Name: 作者聚焦：在单分子水平上研究真核复制体组分的运动动力学
Uploaded: 2024-07-26T14:55:00
Duration: 1 min 44 s
Description: Eukaryotes have one replicative helicase known as CMG, which centrally organizes and drives the replisome, and leads the way at the front of replication ...

作者感谢 Anne Early、Lucy Drury 和 Max Douglas 为未标记蛋白质的过表达提供酵母菌株，以及 ND 实验室成员 Anuj Kumar、Katinka Ligthart 和 Julien Gros 帮助纯化负载因子和 DDK。作者还感谢 Kaley McCluskey、Dorian Mikolajczak、Joseph Yeeles、Jacob Lewis、Alessandro Costa、Hasan Yardimci 和 Taekjip Ha 进行有益的科学讨论。D.R.M. 感谢勃林格殷格翰基金会博士奖学金的资助。 N.D. 感谢荷兰科学研究组织 （NWO） 通过最高赠款 714.017.002 和欧洲研究理事会通过高级赠款（REPLICHROMA;赠款号 789267）提供的资助。

1. 合成双功能化线性 DNA 底物并与磁珠结合
<ol><li>DNA 底物与脱硫生物素和地高辛部分的双重功能化<ol><li>在 37 °C 下，用 200 单位限制性内切酶 AflII 线性化 20 μg 23.6 kb 质粒 pGL50-ARS1（包含天然 ARS1 复制起点，内部克隆，可根据要求提供）在 37 °C 下，终体积为 200 μL 1x 缓冲液（50 mM 乙酸钾、20 mM Tris-乙酸钠、10 mM 乙酸镁、 100 μg/ml BSA，pH 7.9）。 注意：如果更方便，此步骤可以减少到 4 小时而不降低产量。</li>
		<li>通过在 65 °C 下孵育反应 20 分钟来灭活 AflII。通过在 200 μL 线性化反应中补充 60 单位的 Klenow 片段（3' 至 5' 外切）聚合酶、17 μL 10x 缓冲液（500 mM NaCl、100 mM Tris-HCl、100 mM MgCl2、10 mM DTT，pH 7.9）、33 μM D-脱硫生物素-7-dATP、33 μM 地高辛-11-dUTP、33 μM dCTP、33 μM dGTP、 和超纯水至终体积为 370 μM。将反应物在 37 °C 下孵育 30 分钟。 注：在此步骤中，Klenow 片段通过在两端掺入两个 D-脱硫生物素-7-dATP 和两个地高辛-11-dUTP 核苷酸来减弱线性化 DNA 两端的突出端。</li>
		<li>用 10 mM EDTA 补充反应物，并在 75 °C 下孵育反应物 20 分钟来灭活 Klenow 片段。用超纯水使反应体积达到 400 μL。</li>
		<li>取四个 S-400 离心柱，涡旋至少 30 秒以重悬树脂，然后以 735 x g 离心 1 分钟以去除储存缓冲液。将色谱柱转移至干净的 1.5 mL 试管中。</li>
		<li>立即向每根柱中加入 100 μL DNA 溶液，并以 735 x g 的离心力离心 2 分钟。DNA 现在在流出液中，色谱柱可能会被丢弃。</li>
		<li>汇集四根色谱柱的流出液，用移液管测量体积，用分光光度计测量 DNA 浓度。这将用于计算与珠子结合的 DNA 量。</li>
	</ol></li>
	<li>将双功能化线性 DNA 与链霉亲和素包被的磁珠结合<ol><li>涡旋 M-280 链霉亲和素包被的磁珠 30 秒以使其重悬。</li>
		<li>将 4 mg 重悬的 M-280 链霉亲和素包被的磁珠转移到干净的 1.5 mL 试管中。将试管放在磁架上，等待 1 分钟以收集珠子，然后取出储存缓冲液。</li>
		<li>向珠子中加入 1 mL 的 1x 缓冲液 A（5 mM Tris-HCl pH 7.5、0.5 mM EDTA 和 1 M NaCl），涡旋重悬 5 秒。将珠子在室温下孵育 5 分钟。 注：所有缓冲液均应无菌过滤。预先制备大量 2x 缓冲液 A、1x 缓冲液 B（见下文）和 1x 缓冲液 C（见下文）以节省时间（推荐）。这些缓冲液是磁珠制造商推荐的缓冲液，可以储存在 - 20°C 下。</li>
		<li>将试管放入磁性支架中，等待 1 分钟以收集珠子，然后去除缓冲液 A。</li>
		<li>通过移液将磁珠重悬于 400 μL 的 2x 缓冲液 A 中，然后加入 400 μL 功能化 DNA 溶液（请注意，这会将 2x 缓冲液 A 稀释至 1x 的最终浓度，这是 DNA 与磁珠结合的最佳选择）。通过移液轻轻混合。</li>
		<li>将磁珠/DNA 混合物在 4 °C 下孵育过夜，并端到端旋转，以使功能化的 DNA 与磁珠结合。</li>
		<li>使用磁力架去除上清液（在用移液管测量其体积和用分光光度计测量未结合 DNA 的浓度之前不要丢弃），并用 500 μL 缓冲液 B（10 mM HEPES-KOH pH 7.6、1 mM EDTA 和 1 M KOAc）洗涤珠子 2 次，以去除非特异性结合的 DNA。用 500 μL 缓冲液 C（10 mM HEPES-KOH pH 7.6 和 1 mM EDTA）洗涤珠子 2 次，这是制造商推荐的储存缓冲液。<ol><li>通过将添加到磁珠中的 DNA 总量与上清液中剩余的 DNA 量进行比较，计算与磁珠结合的 DNA 总量。产量应在每 mg 磁珠 2.3-2.9 mg DNA （~150-190 fmol） 的范围内。如果获得的产量较低，请在使用前检查 S400 色谱柱是否未干燥。通过凝胶电泳持续监测 DNA 完整性，以确保初始质粒 DNA 底物不被降解。</li>
		</ol></li>
		<li>将珠子重悬于 300 μL 缓冲液 C 中，并储存在 4 °C 下。 为防止切口，将 1 mg 磁珠制成 4 次一次性等分试样，并且 DNA 的储存时间不要超过 2 周。</li>
	</ol></li>
</ol>2. 混合集成和单分子分析，使用相关双光束光镊和共聚焦显微镜对完全重组的 CMG 的运动进行成像和量化
<ol><li>荧光标记的 CMG 在磁珠结合 DNA （图 1C). 注：CMG 组装和活化反应分两个阶段进行：Mcm2-7 上样和磷酸化，以及 CMG 组装和活化。除非另有说明，否则所有缓冲液更换步骤均在磁架的帮助下进行，让磁珠被磁力架收集 1 分钟，然后去除上清液。所有孵育均在带盖的温控加热块中进行，以防止荧光蛋白发生光漂白。如果没有盖子，则应用锡箔纸覆盖管子。该方案中采用的所有蛋白质的纯化和荧光标记已如前所述进行10,11,28.<ol style="margin-left: 40px;"><li>Mcm2-7 负载和磷酸化<ol><li>取 1 mg DNA 结合的链霉亲和素包被的磁珠，并去除储存缓冲液（缓冲液 C）。</li>
			<li>用 200 μL 上样缓冲液（25 mM HEPES-KOH pH 7.6、100 mM K 谷氨酸、10 mM MgOAc、0.02% NP40 替代品、10% 甘油、2 mM DTT、100 μg/mL BSA 和 5 mM ATP）洗涤珠子。</li>
			<li>去除上样缓冲液，并将磁珠重悬于 75 μL 上样缓冲液中。通过移液轻轻混合。</li>
			<li>向微珠结合的 DNA 中加入终浓度为 37.5 nM 的 ORC，并在 30 °C 下以 800 rpm 的转速搅拌孵育反应 5 分钟。</li>
			<li>加入终浓度为 50 nM 的 Cdc6，并在 30 °C 下以 800 rpm 的搅拌孵育反应 5 分钟。</li>
			<li>加入终浓度为 100 nM 的 Mcm2-7/Cdt1（或荧光标记的 Mcm2-7JF646-Halo-Mcm3/Cdt1），并在 30 °C 下以 800 rpm 的搅拌孵育反应 20 分钟。</li>
			<li>加入终浓度为 100 nM 的 DDK，并在 30 °C 下以 800 rpm 的搅拌孵育反应 30 分钟。</li>
			<li>去除上清液，用 200 μL 高盐洗涤 （HSW） 缓冲液（25 mM HEPES-KOH pH 7.6、300 mM KCl、10 mM MgOAc、0.02% NP40 替代品、10% 甘油、1 mM DTT 和 400 μg/mL BSA）洗涤珠子结合的 DNA（现在含有磷酸化的 Mcm2-7 六聚体）。通过移液混匀，确保微珠完全重悬于缓冲液中，并且看不到团块。</li>
			<li>去除 HSW 缓冲液，并用 200 μL CMG 缓冲液（25 mM HEPES-KOH pH 7.6、250 mM K 谷氨酸、10 mM MgOAc、0.02% NP40 替代品、10% 甘油、1 mM DTT 和 400 μg/mL BSA）洗涤珠子一次。</li>
		</ol></li>
		<li>荧光标记的 CMG 的组装和激活<ol><li>去除 CMG 缓冲液，将 DNA 结合的珠子重悬于 50 μL 补充有 5 mM ATP 的 CMG 缓冲液中。</li>
			<li>向微珠结合的 DNA 中添加 50 nM Dpb11、200 nM GINS、30 nM Polɛ、20 nM S-CDK、50 nM Cdc45LD555、30 nM Sld3/7、55 nM Sld2 和 10 nM Mcm10。对于此步骤，在将它们添加到 DNA 中之前，立即将所有蛋白质混合在一个试管中并将其置于冰上。将重悬的微珠结合 DNA 添加到蛋白质混合物中。将反应物在 30 °C 下以 800 rpm 搅拌孵育 15 分钟。</li>
			<li>用 200 μL HSW 缓冲液洗涤珠子 3 次。用 200 μL CMG 缓冲液洗涤珠子一次。</li>
		</ol></li>
		<li>从磁珠中洗脱完整 DNA：CMG 复合物（图 1D）<ol><li>通过将含有 CMG 的 DNA 结合磁珠重悬于 200 μL 洗脱缓冲液（补充有 10 mM 生物素的 CMG 缓冲液）中，去除 CMG 缓冲液并从磁珠中洗脱 DNA：CMG 复合物。在室温下以 800 rpm 搅拌孵育 1 小时。</li>
			<li>将试管放在磁架上，让珠子收集 5 分钟。小心收集上清液（现在包含洗脱的 DNA：CMG 复合物），不要破坏沉淀的微珠，并将其转移到新试管中。</li>
			<li>为确保溶液中没有磁珠残留（因为残留在溶液中的磁珠会干扰分析的光捕获部分），请将收集的上清液再次放入磁架中，并让任何剩余的磁珠再收集 5 分钟。小心收集上清液并将其转移到新试管中。</li>
			<li>向 200 μL 上清液中加入 1400 μL CMG 缓冲液。样品现在可用于单分子成像。</li>
		</ol></li>
	</ol></li>
	<li>使用相关双光束光镊和共聚焦显微镜 （图 1E-G). 注：测定的单分子部分在商业设置中进行，该设置将双光束光镊与共聚焦显微镜和微流体相结合45,46 (图 1E-G），但也可以在自建设置中进行。这里使用的商业装置配备了一个微流体流通池，该流通池具有五个入口（分别称为通道 1-5）和一个出口 （图 1E).在以下步骤中，所有按钮和/或面板名称都特定于此商业设置随附的软件。<ol><li>在商业设置中使用五个入口，如下所示：从左侧注入通道 1-3，并将其用于微珠捕获（通道 1）、DNA-蛋白质复合物结合（通道 2）和检查 CMG 的存在（通道 3）。使用通道 4 和 5 作为蛋白质储液库和缓冲液交换位置。每次实验前，用 1 mg/mL 牛血清白蛋白钝化微流体流动池至少 30 分钟，然后用 0.5% Pluronic F-127 溶解在超纯水中。<ol><li>确保每个实验中每个通道的内容如前所述（图 1E）： 通道 1：在 PBS 中以 1：50 稀释的抗地高辛包被的聚苯乙烯微珠（直径 2.06 μm）; 通道 2：DNA：从磁珠中洗脱的 CMG 复合物; 通道 3：成像缓冲液（补充有 2 mM 1,3,5,7 环辛四烯、2 mM 4-硝基苄基醛酚和 2 mM Trolox 的 CMG 缓冲液）; 通道 4 和 5：补充有 25 nM RPA、10 nM Mcm10 和 5 mM ATP、5 mM ATPγS 或无核苷酸的成像缓冲液。</li>
		</ol></li>
		<li>在实验之前，通过单击软件“功率控制”面板中的“重新校准”按钮，调整捕获激光功率，以在两个陷阱 33,46 中实现 0.3 pN/nm 的刚度。在软件的“图像扫描”面板中，将共聚焦像素大小设置为 50 x 50 nm，图像大小设置为 160 x 18 像素，每个像素的照明时间设置为 0.2 毫秒，帧速率设置为 5 秒。在 Temperature （温度） 面板中将温度控制设置为 30 °C。 注：此外，我们建议将最大载物台速度（用于在通道之间移动）设置为 0.2 mm/s，以尽量减少 CMG 因阻力而从 DNA 上解离。</li>
		<li>在进样口中以 0.5 bar 的恒定压力将所有溶液流入流通池（可在软件的 Pressure Bar 面板中设置）。然后，关闭通道 4 和 5 中的流。在初始流动所有溶液后，将压力降低至 0.2 bar。</li>
		<li>将陷印激光器移动到通道 1，直到每个光阱中捕获一个微珠。通过在按下扳机的同时移动操纵杆，将捕获的珠子移动到通道 2。然后，通过使用操纵杆将右侧珠子移向和远离左侧珠子，而不按下扳机，直到 DNA 系绳被捕获（通过在软件的 FD Viewer 面板中监测被捕获的 DNA47 的力-延伸曲线来了解），从而钓出 DNA：CMG 复合物）。<ol><li>对于 DNA 栓系，请确保在“参考模型”面板中输入 DNA 长度和正确的温度值，这将在 FD 查看器面板中自动绘制 DNA 构建体的理论可扩展蠕虫状链模型。如果单个 DNA 分子夹在两个珠子之间，则 DNA 的力延伸行为应与绘制的可伸展蠕虫状链模型紧密匹配。通过监测实验力-拉伸曲线来确保这种情况，软件将自动将其绘制在理论曲线之上。 注：与理论模型的偏差可能表明存在多个 DNA 分子结合在磁珠之间和/或存在与 DNA 结合并使其压缩的蛋白质聚集体。为防止蛋白质与 DNA 的力介导解离，在此初始测试期间不要超过 10 pN 的张力。</li>
		</ol></li>
		<li>将微珠移至通道 3 并立即停止所有通道中的流路。在通道 3 中进行单帧测试扫描以确认 CMG 的存在，用 561 nm 激光以 4 μW 的功率照射，在物镜处测得。在 Excitation lasers（激发激光器）面板中调整成像激光功率。如果存在，CMG 将显示为二维衍射极限点，如图 1G 和 图 2A 所示。<ol><li>如果无法捕获 DNA，请检查通道 2 是否有气泡，这会减慢通道 2 中的流动（与通道 1 和 3 相比）。如果存在气泡，请将通道 2 中的压力增加到 1 巴，以尝试将气泡冲洗过来。</li>
		</ol></li>
		<li>如果存在 CMG，将 DNA 系绳移至通道 4 或 5 进行成像;否则，请重新打开流，丢弃磁珠，然后返回步骤 2.2.4。</li>
		<li>在通道 4 或 5 中，调整磁珠之间的距离，以在 DNA 系绳中达到 2 pN 的初始张力。为此，请在 Force Spectroscopy（力谱）面板中输入 2 pN，然后单击 Enable （启用） 按钮以启动力钳。一旦初始张力达到 2 pN，在成像前通过单击力谱面板中的启用按钮来禁用力夹。</li>
		<li>图像 CMGCdc45-LD555 每 5 秒用 561 nm 激光以 4 μW 的功率在物镜处测量（图 1F）。为此，请单击 开始扫描 图像扫描面板中的按钮。在此类扫描中，CMG 将显示为二维衍射限制点，如图 1G 中的示例所示。<ol><li>如果观察到 CMG，但在漂白前似乎没有移动，请测试用于核酸酶活性的所有蛋白质，因为 DNA 上的缺口会导致 CMG 与 DNA41 解离，严重降低其明显的持续合成能力。 注意：如果使用此处使用的商用显微镜，4 μW 的激光功率应提供一致的结果。如果使用自制设置，我们建议根据经验估计最佳激光功率。最佳激光功率应从荧光团提供足够的信号，以所需的精度对其进行定位，并且荧光团的使用寿命接近所需的实验时间范围。 注：虽然本出版物侧重于杂交集成和单分子测定，但我们之前已经发表了对该测定生成的数据分析的全面描述48。</li>
		</ol></li>
	</ol></li>
</ol>

对完全重构的 Cdc45/Mcm2-7/GINS （CMG） 的运动进行成像

作者没有什么可披露的。

关键步骤和重要的试剂质量检查 此处重点介绍了分析中的关键步骤和生物试剂质量检查。首先，所用蛋白质的纯度很重要，因为即使是蛋白质样品中很小的核酸酶污染物也会对数据产生不利影响。这是因为只有完整（或部分缺口）的 DNA 分子才能被捕获在双光束光镊中。更重要的是，DNA 上的切口会导致 CMG 解离41，从而使 CMG 长距离运动的观察复杂化。我们强烈建议检测每种纯化蛋白的核酸酶活性，并持续监测起始质粒底物的完整性，以确保将切口减少到最低限度。第二个重要步骤是在洗脱 DNA：CMG 复合物后小心去除磁珠。此步骤中的上清液去除应缓慢进行，以免干扰收集的珠子。如果磁珠留在飞入光镊的样品中，它们通常会撞击光阱的聚苯乙烯珠子，导致它们逃离光阱并使数据采集复杂化。最后，应在光镊中小心处理 DNA：CMG 复合物。为此，我们建议不要将 DNA 的张力增加到 10 pN 以上，因为施加力可能会使 CMG 与 DNA 分离。此外，微流体流通池中的通道之间移动应尽可能缓慢 （~ 0.2 mm/s），以防止产生的阻力使 CMG 与 DNA 分离。
方法的修改 该检测的几个步骤可以修改。例如，我们已经证明洗脱时间可以从 60 分钟缩短到 30 分钟，而不会显着影响洗脱产量。此外，我们建议在洗脱缓冲液中补充低浓度（低于 1 mM）的 ATP 或 ATPγS，以防止 CMG 从 DNA 末端扩散，并通常稳定 CMG28。此外，尽管我们在此处报告的缓冲液组成和蛋白质浓度基于先前的集成生化和单分子工作 11,18 中采用的缓冲液组成和蛋白质浓度，但我们描述的测定与其他组装 CMG 的方案完全兼容26,27。因此，任何据报道可以提高 CMG 组装或激活效率的生化进步都可以而且应该在测定的大部分部分实施，以提高产量。最后，增加帧之间的时间增加了 CMG 成像的总时间，有助于在荧光团漂白之前观察长距离 CMG 运动。
该方法的局限性 我们描述的混合方法有限，因为只能在批量激活 CMG 后对其进行成像。需要进一步的工作来实时观察 CMG 的激活。另一个重要的限制是，虽然我们预计 CMG 成对组装 17,26,27，但我们观察到的每个 DNA 的 CMG 复合物总数大多是一个28，这表明 CMG 或至少 Cdc45 在处理敏感的 DNA：CMG 复合物期间与 DNA 分离。减少单分子成像前的处理步骤数量，以及为微流体流动池的塑料管和玻璃开发更好的钝化策略，有望提高这一产量。
该方法的意义 迄今为止，CMG 的单分子运动研究采用了从细胞中纯化为复合物的预活化 CMG。虽然相对简单，但这种预激活的 CMG 方法的局限性在于它错过了导致 CMG 激活的任何步骤，以及 CMG 和复制体运动的双向性质。另一方面，CMG 组装和激活的完全重构有可能研究任何预激活步骤，以及以双向方式研究 CMG 运动。然而，这种方法更难从体生化水平转化为单分子水平，因为它涉及更多的纯化蛋白质因子和步骤。我们在这里描述的分析使我们能够在单分子水平上对完全重构的 CMG 的运动进行成像，从而帮助我们获得一些以前错过的预激活动力学28，从而帮助克服了这些挑战。此外，虽然我们大多看到每个 DNA 有一个 CMG，但我们能够观察到两个 CMG 复合体向相反方向移动的几个实例，我们甚至可以捕捉到姐妹 CMG 彼此之间的初始分离28，为建立双向复制提供了一些见解。
与以前的 CMG 运动相比，该测定的另一个优势在于我们采用的 DNA 底物的完全双链性质（图 1A）。在以前的预激活 CMG 研究中，将 CMG 与 DNA 底物结合的最常见方式是通过 3' ssDNA 瓣。这导致 DNA 构建体不容易受到扭转约束，因此禁止研究超螺旋在复制体进程中的作用。相反，我们在这里描述的新方法有可能适用于研究扭矩在此过程中的作用，因为使用的 DNA 底物是完全双链的。
该方法的广泛应用 所描述的杂交测定将为完全重建完整的真核复制体铺平道路，使我们和其他人能够观察和量化使复制体成功完成所有不同任务的重要动力学。撇开 DNA 复制不谈，我们报道的检测代表了将复杂的生化反应从本体生化转化为单分子水平的重要进步。我们预计该测定法可以很容易地修改以研究涉及不同 DNA 加工机制的类似复杂的 DNA：蛋白质相互作用。

真核生物中的 DNA 复制由称为复制体1 的动态蛋白质复合物进行。该复合物的一个关键组分是真核复制解旋酶 Cdc45/Mcm2-7/GINS （CMG），它驱动并集中组织复制体，在复制叉的前面处于领先地位 1,2。因此，深入了解 CMG 的动力学对于理解复制体的动力学至关重要。这种理解可以通过单分子技术获得，单分子技术特别适合研究分子马达，例如 CMG，因为它们具有无与伦比的空间和时间分辨率，并且可以为我们提供对它们的功能、随机性和动力学的无与伦比的定量理解 2,3,4,5,6,7,8,9。
在体内，CMG 以时间分离的方式加载和激活，以确保每个细胞周期仅发生一次复制 1,10,11。首先，在细胞周期的 G1 期，一组称为负载因子的蛋白质将 CMG 的第一个成分，即 Mcm2-7 六聚体复合物，以双六聚体的形式以头对头构型 15,17,18 的形式加载到 dsDNA 12,13,14,15,16 上.在酵母的特定情况下，这个初始过程发生在称为复制起点1 的特定 DNA 序列上。尽管 Mcm2-7 是复制解旋酶的马达核心，但如果没有两个解旋酶激活因子 Cdc45 和 GINS，它本身无法解开 DNA19，它们需要被募集到负载的 Mcm2-7 中才能产生完全活性的 CMG 11,19,20,21。解旋酶激活过程发生在细胞周期的 S 期，从细胞周期调节激酶 DDK 对 Mcm2-7 双六聚体的选择性磷酸化开始 22,23,24。这些磷酸化事件促进第二组称为放电因子的蛋白质10,11,26 将 Cdc45 和 GINS 募集到 Mcm2-7 双六聚体10、22、23、24、25、26.Cdc45 和 GINS 的结合产生两个姐妹 CMG 解旋酶，它们最初包含亲本 DNA 的两条链，并且仍然以头对头配置定位11,27。在最后的激活步骤中，放电因子 Mcm10 催化来自每个姐妹 CMG11 的一条 DNA 链的 ATP 水解依赖性挤出。链挤出后，姐妹 CMG 解旋酶以 ATP 水解依赖性方式沿 ssDNA 易位而绕过并彼此分离 11,20,21,28，通过空间排除非易位链来解旋 DNA29。整个过程已在体外从最少的 36 种纯化酿酒酵母多肽10,11 中完全重构。
尽管上述 CMG 组装和激活具有精细的体内调节作用，但迄今为止，CMG 2,30,31,32,33,34 的体外重组单分子运动研究依赖于从细胞中纯化为复合物的预活化 CMG20,21，缺少激活之前的所有步骤以及其运动的双向性质。这种预活化的 CMG 方法已成为单分子领域的金标准，部分原因是完全重构的 CMG 组装反应的生化复杂性10,11。由于多种原因，这种生化反应从本体生化水平转化为单分子水平一直具有挑战性。首先，为了最大限度地提高反应效率，CMG 组装和活化所需的负载和燃烧因子需要在 10-200 nM 10,11,27 的浓度范围内。这些浓度范围对应于大多数单分子技术可以容忍的高端，尤其是在使用荧光标记组分时35。最后，CMG 已经发展到在一个单元 36,37,38,39 中巡游数千个碱基对。因此，要在生物学相关的空间尺度上研究其运动，需要长 DNA 底物（通常长度为数十千碱基左右）30,31,34,40,41,42。使用如此长的 DNA 底物带来了额外的挑战，即 DNA 底物越长，它对蛋白质和蛋白质聚集体的潜在非特异性结合位点就越多。在 CMG 的情况下，后一点特别重要，因为 CMG 组装和激活中涉及的几个加载和放电因子包含本质上无序的区域43 并且容易聚集。
在这里，我们报道了一种杂交集成和单分子测定，该测定允许观察和定量 CMG 从 36 个纯化的 酿酒酵母 多肽28 完全重组其组装和激活后的运动。该测定依赖于具有两个正交连接部分的 DNA 底物两端的双重功能化：脱硫生物素和地高辛2 （图 1A）。第一个部分脱硫生物素用于将 DNA 底物可逆地结合到链霉亲和素包被的磁珠上 44 （图 1B）。在此之后，荧光标记的 CMG 被组装并激活到磁珠结合的 DNA 上，并使用磁架纯化和洗涤得到的磁珠结合 DNA：CMG 复合物（图 1C）。在此过程中，会聚集在 DNA 底物上的多余蛋白质被去除;这提供了几乎无聚集的 DNA：CMG 复合物。然后通过添加摩尔过量的游离生物素从磁珠中洗脱完整的复合物，这可以胜过脱硫生物素-链霉亲和素相互作用（图 1D）。单个 DNA：然后，CMG 复合物在两个包被有抗地高辛抗体（抗 Dig）的光学捕获聚苯乙烯珠之间结合;对于此步骤，使用 DNA 上的第二个部分地高辛，因为它即使在含有过量游离生物素的缓冲溶液中也可以与抗 Dig 结合（图 1E）。一旦 DNA：CMG 复合物在光阱中固定到位，荧光标记的 CMG 的运动就会用共聚焦扫描激光成像（图 1F）。我们预计该测定法可以很容易地适用于类似复杂 DNA：蛋白质相互作用的单分子水平的研究。

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>AflII&#160;</td>
			<td>NEB</td>
			<td>R0520L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-digoxigenin coated polystyrene beads&#160;</td>
			<td>Spheroteck</td>
			<td>DIGP-20-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ATP solution</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>R0441</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ATP&#947;S</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11162306001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA</td>
			<td>NEB</td>
			<td>B9000S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C-Trap</td>
			<td>Lumicks</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CutSmart Buffer</td>
			<td>NEB</td>
			<td>B6004S</td>
			<td>Provided with AflII</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dCTP</td>
			<td>Promega</td>
			<td>U122B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-Desthiobiotin-7-dATP</td>
			<td>Jena Bioscience&#160;</td>
			<td>NU-835-Desthiobio</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dGTP</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>10218014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Digoxigenin-11-dUTP</td>
			<td>Jena Bioscience</td>
			<td>NU-803-DIGXL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dynabeads M-280 Streptavidin magnetic beads</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>11205D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Klenow Fragment (3&#39;&#8594;5&#39; exo-)&#160;</td>
			<td>NEB</td>
			<td>M0212L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microspin S-400 HR spin columns&#160;</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>GE27-5140-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NEBuffer2</td>
			<td>NEB</td>
			<td>B7002S</td>
			<td>Provided with Klenow Fragment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nonidet&#160;P 40 Substitute</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>74385</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pluronic F-127&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P2443</td>
			<td></td>
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</table>

hybrid ensemble and single-molecule assay to image the motion of fully reconstituted cmg

真核生物有一个称为 CMG 的复制解旋酶，它集中组织和驱动复制体，并在复制叉的前面引领潮流。深入了解 CMG 的动力学机制对于阐明细胞如何完成每个细胞周期一次高效、准确地复制其整个基因组的巨大任务至关重要。单分子技术具有无与伦比的时间和空间分辨率，因此特别适合量化 CMG 的动力学。然而，迄今为止，CMG 运动的单分子研究依赖于从细胞中纯化的预形成的 CMG 作为复合物，这排除了对其激活步骤的研究。在这里，我们描述了一种杂交集成和单分子测定法，该测定法允许从 36 种不同的纯化酿酒 酵母 多肽完全重组其组装和激活后，在荧光标记的 CMG 运动的单分子水平上成像。该测定依赖于具有两个正交连接部分的线性 DNA 底物末端的双重功能化，并且可以适应在单分子水平上研究类似复杂的 DNA 加工机制。

DNA replication in eukaryotes is carried out by a dynamic protein complex known as the replisome1. A key component of this complex is the eukaryotic replicative helicase Cdc45/Mcm2-7/GINS (CMG), which drives and centrally organizes the replisome, leading the way at the front of replication forks1,2. Obtaining a deep quantitative understanding of the dynamics of CMG is therefore critical to understanding the dynamics of the replisome. Such an understanding could be acquired with single-molecule techniques, which are uniquely suited to study molecular motors, such as CMG, due to their unmatched spatial and temporal resolution, and can provide us with an unparalleled quantitative understanding of their function, stochasticity, and dynamics2,3,4,5,6,7,8,9.
In vivo, CMG is loaded and activated in temporally separated fashion to ensure that replication occurs only once per cell cycle1,10,11. First, in the G1 phase of the cell cycle, a set of proteins known as loading factors loads the first component of CMG, the Mcm2-7 hexameric complex, onto dsDNA12,13,14,15,16 in the form of double hexamers with&#160;a head-to-head configuration15,17,18. In the specific case of yeast, this initial process occurs at specific DNA sequences known as origins of replication1. Although Mcm2-7 is the motor core of the replicative helicase, it is by itself unable to unwind DNA19 without the two helicase-activating factors Cdc45 and GINS, which need to be recruited to the loaded Mcm2-7 to give rise to fully active CMG11,19,20,21. The process of helicase activation takes place in the S&#160;phase of the cell cycle and starts with the selective phosphorylation of Mcm2-7 double hexamers by the cell cycle-regulated kinase DDK22,23,24. These phosphorylation events facilitate the recruitment of Cdc45 and GINS to the Mcm2-7 double hexamers10,22,23,24,25,26 by a second set of proteins known as firing factors10,11,26. The binding of Cdc45 and GINS gives rise to two sister CMG helicases, which initially enclose both strands of the parental DNA and are still located in a head-to-head configuration11,27. In the final activation step, the firing factor Mcm10 catalyzes the ATP hydrolysis-dependent extrusion of one DNA strand from each sister CMG11. After strand extrusion, sister CMG helicases bypass and separate from each other by translocating along ssDNA in an ATP hydrolysis-dependent manner11,20,21,28, unwinding DNA by sterically excluding the non-translocation strand29. This entire process has been fully reconstituted in vitro from a minimal set of 36 purified S. cerevisiae polypeptides10,11.
Despite the exquisite in vivo regulation of CMG assembly and activation described above, in vitro reconstituted single-molecule motion studies of CMG2,30,31,32,33,34 have thus far relied on pre-activated CMG purified as a complex from cells20,21, missing all the steps prior to its activation and the bidirectional nature of its motion. This pre-activated CMG approach has been the gold standard in the single-molecule field partly due to the biochemical complexity of the fully reconstituted CMG assembly reaction10,11. This biochemical reaction has been challenging to translate from the bulk biochemical level to the single-molecule level for several reasons. First, to maximize reaction efficiencies, the loading and firing factors needed for CMG assembly and activation are required at concentrations in the range of 10-200 nM10,11,27. These ranges of concentration correspond to the high end of what most single-molecule techniques can tolerate, especially when using fluorescently labeled components35. Finally, CMG has evolved to cruise through thousands of base pairs in a cell36,37,38,39. Therefore, to study its motion at a biologically relevant spatial scale, one requires long DNA substrates (typically of lengths in the order of tens of kilobases)30,31,34,40,41,42. Employing such long DNA substrates poses the additional challenge that the longer the DNA substrate is, the more potential non-specific binding sites for proteins and protein aggregates it has. In the case of CMG, the latter point is particularly important, as several of the loading and firing factors involved in CMG assembly and activation contain intrinsically disordered regions43 and are aggregation-prone.
Here, we report a hybrid ensemble and single-molecule assay that allowed the observation and quantification of the motion of CMG after fully reconstituting its assembly and activation from 36 purified S. cerevisiae polypeptides28. This assay relies on the double functionalization of both ends of a DNA substrate with two orthogonal attachment moieties: desthiobiotin and digoxigenin2 (Figure 1A). The first moiety, desthiobiotin, is used to reversibly bind the DNA substrate to streptavidin-coated magnetic beads44 (Figure 1B). Following this, fluorescently labeled CMG is assembled and activated onto the bead-bound DNA, and a magnetic rack is used to purify and wash the resulting magnetic bead-bound DNA:CMG complexes (Figure 1C). In doing so, the excess protein that would otherwise aggregate on the DNA substrate is removed; this provides virtually aggregation-free DNA:CMG complexes. Intact complexes are then eluted from the magnetic beads by the addition of a molar excess of free biotin, which can outcompete the desthiobiotin-streptavidin interaction (Figure 1D). Individual DNA:CMG complexes are then bound between two optically trapped polystyrene beads coated with anti-digoxigenin antibody (anti-Dig); for this step, the second moiety on the DNA, digoxigenin, is used as it can bind to anti-Dig even in a buffer solution containing an excess of free biotin (Figure 1E). Once the DNA:CMG complex is held in place in the optical trap, the motion of fluorescently labeled CMG is imaged with a confocal scanning laser (Figure 1F). We anticipate that this assay can be easily adapted for the study at the single-molecule level of similarly complex DNA:protein interactions.

作者聚焦：在单分子水平上研究真核复制体组分的运动动力学

杂交集合和单分子检测对完全重构的 CMG 的运动进行成像

We study the motion dynamics of different components of the eukaryotic replisome at the single molecule level. In order to obtain a deep quantitative understanding of how cells can duplicate their entire genomes, every cell cycle. In a breakthrough in 2015, eukaryotic DNA replication was fully reconstituted in vitro from purified protein components.And this gave us a lot of control over the system. And since then, it's been used extensively to answer questions about different stages of DNA replication with increasing temporal and spatial resolution. And this was done using complementary approaches such as cryo EM and single molecule biophysics.In the single molecule field, one of the biggest challenges with this system is the number of proteins involved and also the concentrations at which these components are required in order to maximize the efficiency of the overall reaction because this can complicate the single molecule imaging. The protocol described here introduces a hybrid approach in which a protein complex is first assembled in an efficient manner using ensemble biochemistry before then being introduced and studied in a single molecule setting. This avoids the introduction of two high protein concentrations at the single molecule level.We illustrate this approach for studying the behavior of the replicative helicase CMG on DNA at the single molecule level following its assembly via the origin based pathway. But this approach can also be used to study the dynamics of many other types of DNA binding protein complexes.

如果正确执行，此处描述的方案应产生几乎无聚集体的 DNA：CMG 复合物。无聚集反应不应堵塞微流体流动池中的任何通道，并且应该能够将捕获的 DNA 分子拉伸到其轮廓长度 10% 以内的端到端延伸，而不会破坏 DNA。相反，如果反应中存在聚集，DNA 分子有时可能会被聚集体压实，如果拉伸，通常会导致 DNA 断裂。识别蛋白质聚集体的一个好方法是查看 DNA 的 2D 扫描。在无聚集反应中，CMG 表现为离散的、对称的衍射限制点，稀疏地挤满了 DNA，如图 2A 所示的扫描中的点。相反，聚集体不太离散，有时不对称的斑点挤满了较长的 DNA，如图 2B 所示的扫描中所示。此外，如果测定成功执行，并且纯化蛋白质达到高纯度，则在 ATP 存在下将看到 CMG 的长距离运动，如图 2C 所示的运动记录仪所示。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67076/67076fig01v2.jpg"> 图 1：杂交集合和单分子测定的图形描述，用于对完全重构的 CMG 的运动进行成像和量化。 （A） 含有天然存在的 ARS1 复制起点的 23.6 kb 线性 DNA 在两端通过脱硫生物素和地高辛部分进行双重功能化。（B） 双重功能化的 DNA 通过其脱硫生物素部分与链霉亲和素包被的磁珠结合。（C） CMG 在磁珠结合的 DNA 上逐步组装和激活，包括不同的洗涤步骤，以去除多余的未结合蛋白质和蛋白质聚集体。（D） 完整的 DNA：然后通过添加过量的游离生物素从磁珠中洗脱 CMG 复合物，这超过了脱硫生物素-链霉亲和素的相互作用。（E） 单个 DNA：CMG 复合物在微流体流动池的帮助下结合在两个抗地高辛包被的光学捕获聚苯乙烯珠之间。请注意，Dig-抗 Dig 相互作用与生物素-亲和素相互作用正交，因此不受游离生物素存在的影响。（F） 一旦被光镊固定到位，DNA：CMG 复合物就会转移到不同的缓冲条件下，然后用共聚焦扫描激光扫描 DNA 平面，以对 CMG 沿 DNA 随时间的运动进行成像。（G） 上面板显示了 DNA：CMG 复合物固定在两个光学捕获的防 DIG 涂层聚苯乙烯珠子之间的图表，这些聚苯乙烯珠子正在通过共聚焦扫描激光进行扫描。下图显示了 CMG 与用光阱固定的 DNA 结合的 2D 扫描示例。在这些实验中，DNA 没有被标记，但可以将其视为一条穿过图像中间的水平线。这个数字是从28 个修改而来的。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67076/67076fig01largev2.jpg" target="_blank">请单击此处查看此图的较大版本。</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67076/67076fig02.jpg"> 图 2：成功和不成功的实验数据示例。 （A） 无聚集样品中含 CMG 的 DNA 的 2D 扫描示例。在两次扫描中，CMG 都显示对称和离散的衍射限制点，沿 DNA 稀疏分布。（B） 在含有聚集体的样品中含 CMG 的 DNA 的 2D 扫描示例。在这两种扫描中，CMG 都会形成不太对称的斑点，使 DNA 拥挤。（C） 运动图显示了在 ATP 存在下 CMG 衍射限制点在 DNA 上的位置随时间的变化，显示了 CMG 复合物的长程运动。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67076/67076fig02large.jpg" target="_blank">请单击此处查看此图的较大版本。</a>

我们报道了一种杂交集成和单分子测定法，用于直接成像和量化荧光标记、完全重组的 Cdc45/Mcm2-7/GINS （CMG） 解旋酶在光阱中固定的线性 DNA 分子上的运动。

Eukaryotes have one replicative helicase known as CMG, which centrally organizes and drives the replisome, and leads the way at the front of replication ...

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Research

JoVE Journal

Biochemistry

Hybrid Ensemble and Single-molecule Assay to Image the Motion of Fully Reconstituted CMG

Eukaryotes have one replicative helicase known as CMG, which centrally organizes and drives the replisome, and leads the way at the front of replication forks. Obtaining a deep mechanistic understanding of the dynamics of CMG is critical to elucidating how cells achieve the enormous task of efficiently and accurately replicating their entire genome once per cell cycle. Single-molecule techniques are uniquely suited to quantify the dynamics of CMG due to their unparalleled temporal and spatial resolution. Nevertheless, single-molecule studies of CMG motion have thus far relied on pre-formed CMG purified from cells as a complex, which precludes the study of the steps leading up to its activation. Here, we describe a hybrid ensemble and single-molecule assay that allowed imaging at the single-molecule level of the motion of fluorescently labeled CMG after fully reconstituting its assembly and activation from 36 different purified S. cerevisiae polypeptides. This assay relies on the double functionalization of the ends of a linear DNA substrate with two orthogonal attachment moieties, and can be adapted to study similarly complex DNA-processing mechanisms at the single-molecule level.

We report a hybrid ensemble and single-molecule assay to directly image and quantify the motion of fluorescently labeled, fully reconstituted Cdc45/Mcm2-7/GINS (CMG) helicase on linear DNA molecules held in place in an optical trap.

科研

生物化学

Binding of Doubly Functionalized Linear DNA Substrate to Streptavidin-Coated Magnetic Beads

Proceed to perform the reaction after functionalizing both ends of the linear DNA substrate. First, take four S-400 spin columns and vortex them for at least 30 seconds to resuspend the resin. Then, centrifuge them for one minute at 735G to remove the storage buffer.Transfer the columns to clean 1.5 milliliter tubes. Immediately, add 100 microliters of the doubly functionalized linear DNA solution to each column. Centrifuge the columns for two minutes at 735G to flow the DNA through the column while retaining the unincorporated nucleotides.After pooling together the flow-through containing the DNA from the four columns, measure the volume with a pipette. Next, vortex M-280 streptavidin-coated magnetic beads for 30 seconds to resuspend them. Transfer four milligrams of the resuspended magnetic beads to a clean 1.5 milliliter tube.Place the tube in a magnetic rack for one minute to collect the beads before removing the storage buffer. Resuspend the beads in one milliliter of buffer A by vortexing for five seconds before incubating the beads at room temperature for five minutes. Collect the beads by placing the tube in a magnetic holder for one minute.After removing buffer A, resuspend the beads in 400 microliters of 2X buffer A by pipetting. Then, add 400 microliters of the functionalized DNA solution to the beads, and mix gently by pipetting. Incubate the bead DNA mixture overnight at four degrees Celsius with end over end rotation.The next day, use the magnetic rack to remove the supernatant before calculating the total amount of DNA bound to the magnetic beads. Then, wash the beads sequentially with buffer B and buffer C.Resuspend the beads in 300 microliters of buffer C and make four 75 microliter aliquots.

双重功能化线性 DNA 底物与链霉亲和素包被的磁珠的结合

Ensemble Assembly and Activation of Fluorescently Labeled CMG onto Magnetic Bead-Bound DNA for Single Molecule Imaging

To begin, take one 75 microliter aliquot containing one milligram of DNA-bound streptavidin-coated magnetic beads and remove the supernatant with the magnetic rack. Wash the beads with 200 microliters of loading buffer. Then resuspend the beads in 75 microliters of loading buffer and mix gently by pipetting.Next, add the origin recognition complex at a final concentration of 37.5 nanomolar to the bead-bound DNA and incubate the reaction for five minutes at 30 degrees Celsius with 800 revolutions per minute agitation. Add CDC6 at a final concentration of 50 nanomolar and incubate the reaction as demonstrated before. Then add Mcm2-7 Cdt1 at a final concentration of 100 nanomolar and incubate the reaction for 20 minutes as demonstrated previously.After that, add DDK at a final concentration of 100 nanomolar and incubate similarly for 30 minutes. After removing the supernatant, wash the bead-bound DNA containing phosphorylated Mcm-2-7 hexamers with 200 microliters of high salt wash buffer. Mix by pipetting, ensuring the beads are fully resuspended.Next, remove the buffer and wash the beads once with 200 microliters of CMG buffer. To assemble and activate the fluorescently-labeled CMG onto bead-bound DNA, remove the CMG buffer and resuspend the DNA-bound beads in 50 microliters of CMG buffer supplemented with five millimolar ADP. Next, mix all the components mentioned on the screen in one tube and place it on ice.Immediately add the resuspended bead-bound DNA to the protein mix. Incubate the reaction for 15 minutes at 30 degrees Celsius with 800 RPM agitation. Wash the bead sequentially with HSW buffer and CMG buffer.After removing the buffer, resuspend the CMG containing DNA-bound magnetic beads in 200 microliters of elution buffer, then incubate at room temperature for one hour with 800 RPM agitation. Place the tube in a magnetic rack and allow the beads to be collected for five minutes. Carefully collect the supernatant containing the eluted DNA-CMG complexes without disrupting the settled beads and transfer it to a new tube.To ensure that no beads remain in the solution, place the collected supernatant again in a magnetic rack and keep for another five minutes carefully. Collect the supernatant and transfer it to a new tube. Add 1, 400 microliters of CMG buffer to the 200 microliters of supernatant.The sample is now ready for single molecule imaging.

荧光标记的 CMG 在磁珠结合的 DNA 上的集合组装和激活，用于单分子成像

Single-Molecule Imaging of Fully Reconstituted CMG with Correlative Dual-Beam Optical Tweezers and Confocal Microscopy

Perform the single molecule imaging in a commercial setup, combining dual beam optical tweezers with confocal microscopy. Use inject channel one for bead trapping, channel two for DNA protein complex binding, channel three for checking the presence of CMG and channels four and five as protein reservoirs and buffer exchange locations. Flow all solutions into the flow cell at a constant pressure of 0.5 bar in the injection port.Then turn off the flow in channels four and five. After initially flowing all solutions, reduce the pressure to 0.2 bar. Move trapping lasers to channel one until one bead is caught in each optical trap.Move trapped beads to channel two by moving the joystick while pressing the trigger. Using the joystick without pressing the trigger fish a DNA CMG complex by moving the right bead towards and away from the left bead until a DNA tether is trapped. Move the beads to channel three and immediately stop the flow in all channels.Adjust the 561 nanometer laser power to four microwatts in the excitation laser panel and then take a one frame test scan of the DNA in channel three. If present, CMG will appear as two dimensional diffraction limited spots. In this case, move the DNA tether to either channel four or five for imaging.Otherwise, turn the flow back on, discard the beads and repeat the steps. In channels four or five input two piconewtons in the force spectroscopy panel, and click on the enable button to start a force clamp. Once the initial tension reaches two piconewtons, disable the force clamp before imaging by clicking again on the enable button in the force spectroscopy panel.Click the start scan button in the image scan panel. Image fluorescent CMG every five seconds with a 561 nanometer laser at a power of four microwatts as measured at the objective. In an aggregation free reaction, CMG appeared as discrete, symmetrical diffraction limited spots sparsely crowding the DNA.On the contrary, aggregates are less discrete, sometimes asymmetrical blobs crowding a larger length of the DNA. If the assay was successfully executed and high purity of the purified proteins was achieved, long range motion of CMG in the presence of ATP could be observed.