Vi studerer bevægelsesdynamikken af forskellige komponenter i det eukaryote replisom på enkeltmolekyleniveau. For at opnå en dyb kvantitativ forståelse af, hvordan celler kan duplikere hele deres genomer, hver cellecyklus. I et gennembrud i 2015 blev eukaryot DNA-replikation fuldt rekonstitueret in vitro fra oprensede proteinkomponenter.
Og det gav os en masse kontrol over systemet. Og siden da er det blevet brugt i vid udstrækning til at besvare spørgsmål om forskellige stadier af DNA-replikation med stigende tidsmæssig og rumlig opløsning. Og dette blev gjort ved hjælp af komplementære tilgange såsom cryo EM og enkeltmolekyle biofysik.
Inden for enkeltmolekyleområdet er en af de største udfordringer med dette system antallet af involverede proteiner og også de koncentrationer, hvor disse komponenter er nødvendige for at maksimere effektiviteten af den samlede reaktion, fordi dette kan komplicere enkeltmolekylebilleddannelsen. Protokollen, der er beskrevet her, introducerer en hybrid tilgang, hvor et proteinkompleks først samles på en effektiv måde ved hjælp af ensemblebiokemi, før det derefter introduceres og studeres i en enkelt molekyleindstilling. På den måde undgår man introduktionen af to høje proteinkoncentrationer på enkeltmolekyleniveau.
Vi illustrerer denne tilgang til at studere opførslen af den replikative helikase CMG på DNA på enkeltmolekyleniveau efter dens samling via den oprindelsesbaserede vej. Men denne tilgang kan også bruges til at studere dynamikken i mange andre typer DNA-bindende proteinkomplekser.