Verkrijg om te beginnen de menselijke embryonale stamcellen in het stamcelmedium met een celdichtheid van 80 tot 90% Spoel na verwijdering van het verbruikte medium de cellen in elk putje met één milliliter 1X DPBS. Incubeer de stamcelkolonies in elk putje met één milliliter 0,5 millimolaire EDTA gedurende ongeveer vijf minuten bij 37 graden Celsius. Controleer de morfologie van de kolonie om te bevestigen dat de randen licht gekruld zijn met losse openingen.
Aspireer de EDTA op en incubeer indien nodig cellen bij 37 graden Celsius nog één tot twee minuten, maar niet langer dan acht minuten. Spoel de cellen in elk putje voorzichtig af met zes milliliter medium A met zes microliter 10 millimolaire ROCK-remmer Y-27632-oplossing. Tik zachtjes op de bodem van de schaal om de cellen te spoelen.
Observeer na 24 uur de cellen onder de microscoop om de vorming van het embryolichaam te bevestigen. Verzamel met een pipet van 10 milliliter de embryolichamen in een centrifugaalbuis van 15 milliliter en wacht tot de embryolichamen vijf minuten op de bodem zijn neergedaald. Zuig vervolgens het supernatans voorzichtig op en resuspendeer de embryolichamen in zes milliliter vers medium A. Breng ze over in een nieuw laag hechtingsputje van een plaat met zes putjes en kweek in een incubator van 37 graden Celsius.
Smeer op dag vier een schaal van 10 centimeter in met drie milliliter 0,1% visgelatine-oplossing en broed minimaal een uur in een incubator van 5%koolstofdioxide, 37 graden Celsius. Verwijder vervolgens de gelatineoplossing en spoel de schaal een keer af met vijf tot zes milliliter 1X DPBS. Verzamel de embryolichamen voorzichtig in een centrifugaalbuis van 15 milliliter en wacht tot de embryolichamen binnen vijf minuten naar de bodem zijn gezakt.
Resuspendeer de embryolichamen voorzichtig met 15 milliliter medium B en breng ze over naar de gecoate schaal van 10 centimeter. Kweek in een incubator van 37 graden Celsius, 5% kooldioxide gedurende een week na 49 dagen. Centrifugeer de cellen bij 200 x g gedurende vijf minuten bij kamertemperatuur.
Zuig het supernatans voorzichtig op en resuspendeer de cellen met twee milliliter vers medium C.Breng over naar een nieuw laag hechtingsputje van een plaat met zes putjes. Incubeer de plaat in een incubator van 5%koolstofdioxide, 37 graden Celsius. Vervang op dag 56 het verbruikte medium door twee milliliter medium C per putje.
Onderzoek de plaat onder een microscoop om te bepalen of de vertakte microglia zich aan de bodem van de lage hechtingsput hechten. Om microglia te oogsten voor co-culturing, vervang je voorzichtig het medium C in elk putje door één milliliter Accutase en incubeer je het gedurende drie minuten bij 37 graden Celsius. Verzamel met een pipet van vijf milliliter de microgliacellen in een buisje van 15 milliliter en centrifugeer de cellen gedurende vijf minuten bij kamertemperatuur op 200 x g.
Nadat u de supernatant hebt weggegooid, suspendeert u de microglia met één milliliter medium E.