Name: Författare i fokus: Karakterisering av nya enzymer från extremofiler och vanliga patogener för att förstå DNA-reparation och replikation
Uploaded: 2024-07-05T14:30:00
Description: The availability of a range of modified synthetic oligonucleotides from commercial vendors has allowed the development of sophisticated assays to ...

AW stöds av ett Rutherford Discovery Fellowship (20-UOW-004). RS är mottagare av ett New Zealand Post Antarctic Scholarship. SG och UR tackar Kemiska institutet vid Universitetet i Tromsø - Norges arktiska universitet för tekniskt stöd.

1. Design och inköp av oligonukleotider
OBS: Designa enkelsträngade oligonukleotider som ska monteras och glödgas i önskade duplexer. En eller flera av strängarna i en duplex måste ha en fluorescerande del för att spåra oligonukleotidbearbetning med det enzym som är av intresse. En grundläggande uppsättning enkelsträngade sekvenser som kan sättas samman för en rad olika aktiviteter finns i tabell 1.
<ol><li>Införliva de specifika modifieringar...

Analyser för DNA-enzymer med hjälp av syntetiska oligonukleotider

Kritiska steg i protokollet Oligonukleotiddesign och köp: När du köper oligonukleotider för duplexbildning är det viktigt att överväga sekvensdesign. Det rekommenderas att använda ett oligoanalysverktyg för att förutsäga egenskaper hos nukleotidsekvensen, såsom GC-innehåll, smälttemperatur, sekundär struktur och dimeriseringspotential, innan du beställer57.
Montering och glödgning av nukleinsyraduplexer: Vid beredning av RNA/RNA-DNA-...

Alla livsformer kräver nukleinsyrabearbetningsenzymer för att utföra grundläggande biologiska processer, inklusive replikation, transkription och DNA-reparation. Viktiga enzymatiska funktioner för dessa vägar är polymeraser, som genererar kopior av RNA/DNA-molekyler, ligaser som förenar polynukleotidsubstrat, nukleaser som bryter ned dem, och helikaser och topoisomeraser, som smälter nukleinsyraduplexer eller ändrar deras topologi 1,2,3,4,5,6,7,8,9,10 . Dessutom tillhandahåller många av dessa enzymer viktiga molekylära verktyg för tillämpningar som kloning, diagnostik och sekvensering med hög genomströmning 11,12,13,14,15.
De funktionella egenskaperna, kinetiken och substratspecificiteterna för dessa enzymer kan bestämmas med hjälp av märkta DNA/RNA-substrat som produceras genom glödgning av oligonukleotider. Spårning av substrat och produkter har traditionellt åstadkommits genom att införa en radioaktiv märkning (32P) antingen i 5'-strängens ände, som sedan kan detekteras av fotografisk film eller med ett fosforavbildningssystem16,17. Även om radiomärkta substrat erbjuder fördelen av ökad experimentell känslighet och inte förändrar de kemiska egenskaperna hos en nukleotid, har de potentiella hälsoriskerna med att arbeta med radioisotoper uppmuntrat utvecklingen av icke-radioaktiv nukleinsyramärkning för att ge ett säkrare alternativ för DNA- och RNA-detektion 18,19,20 . Bland dessa sticker fluorescensdetektion, inklusive direkt fluorescensdetektion, tidsupplöst fluorescens och energiöverföring/fluorescenssläckningsanalyser ut som de mest mångsidiga 21,22,23,24. Det omfattande utbudet av fluoroforer möjliggör olika utformningar av DNA/RNA-substrat med unika rapportörer på varje oligonukleotid25. Dessutom gör fluoroforernas stabilitet, jämfört med radioisotoper, det möjligt för användare att producera och bevara betydande mängder fluorescerande märkta DNA-substrat19. Dessa fluoroformärkta substrat kan inkuberas med det protein som är av intresse, tillsammans med olika kombinationer av metall- och nukleotidkofaktorer, för att analysera bindning och/eller enzymaktivitet. Visualisering av bindning eller aktivitet kan observeras med hjälp av olika fluoroforfärgkanaler med ett gelavbildningssystem. Eftersom endast de fluorescerande märkta oligonukleotiderna kommer att vara synliga med denna teknik, kommer varje ökning eller minskning av storleken på den märkta oligonukleotiden att vara lätt att följa. Geler kan också färgas efteråt, med nukleinsyrafärgningsfärgämnen för att visualisera alla DNA-band som finns på gelen.
Polynukleinsyraligaser är enzymer som förenar fragment av DNA/RNA, katalyserar tätningen av brott genom bildandet av en fosfodiesterbindning mellan 5'fosforylerade DNA-ändpunkter och 3'OH av DNA. De kan delas in i två grupper beroende på deras behov av nukleotidsubstrat. De mycket konserverade NAD-beroende ligaserna finns i alla bakterier26 medan de strukturellt olika ATP-beroende enzymerna kan identifieras genom alla livsdomäner 8,27. DNA-ligaser spelar en viktig roll i bearbetningen av Okazaki-fragment under replikationen samt är involverade i olika DNA-reparationsvägar, såsom nukleotid och basexcisionsreparation, genom tätning av spontana hack och hack som finns kvar efter reparation 8,10. Olika DNA-ligaser uppvisar varierande kapacitet att förena olika konformationer av DNA-brott, inklusive hack i en duplex, dubbelsträngade brott, missmatchningar och luckor, samt RNA- och DNA-hybrider 28,29,30. Ett brett utbud av ligaerbara substrat kan monteras genom att glödga oligonukleotider med ett 5'-fosfat för att generera sammansatta 5'- och 3'-termini i en nukleinsyraduplex 31,32,33. Den vanligaste analysmetoden är upplösning med urea PAGE i ett slutpunktsanalysformat. De senaste innovationerna har dock inkluderat användningen av kapillär gelelektrofores, som möjliggör hög genomströmning34, masspektrometrisk profilering35, samt en homogen molekylär beacon-analys, som möjliggör tidsupplöst övervakning36.
Det första steget i en ligeringsreaktion är adenyleringen av ligasenzymet med adenosintrifosfat (ATP) eller nikotinamid adenindinukleotid (NAD), vilket resulterar i en kovalent enzymintermediär. Det andra steget i reaktionen är adenylering av nukleinsyrasubstratet på 5'-änden av nickplatsen, vilket följs av ligering av nukleinsyra-nicksträngarna. Många ligasenzymer som rekombinant uttrycks i E. coli renas i adenylerad form och kan därför framgångsrikt ligera nukleinsyror utan tillsats av en nukleotidkofaktor. Detta gör det svårt att avgöra vilken speciell typ av nukleotidkofaktor de behöver för ligering av nukleinsyror. Förutom att beskriva analyser för att utvärdera DNA-ligasaktivitet, presenteras också en metod för att på ett tillförlitligt sätt bestämma kofaktoranvändningen genom att de-adenylera enzymet med hjälp av omärkta substrat.
Nukleaser är en stor och mångsidig grupp av DNA/RNA-modifierande enzymer och katalytiska RNA som klyver fosfodiesterbindningarna mellan nukleinsyror37. Nukleasenzymfunktioner krävs vid DNA-replikation, reparation och RNA-bearbetning och kan klassificeras efter deras sockerspecificitet för DNA, RNA eller båda. Endonukleaser hydrolyserar fosfodiesterbindningarna i en DNA/RNA-sträng, medan exonukleaser hydrolyserar DNA/RNA-strängar en nukleotid i taget från 3'- eller 5'-änden och kan göra det från antingen 3'-5'- eller 5'-3'-änden av DNA38.
Medan många nukleasproteiner är ospecifika och kan vara involverade i flera processer, är andra mycket specifika för en viss sekvens eller DNA-skada 6,39,40. Sekvensspecifika nukleaser används i ett brett spektrum av biotekniska tillämpningar, såsom kloning, mutagenes och genomredigering. Populära nukleaser för dessa tillämpningar är restriktionsnukleaser41, zinkfingernukleaser42, transkriptionsaktivatorliknande effektornukleaser och nu senast de RNA-styrda konstruerade CRISPR-nukleaserna43. Skadespecifika nukleaser har nyligen identifierats, såsom EndoMS-nukleas, som har specificitet för missmatchningar i DNA genom sin mismatch-specifika RecB-liknande nukleasdomän 5,44. Nukleasaktivitetsanalyser har historiskt sett gjorts som diskontinuerliga analyser med radioaktivt märkta substrat; Men förutom deras andra nackdelar tillåter dessa inte identifiering av det ställe som skärs av ett nukleasprotein, vilket är möjligt vid användning av fluorescerande märkta substrat45,46. På senare tid har kontinuerliga nukleasanalyser utvecklats som fungerar genom att använda olika DNA-färgämnen som interagerar med DNA i olika tillstånd; till exempel att avge en högre fluorescerande signal när den interagerar med dsDNA än i dess obundna tillstånd, eller att binda specifikt till korta RNA47. Andra kontinuerliga nukleasanalyser använder DNA-hårnålar med en fluoroforgrupp på 5' och en quencher på 3'-änden så att fluorescensen ökar när oligonukleotiden bryts ned på grund av en separation av fluoroforen och quenchern48. Även om dessa analyser gör det möjligt att karakterisera kinetiken hos DNA-nedbrytande proteiner, kräver de tidigare kunskap om enzymets funktion och substrat och är också begränsade till enzymer som ändrar DNA-konformationen för att orsaka en skillnad i färgbindning. Av denna anledning är endpoint-analyser som löser upp enskilda nukleasprodukter fortfarande önskvärda för att ge insikt i DNA-modifieringar orsakade av proteinaktivitet.
Här presenteras en detaljerad procedur för design av fluorescerande märkta DNA/RNA-oligonukleotider som kan blandas och matchas för att generera substrat för testning av aktiviteten hos nya nukleas-, polymeras- och ligasenzymer. Valideringen av denna grundläggande uppsättning oligonukleotidsekvenser förenklar experimentell design och underlättar ekonomisk profilering av ett brett spektrum av enzymatiska funktioner utan att behöva köpa ett stort antal skräddarsydda substrat. En detaljerad procedur tillhandahålls för att köra en standardanalys av DNA-bearbetande enzymer med dessa substrat, med hjälp av exemplet med DNA-ligasaktivitet och modifieringar för analys och analys av nukleas- och polymerasenzymer beskrivs. Dessutom ges en modifierad analys för att bestämma kofaktorspecificiteten för DNA-ligasenzymet med hög noggrannhet, och dubbelmärkta sonder används för att utvärdera sammansättningen av flerkomponentligeringar. Slutligen diskuteras modifieringar av det grundläggande analysformatet för att göra det möjligt att använda det för att bestämma protein-DNA-interaktioner med samma substrat genom elektroforetisk rörlighetsskiftanalys (EMSA).

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>30% Acrylamide/Bis Solution (29:1)</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>1610156</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adenosine triphosphate (ATP)</td>
			<td>Many suppliers</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium persulfate (APS)</td>
			<td>Many suppliers</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Benchtop centrifuge</td>
			<td>Many suppliers</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Borate</td>
			<td>Many suppliers</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bromophenol blue</td>
			<td>Many suppliers</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dithiothreitol (DTT)</td>
			<td>Many suppliers</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electrophoresis system with circulating water bath</td>
			<td>Many suppliers</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)</td>
			<td>Many suppliers</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluoresnence imager, e.g. iBright FL1000</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A32752</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formamide</td>
			<td>Many suppliers</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gel casting system</td>
			<td>Many suppliers</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heating block</td>
			<td>Many suppliers</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium Chloride</td>
			<td>Many suppliers</td>
			<td></td>
			<td>Other metal ions may be preferred depending on the protein studied</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge tubes (1.5 mL)</td>
			<td>Many suppliers</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micropipettes and tips</td>
			<td>Many suppliers</td>
			<td></td>
			<td>1 mL, 0.2 mL, 0.02 mL, 0.002 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nicotinamide adenine dinucleotide (NAD+)</td>
			<td>Many suppliers</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oligonucleotides</td>
			<td>Integrated DNA Technologies</td>
			<td>NA</td>
			<td>Thermo Fisher, Sigma-Aldrich,&#160; Genscript and others also supply these</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pasture pipette</td>
			<td>Many suppliers</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCR thermocycler</td>
			<td>Many suppliers</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCR tubes</td>
			<td>Many suppliers</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNAse away</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>7002PK</td>
			<td>Only needed when working with RNA oligos</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNase AWAY</td>
			<td>Merck</td>
			<td>83931-250ML</td>
			<td>Surfactant for removal of RNAse contamination on surfaces</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNAse-free water</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>B1500L</td>
			<td>Only needed when working with RNA oligos</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride</td>
			<td>Many suppliers</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SUPERase IN RNase inhibitor</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>AM2694</td>
			<td>Broad spectrum RNAse inhibitir (protein-based)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SYBR Gold</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>S11494</td>
			<td>This may be used to post-stain gels and visualise unlabelled oligonucleotides</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tetramethylethylenediamine (TMED)</td>
			<td>Many suppliers</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris, or tris(hydroxymethyl)aminomethane</td>
			<td>Many suppliers</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultrapure water (Milli-Q)</td>
			<td>Merck</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>urea</td>
			<td>Many suppliers</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortex</td>
			<td>Many suppliers</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

using modified synthetic oligonucleotides to assay nucleic acid-metabolizing enzymes

Tillgången till en rad modifierade syntetiska oligonukleotider från kommersiella leverantörer har möjliggjort utvecklingen av sofistikerade analyser för att karakterisera olika egenskaper hos nukleinsyrametaboliserande enzymer som kan köras i alla vanliga molekylärbiologiska laboratorier. Användningen av fluorescerande etiketter har gjort dessa metoder tillgängliga för forskare med standard PAGE-elektroforesutrustning och en fluorescerande bildapparat, utan att använda radioaktiva material eller kräva ett laboratorium utformat för lagring och beredning av radioaktiva material, dvs. ett Hot Lab. Det valfria tillägget av standardmodifieringar såsom fosforylering kan förenkla analysinställningen, medan den specifika inkorporeringen av modifierade nukleotider som efterliknar DNA-skador eller intermediärer kan användas för att undersöka specifika aspekter av enzymbeteende. Här demonstreras design och utförande av analyser för att undersöka flera aspekter av DNA-bearbetning av enzymer med hjälp av kommersiellt tillgängliga syntetiska oligonukleotider. Dessa inkluderar förmågan hos ligaser att förenas eller nukleaser att bryta ner olika DNA- och RNA-hybridstrukturer, differentiell kofaktoranvändning av DNA-ligaset och utvärdering av enzymers DNA-bindande kapacitet. Faktorer att ta hänsyn till vid design av syntetiska nukleotidsubstrat diskuteras, och en grundläggande uppsättning oligonukleotider som kan användas för en rad nukleinsyraligas-, polymeras- och nukleasenzymanalyser tillhandahålls.

All life forms require nucleic acid processing enzymes to carry out fundamental biological processes, including replication, transcription, and DNA repair. Key enzymatic functionalities for these pathways are polymerases, which generate copies of RNA/DNA molecules, ligases which join polynucleotide substrates, nucleases that degrade them, and helicases and topoisomerases, which melt nucleic acid duplexes or change their topology1,2,3,4,5,6,7,8,9,10. In addition, many of these enzymes provide essential molecular tools for applications such as cloning, diagnostics, and high-throughput sequencing11,12,13,14,15.
The functional characteristics, kinetics, and substrate specificities of these enzymes can be determined using labeled DNA/RNA substrates produced by annealing oligonucleotides. Tracking substrates and products has traditionally been achieved by introducing a radioactive label (32P) at either the 5&#39; strand end, which can then be detected by photographic film or with a phosphor imaging system16,17. While radiolabeled substrates offer the benefit of increased experimental sensitivity and do not alter the chemical properties of a nucleotide, the potential health hazards from working with radioisotopes have encouraged the development of non-radioactive nucleic acid labeling to provide a safer alternative for DNA and RNA detection18,19,20. Among these, fluorescence detection, including direct fluorescence detection, time-resolved fluorescence, and energy transfer/fluorescence quenching assays stand out as the most versatile21,22,23,24. The extensive array of fluorophores enables different designs of DNA/RNA substrates featuring unique reporters on each oligonucleotide25. Additionally, the stability of fluorophores, when compared to radioisotopes, allows users to produce and preserve significant quantities of fluorescently labeled DNA substrates19. These fluorophore-labeled substrates can be incubated with the protein of interest, along with different combinations of metal and nucleotide cofactors, to analyze binding and or enzyme activity. Visualization of binding or activity can be observed using various fluorophore dye channels with a gel imaging system. As only the fluorescently labeled oligonucleotides will be visible using this technique, any increase or decrease in the size of the labeled oligonucleotide will be easy to follow. Gels can also be stained afterward, with nucleic acid staining dyes to visualize all DNA bands present on the gel.
Poly-nucleic acid ligases are enzymes that join fragments of DNA/RNA, catalyzing the sealing of breaks by the formation of a phosphodiester bond between 5&#39; phosphorylated DNA termini and the 3&#39; OH of DNA. They can be divided into two groups according to their nucleotide substrate requirement. The highly conserved NAD-dependent ligases are found in all bacteria26 while the structurally diverse ATP-dependent enzymes can be identified through all domains of life8,27. DNA ligases play an important role in Okazaki fragment processing during replication as well as being involved in various DNA repair pathways, such as nucleotide and base excision repair, through the sealing of spontaneous nicks and nicks that are left after repair8,10. Different DNA ligases exhibit varying capacities to join different conformations of DNA breaks, including nicks in a duplex, double-stranded breaks, mismatches, and gaps, as well as RNA and DNA hybrids28,29,30. A diverse range of ligatable substrates can be assembled by annealing oligonucleotides with a 5&#39; phosphate to generate juxtaposed 5&#39; and 3&#39; termini in a nucleic acid duplex31,32,33. The most common method of analysis is resolution by urea PAGE in an end-point assay format; however, recent innovations have included the use of capillary gel electrophoresis, which allows high throughput34, mass-spectrometric profiling35, as well as a homogenous molecular beacon assay, which allows time-resolved monitoring36.
The first step in a ligation reaction is the adenylation of the ligase enzyme by adenosine triphosphate (ATP) or Nicotinamide adenine dinucleotide (NAD), resulting in a covalent enzyme intermediate. The second step in the reaction is adenylation of the nucleic acid substrate on the 5&#39; end of the nick site, which is followed by ligation of the nucleic acid nick strands. Many ligase enzymes that are recombinantly expressed in E. coli are purified in the adenylated form and, therefore, are able to successfully ligate nucleic acids without the addition of a nucleotide cofactor. This makes it difficult to determine what particular type of nucleotide cofactor they require for the ligation of nucleic acids. In addition to describing assays to evaluate DNA ligase activity, a method to reliably determine the cofactor usage by de-adenylating the enzyme using unlabeled substrates is also presented.
Nucleases are a large and diverse group of DNA/RNA modifying enzymes and catalytic RNAs that cleave the phosphodiester bonds between nucleic acids37. Nuclease enzyme functionalities are required in DNA replication, repair, and RNA processing and can be classified by their sugar specificity for DNA, RNA, or both. Endonucleases hydrolyze the phosphodiester bonds within a DNA/RNA strand, while exonucleases hydrolyze DNA/RNA strands one nucleotide at a time from the 3&#39; or 5&#39; end and may do so from either the 3&#39; to 5&#39; or the 5&#39; to 3&#39; end of the DNA38.
While many nuclease proteins are non-specific and may be involved in multiple processes, others are highly specific for a particular sequence or DNA damage6,39,40. Sequence-specific nucleases are used in a wide range of biotechnological applications, such as cloning, mutagenesis, and genome editing. Popular nucleases for these applications are restriction nucleases41, zinc-finger nucleases42, transcriptional activator-like effector nucleases, and most recently, the RNA-guided engineered CRISPR nucleases43. Damage-specific nucleases have recently been identified, such as the EndoMS nuclease, which has specificity for mismatches in the DNA through its mismatch-specific RecB-like nuclease domain5,44. Nuclease activity assays, historically, have been done as discontinuous assays with radiolabeled substrates; however, in addition to their other drawbacks, these do not allow the identification of the site that is cut by a nuclease protein, which is possible when using fluorescently labeled substrates45,46. More recently, continuous nuclease assays have been developed which work by using different DNA dyes that interact with DNA in different states; for example, emitting a higher fluorescent signal when interacting with dsDNA than in its unbound state, or binding specifically to short RNAs47. Other continuous nuclease assays use DNA hairpins with a fluorophore group on the 5&#39; and a quencher on the 3&#39; end so that fluorescence increases as the oligonucleotide is degraded due to a separation of the fluorophore and the quencher48.&#160;While these assays allow one to characterize the kinetics of DNA-degrading proteins, they require previous knowledge of the enzyme&#39;s function and substrate and are also limited to enzymes that change the DNA conformation to cause a difference in dye binding. For this reason, endpoint assays that resolve individual nuclease products are still desirable to provide insight into DNA modifications caused by protein activity.
Here, a detailed procedure is presented for the design of fluorescently labeled DNA/RNA oligonucleotides that can be mixed and matched to generate substrates for testing the activity of novel nuclease, polymerase, and ligase enzymes. The validation of this basic set of oligonucleotide sequences simplifies experimental design and facilitates economical profiling of a wide range of enzymatic functionalities without needing to purchase a large number of bespoke substrates. A detailed procedure is provided for running a standard DNA-processing enzyme assay with these substrates, using the example of DNA ligase activity and modifications for assaying and analyzing nuclease and polymerase enzymes are described. In addition, a modified assay for determining the cofactor specificity of the DNA ligase enzyme with high accuracy is given, and dual-labeled probes are used to evaluate the assembly of multi-component ligations. Finally, modifications to the basic assay format are discussed to allow it to be used to determine protein-DNA interactions with the same substrates by the electrophoretic mobility shift assay (EMSA).

Författare i fokus: Karakterisering av nya enzymer från extremofiler och vanliga patogener för att förstå DNA-reparation och replikation

Användning av modifierade syntetiska oligonukleotider för att analysera nukleinsyrametaboliserande enzymer

So my research group, we're really interested in enzymes involved in DNA replication and repair. In particular, we're studying enzymes from extremophilic microorganisms and also from pathogens because we want to understand how these enzymes let those organisms survive environmental challenges. We're interested both in the biological function of the enzymes and also in the biotechnological applications.So we work a lot with DNA and RNA ligases, and we've recently established the role of a minimal type of DNA ligase which seems to be trafficked to the outside of bacterial cell. And we've determined that this plays a role in biofilm formation in the pathogen Neisseria gonorrhoeae. We've also, together with our collaborators from ArcticZymes characterized a novel RNA-to-DNA ligase which is able to attach DNA adapters to either end of a piece of RNA.So our collaborators at ArcticZymes, who've also contributed to this protocol, are characterizing different DNA and RNA-metabolizing enzymes which have potential applications in molecular biology. And so they're using this type of protocol as a first step for understanding the spectrum of activities these enzymes have and benchmarking them relative to what's already available on the market. The protocol offers an easier and safer alternative for assaying nucleic acid metabolizing enzymes compared to the use of radiolabeled substrates.The fluorescently labeled DNA or RNA substrates make our approach more efficient, as we can mix and match the oligonucleotides to make a variety of substrates. So at the moment, we're really focused on understanding the biological function of some novel nucleases that we've discovered in an Antarctic environmental genome. These nucleases have homologs in other extremophilic organisms, and so we're trying to understand what role they play in allowing these microbes to survive.We're also really interested in the activity of some of our novel enzymes on non-natural nucleic acid analogs and their potential uses as part of a molecular biology toolkit with non-natural DNA and RNA substrates.

Ligering av DNA-ligas DNA-ligasenzymatisk aktivitet kommer att resultera i en ökning av storleken på den fluorescerande märkta oligonukleotiden när den visualiseras på en urea PAGE-gel. När det gäller de substrat för både DNA- och RNA-ligering som listas i tabell 2 motsvarar detta en fördubbling i storlek från 20 nt till 40 nt (Figur 3A). Optimal enzymaktivitet kan bestämmas genom förändrade förhållanden såsom temperatur, proteinkoncentra...

Här presenteras ett protokoll för analys av nukleinsyrametaboliserande enzymer, med hjälp av exempel på ligas-, nukleas- och polymerasenzymer. Analysen använder fluorescerande märkta och omärkta oligonukleotider som kan kombineras för att bilda duplexer som efterliknar RNA- och/eller DNA-skador eller vägintermediärer, vilket möjliggör karakterisering av enzymbeteende.

The availability of a range of modified synthetic oligonucleotides from commercial vendors has allowed the development of sophisticated assays to ...

using-modified-synthetic-oligonucleotides-to-assay-nucleic-acid

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Using Modified Synthetic Oligonucleotides to Assay Nucleic Acid-Metabolizing Enzymes

The availability of a range of modified synthetic oligonucleotides from commercial vendors has allowed the development of sophisticated assays to characterize diverse properties of nucleic acid metabolizing enzymes that can be run in any standard molecular biology lab. The use of fluorescent labels has made these methods accessible to researchers with standard PAGE electrophoresis equipment and a fluorescent-enabled imager, without using radioactive materials or requiring a lab designed for the storage and preparation of radioactive materials, i.e., a Hot Lab. The optional addition of standard modifications such as phosphorylation can simplify assay setup, while the specific incorporation of modified nucleotides that mimic DNA damages or intermediates can be used to probe specific aspects of enzyme behavior. Here, the design and execution of assays to interrogate several aspects of DNA processing by enzymes using commercially available synthetic oligonucleotides are demonstrated. These include the ability of ligases to join or nucleases to degrade different DNA and RNA hybrid structures, differential cofactor usage by the DNA ligase, and evaluation of the DNA-binding capacity of enzymes. Factors to consider when designing synthetic nucleotide substrates are discussed, and a basic set of oligonucleotides that can be used for a range of nucleic acid ligase, polymerase, and nuclease enzyme assays are provided.

Here, a protocol for assaying nucleic acid metabolizing enzymes is presented, using examples of ligase, nuclease, and polymerase enzymes. The assay utilizes fluorescently labeled and unlabeled oligonucleotides that can be combined to form duplexes mimicking RNA and/or DNA damages or pathway intermediates, allowing for the characterization of enzyme behavior.

Assembling and Annealing Nucleic Acid Duplexes for Characterizing Enzymatic DNA Processing with Modified Oligonucleotides

To begin, centrifuge the lyophilized oligonucleotide-containing tube at full speed in a benchtop centrifuge for two to five minutes. Resuspend the oligonucleotides in TE buffer to prepare a master stock of 100 micromolar and gently vortex the tube. Dilute an aliquot of master stock with TE buffer to prepare a 10-micromolar stock and prepare the reaction master mix.After dispensing the mix to the required tubes, anneal the oligonucleotides in a thermocycler at 95 degrees Celsius for five minutes. Let the tube cool to room temperature for 30 minutes to one hour. Then add nucleotide co-factors and other heat-sensitive buffer components to the master mix.If required, store the mix at 20 degrees Celsius for future use. Combine 22.5 microliters of the substrate master mix with 2.5 microliters of the DNA ligase in a PCR tube. Immediately place the reaction tubes in a PCR machine at 25 degrees Celsius for 30 minutes.To quench the reaction, add five microliters of loading dye and incubate at 95 degrees Celsius for five minutes.

Montering och glödgning av nukleinsyraduplexer för karakterisering av enzymatisk DNA-bearbetning med modifierade oligonukleotider

Urea-Polyacrylamide Gel Electrophoresis (PAGE) for Probing DNA Enzyme Activities Employing Commercial Oligonucleotides

To begin, prepare a stock of 20%acrylamide, seven-molar urea and 1X TBE solution. For one gel, combine 10 milliliters of acrylamide and urea solution with 100 microliters of 10%ammonium persulfate and three microliters of tetramethylethylenediamine, and cast it in a gel caster. After the gel solidifies, pre-run the gel in 1X TBE buffer for 30 minutes at 10 milliamperes per gel with external heating.Using a Pasteur pipette, flush 1X TBE into the gel wells to remove excess urea. Load 10 microliters of each reaction, and run for one to 1.5 hours at 45 to 55 degrees Celsius. Visualize the gel with the correct settings for the chosen fluorophore.Finally, quantify the band intensity of the product and the substrate using ImageJ, and calculate the percentage of the product using the formula. DNA ligase activity led to an increase in oligonucleotide size from 20 nucleotides to 40 nucleotides observed on a urea PAGE gel. The bacterial DNA ligase ligated both nicked and mismatch DNA substrates and can utilize both magnesium and manganese for ligation activity with a preference for magnesium.