Name: 著者スポットライト:Characterizing Novel Enzymes from Extremophiles and Common Pathogens to Understand DNA Repair and Replication
Uploaded: 2024-07-05T14:30:00
Description: The availability of a range of modified synthetic oligonucleotides from commercial vendors has allowed the development of sophisticated assays to ...

AWは、ラザフォードディスカバリーフェローシップ(20-UOW-004)によってサポートされています。RSは、ニュージーランド ポスト南極奨学金 の受給者です。SGとURは、ノルウェー北極大学トロムソ化学研究所の技術サポートに感謝しています。

1. オリゴヌクレオチドの設計と購入
注:一本鎖オリゴヌクレオチドを設計し、アセンブルして目的の二本鎖にアニーリングします。二本鎖中の1本以上の鎖は、目的の酵素によるオリゴヌクレオチドプロセシングを追跡するための蛍光部分を有していなければならない。さまざまな活動に対してアセンブルできる一本鎖配列の基本セットを 表1に示?...

合成オリゴヌクレオチドを用いたDNA酵素のアッセイ

プロトコルの重要なステップ オリゴヌクレオチドの設計と購入:二本鎖形成用のオリゴヌクレオチドを購入する際には、配列設計を考慮することが不可欠です。オリゴ分析装置ツールを使用して、GC含量、融解温度、二次構造、二量体化電位などのヌクレオチド配列の特性を予測することをお勧めします57。
核酸二本鎖のアセンブルとアニ...

すべての生命体は、複製、転写、DNA修復などの基本的な生物学的プロセスを実行するために核酸処理酵素を必要とします。これらの経路の主要な酵素的機能性は、RNA/DNA分子のコピーを生成するポリメラーゼ、ポリヌクレオチド基質を結合するリガーゼ、それらを分解するヌクレアーゼ、および核酸二本鎖を溶かしたり、そのトポロジーを変化させたりするヘリカーゼとトポイソメラーゼです1,2,3,4,5,6,7,8,9,10 .さらに、これらの酵素の多くは、クローニング、診断、ハイスループットシーケンシングなどのアプリケーションに不可欠な分子ツールを提供します11,12,13,14,15。
これらの酵素の機能特性、速度論、および基質特異性は、オリゴヌクレオチドをアニーリングすることによって産生される標識DNA/RNA基質を用いて決定できます。基板および製品の追跡は、伝統的に、5'鎖端のいずれかに放射性標識(32P)を導入することによって達成され、これはその後、写真フィルムまたは蛍光体イメージングシステム16,17によって検出することができる。放射性標識基質は、実験感度の向上という利点を提供し、ヌクレオチドの化学的性質を変化させないが、放射性同位元素を扱うことによる潜在的な健康被害は、DNAおよびRNA検出のためのより安全な代替手段を提供するための非放射性核酸標識の開発を促進している18,19,20.これらの中で、直接蛍光検出、時間分解蛍光、エネルギー移動/蛍光消光アッセイなどの蛍光検出は、最も汎用性の高いアッセイとして際立っています21,22,23,24。広範な蛍光色素の配列により、各オリゴヌクレオチド25上に独自のレポーターを特徴とするDNA/RNA基質の異なる設計が可能になります。さらに、蛍光色素の安定性は、放射性同位元素と比較した場合、ユーザーは蛍光標識されたDNA基質を大量に生成し保存することができる19。これらの蛍光色素標識基質は、目的のタンパク質とインキュベートし、金属およびヌクレオチド補因子のさまざまな組み合わせとともに、結合活性や酵素活性を解析できます。結合または活性の可視化は、ゲルイメージングシステムを備えたさまざまな蛍光色素チャネルを使用して観察できます。この手法では蛍光標識されたオリゴヌクレオチドのみが見えるため、標識されたオリゴヌクレオチドのサイズの増減を容易に追跡できます。ゲルは、その後、核酸染色色素を使用してゲル上に存在するすべてのDNAバンドを視覚化することもできます。
ポリ核酸リガーゼは、DNA/RNAの断片を結合する酵素であり、5'リン酸化DNA末端とDNAの3'OHとの間のホスホジエステル結合の形成により、切断のシーリングを触媒します。それらは、ヌクレオチド基質の要件に応じて2つのグループに分けることができます。高度に保存されたNAD依存性リガーゼはすべての細菌に見出され26、構造的に多様なATP依存性酵素は、生命の全ての領域を通じて同定することができる8,27。DNAリガーゼは、複製中の岡崎フラグメントプロセシングに重要な役割を果たすとともに、自発的な傷や修復後に残る傷の封鎖を通じて、ヌクレオチドや塩基除去修復などのさまざまなDNA修復経路に関与しています8,10。異なるDNAリガーゼは、二本鎖のニック、二本鎖切断、ミスマッチ、ギャップ、ならびにRNAおよびDNAハイブリッド28,29,30を含む、DNA切断の異なるコンフォメーションを結合するさまざまな能力を示す。オリゴヌクレオチドを5'リン酸でアニーリングすることにより、多様な結合性基質を組み立てることができ、核酸二本鎖31,32,33に並置された5'末端と3'末端を生成します。最も一般的な分析方法は、エンドポイントアッセイ形式での尿素PAGEによる分離です。しかし、最近の技術革新には、ハイスループットを可能にするキャピラリーゲル電気泳動34、質量分析プロファイリング35、および時間分解モニタリング36を可能にする均質分子ビーコンアッセイの使用が含まれる。
ライゲーション反応の最初のステップは、アデノシン三リン酸(ATP)またはニコチンアミドアデニンジヌクレオチド(NAD)によるリガーゼ酵素のアデニル化であり、共有結合酵素中間体が得られます。反応の第2ステップは、ニック部位の5'末端の核酸基質のアデニル化であり、続いて核酸ニック鎖のライゲーションが行われます。 大腸菌 で組換え発現する多くのリガーゼ酵素は、アデニル化形態で精製されるため、ヌクレオチド補因子を添加することなく核酸をうまくライゲーションすることができます。これにより、核酸のライゲーションに必要な特定のタイプのヌクレオチド補因子を決定することが困難になります。DNAリガーゼ活性を評価するためのアッセイについて説明するだけでなく、非標識基質を用いて酵素を脱アデニル化することにより補因子の使用量を確実に決定する方法も提示されます。
ヌクレアーゼは、DNA/RNA修飾酵素および触媒RNAの大規模で多様なグループであり、核酸間のホスホジエステル結合を切断する37。ヌクレアーゼ酵素の機能は、DNAの複製、修復、およびRNAプロセシングに必要であり、DNA、RNA、またはその両方に対する糖特異性によって分類できます。エンドヌクレアーゼはDNA/RNA鎖内のホスホジエステル結合を加水分解し、一方、エキソヌクレアーゼはDNA/RNA鎖を3'または5'末端から一度に1ヌクレオチドを加水分解し、DNA38の3'末端から5'末端または5'末端から3'末端のいずれかから加水分解することができる。
多くのヌクレアーゼタンパク質は非特異的であり、複数のプロセスに関与している可能性があるが、他のタンパク質は特定の配列またはDNA損傷に対して非常に特異的である6,39,40。配列特異的ヌクレアーゼは、クローニング、突然変異誘発、ゲノム編集など、幅広いバイオテクノロジー用途で使用されています。これらのアプリケーションのための一般的なヌクレアーゼは、制限ヌクレアーゼ41、ジンクフィンガーヌクレアーゼ42、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ、そして最近では、RNA誘導改変CRISPRヌクレアーゼ43である。最近、損傷特異的なヌクレアーゼが同定されており、例えばEndoMSヌクレアーゼは、ミスマッチ特異的なRecB様ヌクレアーゼドメイン5,44を通じてDNAのミスマッチに対して特異性を有する。ヌクレアーゼ活性アッセイは、歴史的に、放射性標識基質を用いた不連続アッセイとして行われてきました。しかしながら、それらの他の欠点に加えて、これらは、蛍光標識基質45,46を使用する場合に可能なヌクレアーゼタンパク質によって切断された部位の同定を可能にしない。最近では、さまざまな状態でDNAと相互作用するさまざまなDNA色素を使用して機能する連続ヌクレアーゼアッセイが開発されました。例えば、dsDNAと相互作用するとき、その非結合状態よりも高い蛍光シグナルを放出するか、または短いRNAに特異的に結合する47。他の連続ヌクレアーゼアッセイでは、5'にフルオロフォア基、3'末端にクエンチャーを持つDNAヘアピンを使用し、フルオロフォアとクエンチャー48の分離によりオリゴヌクレオチドが分解されるにつれて蛍光が増加するようにします。これらのアッセイでは、DNA分解タンパク質の動態を特徴付けることができますが、酵素の機能と基質に関する事前の知識が必要であり、また、DNAコンフォメーションを変化させて色素結合に違いを引き起こす酵素に限定されます。このため、個々のヌクレアーゼ産物を分離するエンドポイントアッセイは、タンパク質活性によって引き起こされるDNA修飾に関する洞察を得るために依然として望ましいです。
ここでは、新規ヌクレアーゼ、ポリメラーゼ、およびリガーゼ酵素の活性を試験するための基質を生成するために混合および適合させることができる蛍光標識DNA/RNAオリゴヌクレオチドの設計に関する詳細な手順を示します。このオリゴヌクレオチド配列の基本セットの検証により、実験デザインが簡素化され、特注の基質を大量に購入することなく、幅広い酵素機能の経済的なプロファイリングが容易になります。DNAリガーゼ活性の例を用いて、これらの基質を用いて標準的なDNAプロセッシング酵素アッセイを実行するための詳細な手順が提供され、ヌクレアーゼおよびポリメラーゼ酵素をアッセイおよび分析するための修飾が説明されている。さらに、DNAリガーゼ酵素の補因子特異性を高精度で決定するための修正アッセイが提供され、二重標識プローブを使用して多成分ライゲーションの集合が評価されます。最後に、電気泳動移動度シフトアッセイ(EMSA)によって同じ基質とのタンパク質-DNA相互作用を決定するために使用できるようにするための基本的なアッセイフォーマットの変更について説明します。

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>30% Acrylamide/Bis Solution (29:1)</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>1610156</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adenosine triphosphate (ATP)</td>
			<td>Many suppliers</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium persulfate (APS)</td>
			<td>Many suppliers</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Benchtop centrifuge</td>
			<td>Many suppliers</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Borate</td>
			<td>Many suppliers</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bromophenol blue</td>
			<td>Many suppliers</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dithiothreitol (DTT)</td>
			<td>Many suppliers</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electrophoresis system with circulating water bath</td>
			<td>Many suppliers</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)</td>
			<td>Many suppliers</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluoresnence imager, e.g. iBright FL1000</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A32752</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formamide</td>
			<td>Many suppliers</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gel casting system</td>
			<td>Many suppliers</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heating block</td>
			<td>Many suppliers</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium Chloride</td>
			<td>Many suppliers</td>
			<td></td>
			<td>Other metal ions may be preferred depending on the protein studied</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge tubes (1.5 mL)</td>
			<td>Many suppliers</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micropipettes and tips</td>
			<td>Many suppliers</td>
			<td></td>
			<td>1 mL, 0.2 mL, 0.02 mL, 0.002 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nicotinamide adenine dinucleotide (NAD+)</td>
			<td>Many suppliers</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oligonucleotides</td>
			<td>Integrated DNA Technologies</td>
			<td>NA</td>
			<td>Thermo Fisher, Sigma-Aldrich,&#160; Genscript and others also supply these</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pasture pipette</td>
			<td>Many suppliers</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCR thermocycler</td>
			<td>Many suppliers</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCR tubes</td>
			<td>Many suppliers</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNAse away</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>7002PK</td>
			<td>Only needed when working with RNA oligos</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNase AWAY</td>
			<td>Merck</td>
			<td>83931-250ML</td>
			<td>Surfactant for removal of RNAse contamination on surfaces</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNAse-free water</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>B1500L</td>
			<td>Only needed when working with RNA oligos</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride</td>
			<td>Many suppliers</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SUPERase IN RNase inhibitor</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>AM2694</td>
			<td>Broad spectrum RNAse inhibitir (protein-based)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SYBR Gold</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>S11494</td>
			<td>This may be used to post-stain gels and visualise unlabelled oligonucleotides</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tetramethylethylenediamine (TMED)</td>
			<td>Many suppliers</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris, or tris(hydroxymethyl)aminomethane</td>
			<td>Many suppliers</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultrapure water (Milli-Q)</td>
			<td>Merck</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>urea</td>
			<td>Many suppliers</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortex</td>
			<td>Many suppliers</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

using modified synthetic oligonucleotides to assay nucleic acid-metabolizing enzymes

商業ベンダーからさまざまな修飾合成オリゴヌクレオチドが利用できるようになったため、核酸代謝酵素の多様な特性を特徴付ける洗練されたアッセイの開発が可能になり、標準的な分子生物学研究室で実行できます。蛍光標識の使用により、標準的なPAGE電気泳動装置と蛍光対応イメージャーを使用する研究者は、放射性物質を使用したり、放射性物質の保管と調製のために設計されたラボ(ホットラボ)を必要とせずに、これらの方法にアクセスできるようになりました。リン酸化などの標準的な修飾をオプションで追加することで、アッセイのセットアップを簡素化でき、DNA損傷や中間体を模倣する修飾ヌクレオチドを特異的に組み込むことで、酵素の挙動の特定の側面をプローブすることができます。ここでは、市販の合成オリゴヌクレオチドを用いた酵素によるDNAプロセシングのいくつかの側面を調査するアッセイの設計と実行を実証します。これには、リガーゼが結合する能力やヌクレアーゼが異なるDNAおよびRNAハイブリッド構造を分解する能力、DNAリガーゼによる補因子の異なる使用、および酵素のDNA結合能力の評価が含まれます。合成ヌクレオチド基質を設計する際に考慮すべき要素について説明し、さまざまな核酸リガーゼ、ポリメラーゼ、およびヌクレアーゼ酵素アッセイに使用できるオリゴヌクレオチドの基本セットを提供します。

All life forms require nucleic acid processing enzymes to carry out fundamental biological processes, including replication, transcription, and DNA repair. Key enzymatic functionalities for these pathways are polymerases, which generate copies of RNA/DNA molecules, ligases which join polynucleotide substrates, nucleases that degrade them, and helicases and topoisomerases, which melt nucleic acid duplexes or change their topology1,2,3,4,5,6,7,8,9,10. In addition, many of these enzymes provide essential molecular tools for applications such as cloning, diagnostics, and high-throughput sequencing11,12,13,14,15.
The functional characteristics, kinetics, and substrate specificities of these enzymes can be determined using labeled DNA/RNA substrates produced by annealing oligonucleotides. Tracking substrates and products has traditionally been achieved by introducing a radioactive label (32P) at either the 5&#39; strand end, which can then be detected by photographic film or with a phosphor imaging system16,17. While radiolabeled substrates offer the benefit of increased experimental sensitivity and do not alter the chemical properties of a nucleotide, the potential health hazards from working with radioisotopes have encouraged the development of non-radioactive nucleic acid labeling to provide a safer alternative for DNA and RNA detection18,19,20. Among these, fluorescence detection, including direct fluorescence detection, time-resolved fluorescence, and energy transfer/fluorescence quenching assays stand out as the most versatile21,22,23,24. The extensive array of fluorophores enables different designs of DNA/RNA substrates featuring unique reporters on each oligonucleotide25. Additionally, the stability of fluorophores, when compared to radioisotopes, allows users to produce and preserve significant quantities of fluorescently labeled DNA substrates19. These fluorophore-labeled substrates can be incubated with the protein of interest, along with different combinations of metal and nucleotide cofactors, to analyze binding and or enzyme activity. Visualization of binding or activity can be observed using various fluorophore dye channels with a gel imaging system. As only the fluorescently labeled oligonucleotides will be visible using this technique, any increase or decrease in the size of the labeled oligonucleotide will be easy to follow. Gels can also be stained afterward, with nucleic acid staining dyes to visualize all DNA bands present on the gel.
Poly-nucleic acid ligases are enzymes that join fragments of DNA/RNA, catalyzing the sealing of breaks by the formation of a phosphodiester bond between 5&#39; phosphorylated DNA termini and the 3&#39; OH of DNA. They can be divided into two groups according to their nucleotide substrate requirement. The highly conserved NAD-dependent ligases are found in all bacteria26 while the structurally diverse ATP-dependent enzymes can be identified through all domains of life8,27. DNA ligases play an important role in Okazaki fragment processing during replication as well as being involved in various DNA repair pathways, such as nucleotide and base excision repair, through the sealing of spontaneous nicks and nicks that are left after repair8,10. Different DNA ligases exhibit varying capacities to join different conformations of DNA breaks, including nicks in a duplex, double-stranded breaks, mismatches, and gaps, as well as RNA and DNA hybrids28,29,30. A diverse range of ligatable substrates can be assembled by annealing oligonucleotides with a 5&#39; phosphate to generate juxtaposed 5&#39; and 3&#39; termini in a nucleic acid duplex31,32,33. The most common method of analysis is resolution by urea PAGE in an end-point assay format; however, recent innovations have included the use of capillary gel electrophoresis, which allows high throughput34, mass-spectrometric profiling35, as well as a homogenous molecular beacon assay, which allows time-resolved monitoring36.
The first step in a ligation reaction is the adenylation of the ligase enzyme by adenosine triphosphate (ATP) or Nicotinamide adenine dinucleotide (NAD), resulting in a covalent enzyme intermediate. The second step in the reaction is adenylation of the nucleic acid substrate on the 5&#39; end of the nick site, which is followed by ligation of the nucleic acid nick strands. Many ligase enzymes that are recombinantly expressed in E. coli are purified in the adenylated form and, therefore, are able to successfully ligate nucleic acids without the addition of a nucleotide cofactor. This makes it difficult to determine what particular type of nucleotide cofactor they require for the ligation of nucleic acids. In addition to describing assays to evaluate DNA ligase activity, a method to reliably determine the cofactor usage by de-adenylating the enzyme using unlabeled substrates is also presented.
Nucleases are a large and diverse group of DNA/RNA modifying enzymes and catalytic RNAs that cleave the phosphodiester bonds between nucleic acids37. Nuclease enzyme functionalities are required in DNA replication, repair, and RNA processing and can be classified by their sugar specificity for DNA, RNA, or both. Endonucleases hydrolyze the phosphodiester bonds within a DNA/RNA strand, while exonucleases hydrolyze DNA/RNA strands one nucleotide at a time from the 3&#39; or 5&#39; end and may do so from either the 3&#39; to 5&#39; or the 5&#39; to 3&#39; end of the DNA38.
While many nuclease proteins are non-specific and may be involved in multiple processes, others are highly specific for a particular sequence or DNA damage6,39,40. Sequence-specific nucleases are used in a wide range of biotechnological applications, such as cloning, mutagenesis, and genome editing. Popular nucleases for these applications are restriction nucleases41, zinc-finger nucleases42, transcriptional activator-like effector nucleases, and most recently, the RNA-guided engineered CRISPR nucleases43. Damage-specific nucleases have recently been identified, such as the EndoMS nuclease, which has specificity for mismatches in the DNA through its mismatch-specific RecB-like nuclease domain5,44. Nuclease activity assays, historically, have been done as discontinuous assays with radiolabeled substrates; however, in addition to their other drawbacks, these do not allow the identification of the site that is cut by a nuclease protein, which is possible when using fluorescently labeled substrates45,46. More recently, continuous nuclease assays have been developed which work by using different DNA dyes that interact with DNA in different states; for example, emitting a higher fluorescent signal when interacting with dsDNA than in its unbound state, or binding specifically to short RNAs47. Other continuous nuclease assays use DNA hairpins with a fluorophore group on the 5&#39; and a quencher on the 3&#39; end so that fluorescence increases as the oligonucleotide is degraded due to a separation of the fluorophore and the quencher48.&#160;While these assays allow one to characterize the kinetics of DNA-degrading proteins, they require previous knowledge of the enzyme&#39;s function and substrate and are also limited to enzymes that change the DNA conformation to cause a difference in dye binding. For this reason, endpoint assays that resolve individual nuclease products are still desirable to provide insight into DNA modifications caused by protein activity.
Here, a detailed procedure is presented for the design of fluorescently labeled DNA/RNA oligonucleotides that can be mixed and matched to generate substrates for testing the activity of novel nuclease, polymerase, and ligase enzymes. The validation of this basic set of oligonucleotide sequences simplifies experimental design and facilitates economical profiling of a wide range of enzymatic functionalities without needing to purchase a large number of bespoke substrates. A detailed procedure is provided for running a standard DNA-processing enzyme assay with these substrates, using the example of DNA ligase activity and modifications for assaying and analyzing nuclease and polymerase enzymes are described. In addition, a modified assay for determining the cofactor specificity of the DNA ligase enzyme with high accuracy is given, and dual-labeled probes are used to evaluate the assembly of multi-component ligations. Finally, modifications to the basic assay format are discussed to allow it to be used to determine protein-DNA interactions with the same substrates by the electrophoretic mobility shift assay (EMSA).

著者スポットライト:Characterizing Novel Enzymes from Extremophiles and Common Pathogens to Understand DNA Repair and Replication

修飾合成オリゴヌクレオチドを用いた核酸代謝酵素のアッセイ

So my research group, we're really interested in enzymes involved in DNA replication and repair. In particular, we're studying enzymes from extremophilic microorganisms and also from pathogens because we want to understand how these enzymes let those organisms survive environmental challenges. We're interested both in the biological function of the enzymes and also in the biotechnological applications.So we work a lot with DNA and RNA ligases, and we've recently established the role of a minimal type of DNA ligase which seems to be trafficked to the outside of bacterial cell. And we've determined that this plays a role in biofilm formation in the pathogen Neisseria gonorrhoeae. We've also, together with our collaborators from ArcticZymes characterized a novel RNA-to-DNA ligase which is able to attach DNA adapters to either end of a piece of RNA.So our collaborators at ArcticZymes, who've also contributed to this protocol, are characterizing different DNA and RNA-metabolizing enzymes which have potential applications in molecular biology. And so they're using this type of protocol as a first step for understanding the spectrum of activities these enzymes have and benchmarking them relative to what's already available on the market. The protocol offers an easier and safer alternative for assaying nucleic acid metabolizing enzymes compared to the use of radiolabeled substrates.The fluorescently labeled DNA or RNA substrates make our approach more efficient, as we can mix and match the oligonucleotides to make a variety of substrates. So at the moment, we're really focused on understanding the biological function of some novel nucleases that we've discovered in an Antarctic environmental genome. These nucleases have homologs in other extremophilic organisms, and so we're trying to understand what role they play in allowing these microbes to survive.We're also really interested in the activity of some of our novel enzymes on non-natural nucleic acid analogs and their potential uses as part of a molecular biology toolkit with non-natural DNA and RNA substrates.

DNAリガーゼによるライゲーション DNAリガーゼの酵素活性は、尿素PAGEゲル上で可視化すると、蛍光標識されたオリゴヌクレオチドのサイズの増加をもたらします。 表2にリストされているDNAライゲーションとRNAライゲーションの両方の基質の場合、これは20 ntから40 ntへのサイズの倍増に相当します(図3A)。最適な酵素活性は、温度、タンパク質...

ここでは、核酸代謝酵素をアッセイするためのプロトコールを、リガーゼ、ヌクレアーゼ、およびポリメラーゼ酵素の例を用いて提示する。このアッセイでは、蛍光標識および非標識オリゴヌクレオチドを組み合わせて、RNAおよび/またはDNAの損傷または経路中間体を模倣した二本鎖を形成することができ、酵素の挙動の特性評価を可能にします。

The availability of a range of modified synthetic oligonucleotides from commercial vendors has allowed the development of sophisticated assays to ...

using-modified-synthetic-oligonucleotides-to-assay-nucleic-acid

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Using Modified Synthetic Oligonucleotides to Assay Nucleic Acid-Metabolizing Enzymes

The availability of a range of modified synthetic oligonucleotides from commercial vendors has allowed the development of sophisticated assays to characterize diverse properties of nucleic acid metabolizing enzymes that can be run in any standard molecular biology lab. The use of fluorescent labels has made these methods accessible to researchers with standard PAGE electrophoresis equipment and a fluorescent-enabled imager, without using radioactive materials or requiring a lab designed for the storage and preparation of radioactive materials, i.e., a Hot Lab. The optional addition of standard modifications such as phosphorylation can simplify assay setup, while the specific incorporation of modified nucleotides that mimic DNA damages or intermediates can be used to probe specific aspects of enzyme behavior. Here, the design and execution of assays to interrogate several aspects of DNA processing by enzymes using commercially available synthetic oligonucleotides are demonstrated. These include the ability of ligases to join or nucleases to degrade different DNA and RNA hybrid structures, differential cofactor usage by the DNA ligase, and evaluation of the DNA-binding capacity of enzymes. Factors to consider when designing synthetic nucleotide substrates are discussed, and a basic set of oligonucleotides that can be used for a range of nucleic acid ligase, polymerase, and nuclease enzyme assays are provided.

Here, a protocol for assaying nucleic acid metabolizing enzymes is presented, using examples of ligase, nuclease, and polymerase enzymes. The assay utilizes fluorescently labeled and unlabeled oligonucleotides that can be combined to form duplexes mimicking RNA and/or DNA damages or pathway intermediates, allowing for the characterization of enzyme behavior.

生化学

Assembling and Annealing Nucleic Acid Duplexes for Characterizing Enzymatic DNA Processing with Modified Oligonucleotides

To begin, centrifuge the lyophilized oligonucleotide-containing tube at full speed in a benchtop centrifuge for two to five minutes. Resuspend the oligonucleotides in TE buffer to prepare a master stock of 100 micromolar and gently vortex the tube. Dilute an aliquot of master stock with TE buffer to prepare a 10-micromolar stock and prepare the reaction master mix.After dispensing the mix to the required tubes, anneal the oligonucleotides in a thermocycler at 95 degrees Celsius for five minutes. Let the tube cool to room temperature for 30 minutes to one hour. Then add nucleotide co-factors and other heat-sensitive buffer components to the master mix.If required, store the mix at 20 degrees Celsius for future use. Combine 22.5 microliters of the substrate master mix with 2.5 microliters of the DNA ligase in a PCR tube. Immediately place the reaction tubes in a PCR machine at 25 degrees Celsius for 30 minutes.To quench the reaction, add five microliters of loading dye and incubate at 95 degrees Celsius for five minutes.

修飾オリゴヌクレオチドを用いた酵素DNAプロセッシングの特性評価のための核酸二本鎖のアセンブルとアニーリング(英語)

Urea-Polyacrylamide Gel Electrophoresis (PAGE) for Probing DNA Enzyme Activities Employing Commercial Oligonucleotides

To begin, prepare a stock of 20%acrylamide, seven-molar urea and 1X TBE solution. For one gel, combine 10 milliliters of acrylamide and urea solution with 100 microliters of 10%ammonium persulfate and three microliters of tetramethylethylenediamine, and cast it in a gel caster. After the gel solidifies, pre-run the gel in 1X TBE buffer for 30 minutes at 10 milliamperes per gel with external heating.Using a Pasteur pipette, flush 1X TBE into the gel wells to remove excess urea. Load 10 microliters of each reaction, and run for one to 1.5 hours at 45 to 55 degrees Celsius. Visualize the gel with the correct settings for the chosen fluorophore.Finally, quantify the band intensity of the product and the substrate using ImageJ, and calculate the percentage of the product using the formula. DNA ligase activity led to an increase in oligonucleotide size from 20 nucleotides to 40 nucleotides observed on a urea PAGE gel. The bacterial DNA ligase ligated both nicked and mismatch DNA substrates and can utilize both magnesium and manganese for ligation activity with a preference for magnesium.