerking met gemodificeerde oligonucleotiden

Urea-Polyacrylamide Gel Electrophoresis (PAGE) for Probing DNA Enzyme Activities Employing Commercial Oligonucleotides

To begin, prepare a stock of 20%acrylamide, seven-molar urea and 1X TBE solution. For one gel, combine 10 milliliters of acrylamide and urea solution with 100 microliters of 10%ammonium persulfate and three microliters of tetramethylethylenediamine, and cast it in a gel caster. After the gel solidifies, pre-run the gel in 1X TBE buffer for 30 minutes at 10 milliamperes per gel with external heating.Using a Pasteur pipette, flush 1X TBE into the gel wells to remove excess urea. Load 10 microliters of each reaction, and run for one to 1.5 hours at 45 to 55 degrees Celsius. Visualize the gel with the correct settings for the chosen fluorophore.Finally, quantify the band intensity of the product and the substrate using ImageJ, and calculate the percentage of the product using the formula. DNA ligase activity led to an increase in oligonucleotide size from 20 nucleotides to 40 nucleotides observed on a urea PAGE gel. The bacterial DNA ligase ligated both nicked and mismatch DNA substrates and can utilize both magnesium and manganese for ligation activity with a preference for magnesium.