Forfatterne takker Anne Early, Lucy Drury og Max Douglas for at levere gærstammer til overekspression af umærkede proteiner, samt ND-laboratoriemedlemmer Anuj Kumar, Katinka Ligthart og Julien Gros for deres hjælp med at rense belastningsfaktorer og DDK. Forfatterne takker også Kaley McCluskey, Dorian Mikolajczak, Joseph Yeeles, Jacob Lewis, Alessandro Costa, Hasan Yardimci og Taekjip Ha for nyttige videnskabelige diskussioner. D.R.M. anerkender finansiering fra et Boehringer Ingelheim Fonds ph.d.-stipendium.  N.D. anerkender finansiering fra den nederlandske organisation for videnskabelig forskning (NWO) gennem Top-bevilling 714.017.002 og fra Det Europæiske Forskningsråd gennem et Advanced Grant (REPLICHROMA; bevillingsnummer 789267).

1. Syntese af dobbelt funktionaliseret lineært DNA-substrat og binding til magnetiske perler
<ol><li>Dobbelt funktionalisering af DNA-substrat med desthiobiotin- og digoxigenindele<ol><li>Linearisere 20 μg 23,6 kb plasmid pGL50-ARS1 (indeholdende en naturlig ARS1-replikationsoprindelse, klonet internt og tilgængelig på anmodning) med 200 enheder restriktionsenzym AflII i 16 timer ved 37 °C i et slutvolumen på 200 μL 1x buffer (50 mM kaliumacetat, 20 mM Tris-acetat, 10 mM magnesiumacetat, 100 μg/ml BSA, pH 7,9). BEMÆRK VENLIGST: Dette trin kan reduceres til 4 timer uden at reducere udbyttet, hvis det er mere bekvemt.</li>
		<li>Inaktiver AflII ved at inkubere reaktionen ved 65 °C i 20 min. Sløv de resulterende 4-nukleotid TTAA-udhæng ved at supplere 200 μL lineariseringsreaktionen med 60 enheder Klenow Fragment (3' til 5' exo-) polymerase, 17 μL 10x buffer (500 mM NaCl, 100 mM Tris-HCl, 100 mM MgCl2, 10 mM DTT, pH 7,9), 33 μM D-Desthiobiotin-7-dATP, 33 μM Digoxigenin-11-dUTP, 33 μM dCTP, 33 μM dGTP, og ultrarent vand til et endeligt volumen på 370 μM. Inkuber reaktionen ved 37 °C i 30 minutter. BEMÆRK: I dette trin afstumper Klenow-fragmentet udhængene i begge ender af det lineariserede DNA ved at inkorporere to D-Desthiobiotin-7-dATP og to Digoxigenin-11-dUTP-nukleotider i hver ende.</li>
		<li>Suppler reaktionen med 10 mM EDTA og inaktiver Klenow-fragmentet ved at inkubere reaktionen ved 75 °C i 20 minutter. Bring reaktionsvolumenet til 400 μL med ultrarent vand.</li>
		<li>Tag fire S-400 spin-kolonner, hvirvl dem i mindst 30 sekunder for at ophænge harpiksen, og centrifuger dem derefter i 1 minut ved 735 x g for at fjerne opbevaringsbufferen. Overfør søjlerne til rene 1,5 ml rør.</li>
		<li>Tilsæt straks 100 μL af DNA-opløsningen til hver kolonne og centrifuger dem i 2 minutter ved 735 x g. DNA'et er nu i gennemstrømningen, og søjlerne kan kasseres.</li>
		<li>Saml gennemstrømningen af de fire kolonner, mål volumen med en pipette og mål DNA-koncentrationen med et spektrofotometer. Dette vil blive brugt til at beregne mængden af DNA bundet til perlerne.</li>
	</ol></li>
	<li>Binding af dobbelt funktionaliseret lineært DNA til streptavidinbelagte magnetiske perler<ol><li>Vortex M-280 streptavidin-belagte magnetiske perler i 30 s for at gensuspendere dem.</li>
		<li>Overfør 4 mg resuspenderet M-280 streptavidin-belagte magnetiske perler til et rent 1,5 ml rør. Placer røret i et magnetisk stativ, vent 1 minut på, at perlerne er samlet, og fjern opbevaringsbufferen.</li>
		<li>Tilsæt 1 ml 1x buffer A (5 mM Tris-HCl pH 7,5, 0,5 mM EDTA og 1 M NaCl) til perlerne og suspender igen ved hvirvel i 5 s. Inkuber perlerne ved stuetemperatur i 5 min. BEMÆRK VENLIGST: Alle buffere skal sterilfiltreres. Lav en stor mængde 2x buffer A, 1x buffer B (se nedenfor) og 1x buffer C (se nedenfor) på forhånd for at spare tid (anbefales). Disse buffere er dem, der anbefales af producenten af de magnetiske perler og kan opbevares ved -20°C.</li>
		<li>Placer røret i en magnetisk holder, vent 1 minut på, at perlerne er samlet, og fjern buffer A.</li>
		<li>Resuspender perlerne i 400 μL 2x buffer A ved pipettering, og tilsæt derefter 400 μL funktionaliseret DNA-opløsning (bemærk, at dette fortynder 2x buffer A til en endelig koncentration på 1x, hvilket er optimalt for DNA-binding til perlerne). Bland forsigtigt ved pipettering.</li>
		<li>Inkuber perle/DNA-blandingen natten over ved 4 °C med ende-over-ende-rotation for at tillade det funktionaliserede DNA at binde sig til perlerne.</li>
		<li>Brug det magnetiske stativ til at fjerne supernatanten (kasser ikke, før du måler dens volumen med en pipette og koncentrationen af ubundet DNA med et spektrofotometer) og vask perlerne 2x med 500 μL buffer B (10 mM HEPES-KOH pH 7.6, 1 mM EDTA og 1 M KOAc) for at fjerne ikke-specifikt bundet DNA. Vask perlerne 2x med 500 μL buffer C (10 mM HEPES-KOH pH 7,6 og 1 mM EDTA), som er den opbevaringsbuffer, der anbefales af producenten.<ol><li>Beregn den samlede mængde DNA bundet til de magnetiske perler ved at sammenligne den samlede mængde DNA tilsat perlerne med mængden af DNA tilbage i supernatanten. Udbyttet skal være i intervallet 2,3-2,9 mg DNA (~150-190 fmol) pr. mg magnetiske perler. Hvis der opnås lavere udbytter, skal du kontrollere, at S400-kolonnerne ikke er tørre, før du bruger dem. Overvåg konstant DNA-integriteten ved gelelektroforese for at sikre, at det oprindelige plasmid-DNA-substrat ikke nedbrydes.</li>
		</ol></li>
		<li>Opslæm perlerne i 300 μL buffer C og opbevar ved 4 °C. For at forhindre hak skal du lave 4 engangsalikvoter af 1 mg magnetiske perler, og opbevar ikke DNA'et i mere end 2 uger.</li>
	</ol></li>
</ol>2. Hybrid ensemble og enkeltmolekyleanalyse til at afbilde og kvantificere bevægelsen af fuldt rekonstitueret CMG med korrelativ dobbeltstråle optisk pincet og konfokalmikroskopi
<ol><li>Ensemblesamling og aktivering af fluorescerende mærket CMG på magnetisk perlebundet DNA (Figur 1C). BEMÆRK VENLIGST: CMG-samling og aktiveringsreaktioner blev udført i to trin: Mcm2-7-belastning og fosforylering og CMG-samling og aktivering. Medmindre andet er angivet, blev alle bufferudskiftningstrin udført ved hjælp af et magnetisk stativ ved at lade perlerne blive opsamlet af magneten i 1 minut og derefter fjerne supernatanten. Alle inkubationer blev udført i en temperaturkontrolleret varmeblok med låg for at forhindre fotoblegning af fluorescerende proteiner. Hvis der ikke er et låg tilgængeligt, skal rørene dækkes med stanniol. Oprensning og fluorescerende mærkning af alle de proteiner, der anvendes i denne protokol, er udført som tidligere beskrevet10,11,28.<ol style="margin-left: 40px;"><li>Mcm2-7 belastning og fosforylering<ol><li>Tag 1 mg DNA-bundne streptavidin-belagte magnetiske perler og fjern opbevaringsbufferen (buffer C).</li>
			<li>Vask perlerne med 200 μL belastningsbuffer (25 mM HEPES-KOH pH 7,6, 100 mM K glutamat, 10 mM MgOAc, 0,02% NP40-erstatning, 10% glycerol, 2 mM DTT, 100 μg/ml BSA og 5 mM ATP).</li>
			<li>Fjern belastningsbufferen, og ophæng perlerne igen i 75 μL belastningsbuffer. Bland forsigtigt ved pipettering.</li>
			<li>Tilsæt ORC i en slutkoncentration på 37,5 nM til det perlebundne DNA og inkuber reaktionen i 5 minutter ved 30 °C med 800 rpm omrøring.</li>
			<li>Tilsæt Cdc6 ved en slutkoncentration på 50 nM og inkuber reaktionen i 5 minutter ved 30 °C med 800 omdrejninger pr. minut.</li>
			<li>Tilsæt Mcm2-7/Cdt1 (eller fluorescerende mærket Mcm2-7JF646-Halo-Mcm3/Cdt1) ved en slutkoncentration på 100 nM og inkuber reaktionen i 20 minutter ved 30 °C med 800 rpm omrøring.</li>
			<li>Der tilsættes DDK ved en slutkoncentration på 100 nM, og reaktionen inkuberes i 30 minutter ved 30 °C med 800 omdrejninger pr. minut.</li>
			<li>Fjern supernatanten og vask det perlebundne DNA (som nu indeholder phosphorylerede Mcm2-7 hexamerer) med 200 μL højsaltvask (HSW) buffer (25 mM HEPES-KOH pH 7,6, 300 mM KCl, 10 mM MgOAc, 0,02 % NP40-erstatning, 10 % glycerol, 1 mM DTT og 400 μg/ml BSA). Bland ved pipettering, og sørg for, at perlerne er helt opsuspenderet i bufferen, og at der ikke er synlige klumper.</li>
			<li>Fjern HSW-bufferen og vask perlerne én gang med 200 μL CMG-buffer (25 mM HEPES-KOH pH 7.6, 250 mM K glutamat, 10 mM MgOAc, 0.02% NP40-erstatning, 10% glycerol, 1 mM DTT og 400 μg/ml BSA).</li>
		</ol></li>
		<li>Montering og aktivering af fluorescerende mærket CMG<ol><li>CMG-bufferen fjernes, og de DNA-bundne perler ophænges igen i 50 μL CMG-buffer suppleret med 5 mM ATP.</li>
			<li>Tilføj 50 nM Dpb11, 200 nM GINS, 30 nM Polɛ, 20 nM S-CDK, 50 nM Cdc45LD555, 30 nM Sld3/7, 55 nM Sld2 og 10 nM Mcm10 til det perlebundne DNA. Til dette trin skal du blande alle proteinerne i et rør umiddelbart før du tilføjer dem til DNA'et og placere det på is. Tilsæt det resuspenderede perlebundne DNA til proteinblandingen. Inkuber reaktionen i 15 minutter ved 30 °C med 800 omdrejninger pr. minut.</li>
			<li>Vask perlerne 3x med 200 μL HSW-buffer. Vask perlerne én gang med 200 μL CMG-buffer.</li>
		</ol></li>
		<li>Eluering af intakte DNA:CMG-komplekser fra magnetiske perler (figur 1D)<ol><li>Fjern CMG-buffer og eluer DNA:CMG-komplekser fra de magnetiske perler ved at opløse de CMG-holdige DNA-bundne magnetiske perler i 200 μL elueringsbuffer (CMG-buffer suppleret med 10 mM biotin). Inkuber ved stuetemperatur i 1 time med 800 omdr./min. omrøring.</li>
			<li>Placer røret i et magnetisk stativ og lad perlerne samles i 5 min. Saml forsigtigt supernatanten (som nu indeholder de eluerede DNA:CMG-komplekser) uden at forstyrre de bundfældede perler og overfør den til et nyt rør.</li>
			<li>For at sikre, at der ikke er nogen perler tilbage i opløsningen (da magnetiske perler, der efterlades i opløsningen, kan forstyrre den optiske fangstdel af analysen), skal du placere den opsamlede supernatant igen i et magnetisk stativ og lade eventuelle resterende perler blive opsamlet i yderligere 5 minutter. Saml forsigtigt supernatanten og overfør den til et nyt rør.</li>
			<li>Tilsæt 1400 μL CMG-buffer til 200 μL supernatant. Prøven er nu klar til billeddannelse af et enkelt molekyle.</li>
		</ol></li>
	</ol></li>
	<li>Enkeltmolekylebilleddannelse af fuldt rekonstitueret CMG med korrelativ dobbeltstråle optisk pincet og konfokalmikroskopi (Figur 1E-G). BEMÆRK VENLIGST: Enkeltmolekyledelen af analysen udføres i en kommerciel opsætning, der kombinerer dobbeltstråle optisk pincet med konfokalmikroskopi og mikrofluidik45,46 (Figur 1E-G), men kan også udføres i en hjemmebygget opsætning. Den kommercielle opsætning, der bruges her, er udstyret med en mikrofluidisk flowcelle med fem indløb (henholdsvis kaldet kanal 1-5) og et udløb (Figur 1E). I nedenstående trin er alle knap- og/eller panelnavne specifikke for den software, der følger med denne kommercielle opsætning.<ol><li>Brug de fem indløb i den kommercielle opsætning som følger: Injicer kanal 1-3 fra venstre og brug dem til perlefangst (kanal 1), DNA-proteinkompleksbinding (kanal 2) og kontrol af tilstedeværelsen af CMG (kanal 3). Brug kanal 4 og 5 som proteinreservoirer og bufferudvekslingssteder. Før hvert eksperiment passiveres den mikrofluidiske flowcelle i mindst 30 minutter med 1 mg/ml bovint serumalbumin, efterfulgt af 0,5 % Pluronic F-127 opløst i ultrarent vand.<ol><li>Sørg for, at indholdet af hver kanal i hvert forsøg er som beskrevet (figur 1E): Kanal 1: Anti-digoxigenin-belagte polystyrenperler (2,06 μm diameter) fortyndet 1:50 i PBS; Kanal 2: DNA:CMG-komplekser elueret fra magnetiske perler; Kanal 3: Billeddannelsesbuffer (CMG-buffer suppleret med 2 mM 1,3,5,7 cyclooctatetraen, 2 mM 4-nitrobenzylalchohol og 2 mM Trolox); Kanal 4 og 5: Billedbuffer suppleret med 25 nM RPA, 10 nM Mcm10 og enten 5 mM ATP, 5 mM ATPγS eller intet nukleotid.</li>
		</ol></li>
		<li>Før eksperimentet skal du justere diffuseringslaserens effekt for at opnå en stivhed på 0,3 pN/nm i begge traps33,46 ved at klikke på knappen Re-calibrer i panelet Power Controls i softwaren. Indstil den konfokale pixelstørrelse til 50 x 50 nm, billedstørrelsen til 160 x 18 pixels, belysningstiden pr. pixel til 0.2 ms og billedhastigheden til 5 s i softwarens Image Scan-panel. Indstil temperaturkontrollen til 30 °C i temperaturpanelet. BEMÆRK VENLIGST: Derudover anbefaler vi at indstille den maksimale stage hastighed (bruges til at bevæge sig mellem kanaler) til 0.2 mm/s for at minimere CMG-dissociation fra DNA'et ved hjælp af trækkraften.</li>
		<li>Flow alle opløsninger ind i flowcellen ved et konstant tryk på 0,5 bar i injektionsporten (som kan indstilles i softwarens trykstangspanel). Sluk derefter for flowet i kanal 4 og 5. Efter først at have strømmet alle opløsninger, reduceres trykket til 0,2 bar.</li>
		<li>Flyt diffuseringslasere til kanal 1, indtil en perle er fanget i hver optisk fælde. Flyt fastklemte perler til kanal 2 ved at flytte joysticket, mens du trykker på aftrækkeren. Derefter fisker du et DNA:CMG-kompleks ved at flytte den højre perle mod og væk fra den venstre perle ved hjælp af joysticket uden at trykke på aftrækkeren, indtil en DNA-tether er fanget (hvilket er kendt ved at overvåge kraft-forlængelseskurven for det fangede DNA47 i FD Viewer-panelet i softwaren).<ol><li>For DNA-tethering skal du sørge for at indtaste DNA-længden og den korrekte temperaturværdi i referencemodelpanelet, som automatisk plotter en teoretisk udvidelig ormelignende kædemodel af DNA-konstruktionen i FD Viewer-panelet. Hvis et enkelt DNA-molekyle fanges mellem de to perler, bør DNA'ets kraftforlængelsesadfærd nøje matche den plottede strækbare ormelignende kædemodel. Sørg for, at dette er tilfældet ved at overvåge den eksperimentelle kraftforlængelseskurve, som softwaren automatisk plotter oven på den teoretiske. BEMÆRK: Afvigelser fra den teoretiske model kan indikere tilstedeværelsen af flere DNA-molekyler bundet mellem perlerne og/eller tilstedeværelsen af proteinaggregater bundet til DNA'et og komprimerer det. For at forhindre den kraftmedierede dissociation af proteiner fra DNA'et må du ikke overskride en spænding på 10 pN under denne indledende test.</li>
		</ol></li>
		<li>Flyt perlerne til kanal 3 og stop straks flowet i alle kanaler. Tag en one-frame testscanning i kanal 3 for at bekræfte tilstedeværelsen af CMG, der lyser med en 561 nm laser med en effekt på 4 μW målt ved objektivet. Juster billedlaserens styrker i panelet Excitation Lasers. Hvis den er til stede, vil CMG fremstå som todimensionelle diffraktionsbegrænsede pletter som vist i figur 1G og figur 2A.<ol><li>Hvis der ikke kan fanges DNA, skal du kontrollere kanal 2 for bobler, hvilket kan bremse flowet i kanal 2 (sammenlignet med kanal 1 og 3). Hvis der er bobler til stede, skal du øge trykket i kanal 2 til 1 bar for at forsøge at skylle boblerne igennem.</li>
		</ol></li>
		<li>Hvis CMG er til stede, skal du flytte DNA-tøjret til enten kanal 4 eller 5 til billeddannelse; Ellers skal du tænde for flowet igen, kassere perlerne og gå tilbage til trin 2.2.4.</li>
		<li>I kanal 4 eller 5 justeres afstanden mellem perlerne for at opnå en startspænding på 2 pN i DNA-tøjret. Indtast 2 pN i Force Spectroscopy-panelet og klik på knappen Aktiver for at starte en kraftklemme. Når den indledende spænding når 2 pN, skal du deaktivere kraftklemmen før billeddannelse ved at klikke på knappen Aktiver i panelet Kraftspektroskopi.</li>
		<li>Afbilde CMGCdc45-LD555 hver 5. sek. med en 561 nm laser med en effekt på 4 μW målt ved objektivet (figur 1F). For at gøre dette skal du klikke på knappen Start scanning i panelet Billedscanning. I sådanne scanninger vil CMG vise sig som todimensionelle diffraktionsbegrænsede pletter, som eksemplet i figur 1G.<ol><li>Hvis CMG observeres, men det ikke ser ud til at bevæge sig før blegning, skal du teste alle de proteiner, der bruges til nukleaseaktivitet, da hak på DNA'et vil få CMG til at dissociere fra DNA41, hvilket alvorligt reducerer dets tilsyneladende procesivitet. BEMÆRK VENLIGST: En lasereffekt på 4 μW bør give ensartede resultater, hvis du bruger det kommercielle mikroskop, der bruges her. Hvis du bruger en hjemmebygget opsætning, anbefaler vi at estimere den optimale lasereffekt empirisk. En optimal lasereffekt skal give nok signal fra fluoroforen til at lokalisere den med den ønskede præcision og en fluoroforlevetid tæt på det ønskede tidsinterval for eksperimentet. BEMÆRK: Selvom denne publikation fokuserer på hybridensemblet og enkeltmolekyleanalysen, har vi tidligere offentliggjort en omfattende beskrivelse af analysen af de data, der genereres med dette assay48.</li>
		</ol></li>
	</ol></li>
</ol>

Afbildning af bevægelsen af fuldt rekonstitueret Cdc45/MCM2-7/GINS (CMG)

Forfatterne har intet at afsløre.

Kritiske trin og vigtige kvalitetskontroller af reagenser De kritiske trin og kvalitetskontrol af biologiske reagenser i analysen er fremhævet her. For det første er renheden af de anvendte proteiner vigtig, fordi DNA-nedbrydning forårsaget af selv små nukleaseforurenende stoffer i proteinprøverne vil påvirke dataene negativt. Dette skyldes, at kun intakte (eller delvist hakkede) DNA-molekyler kan fanges i den dobbeltstrålede optiske pincet. Endnu vigtigere er det, at hak på DNA'et vil få CMG til at dissociere41, hvilket komplicerer observationen af CMG's langtrækkende bevægelse. Vi anbefaler kraftigt at teste hvert renset protein for nukleaseaktivitet, samt konstant overvåge integriteten af startplasmidsubstratet for at sikre, at hakking reduceres til et minimum. Det andet vigtige trin er den omhyggelige fjernelse af de magnetiske perler efter eluering af DNA:CMG-komplekser. Fjernelse af supernatant i dette trin skal udføres langsomt for ikke at forstyrre de indsamlede perler. Hvis der efterlades magnetiske perler i prøven, der flyves ind i den optiske pincet, vil de ofte ramme de optisk fangede polystyrenperler, hvilket får dem til at undslippe den optiske fælde og komplicere dataindsamlingen. Endelig skal DNA:CMG-komplekser håndteres forsigtigt i den optiske pincet. Til dette formål anbefaler vi ikke at øge spændingen af DNA'et over 10 pN, da påføring af kraft kan dissociere CMG fra DNA'et. Desuden bør flytning mellem kanaler i den mikrofluidiske flowcelle ske så langsomt som muligt (~ 0,2 mm/s) for at forhindre de resulterende trækkræfter i at dissociere CMG fra DNA'et.
Ændringer af metoden Der er flere trin i assayet, der kan ændres. For eksempel har vi vist, at elueringstiden kan reduceres fra 60 min til 30 min uden at påvirke elueringsudbyttet væsentligt. Derudover anbefaler vi at supplere elueringsbufferen med en lav (under 1 mM) koncentration af enten ATP eller ATPγS for at forhindre CMG i at diffundere fra DNA-enderne samt for generelt at stabilisere CMG28. Yderligere, selvom buffersammensætningerne og proteinkoncentrationerne, vi rapporterer her, er baseret på dem, der er anvendt i tidligere ensemble biokemisk og enkeltmolekylearbejde11,18, er det assay, vi beskriver, fuldt kompatibelt med andre protokoller til at samle CMG26,27. Derfor kan og bør ethvert biokemisk fremskridt, der rapporteres for at øge effektiviteten af CMG-samling eller -aktivering, implementeres i hoveddelen af analysen for at øge udbyttet. Endelig øger en forøgelse af tiden mellem billeder den samlede tid, hvor CMG kan afbildes, hvilket letter observationen af langtrækkende CMG-bevægelse før fluoroforblegning.
Metodens begrænsninger Den hybridmetode, vi beskriver, er begrænset, idet man kun kan afbilde CMG efter dens aktivering i bulk. Yderligere arbejde vil være nødvendigt for at observere aktiveringen af CMG i realtid. En anden vigtig begrænsning er, at mens vi forventer, at CMG samles i par 17,26,27, er det samlede antal CMG-komplekser pr. DNA, som vi observerer, for det meste en 28, hvilket tyder på, at CMG, eller i det mindste Cdc45, dissocierer fra DNA'et under håndteringen af de følsomme DNA:CMG-komplekser. Reduktion af antallet af håndteringstrin forud for enkeltmolekylebilleddannelsen samt udvikling af bedre passiveringsstrategier for plastrørene og glasset i den mikrofluidiske flowcelle er klar til at øge dette udbytte.
Metodens betydning Enkeltmolekylebevægelsesundersøgelser af CMG har hidtil anvendt præaktiveret CMG oprenset som et kompleks fra celler. Selvom den er relativt enklere, er denne præaktiverede CMG-tilgang begrænset, idet den går glip af nogen af de trin, der fører op til CMG-aktivering, såvel som den tovejs karakter af CMG og replisombevægelse. På den anden side har den fulde rekonstitution af CMG-samling og aktivering potentialet til at studere eventuelle præaktiveringstrin samt til at studere CMG-bevægelse på en tovejs måde. Ikke desto mindre er denne tilgang sværere at oversætte fra det biokemiske niveau til enkeltmolekyleniveauet, da det involverer meget mere oprensede proteinfaktorer og trin. Det assay, vi beskriver her, har hjulpet med at overvinde disse udfordringer ved at give os mulighed for at afbilde bevægelsen af fuldt rekonstitueret CMG på enkeltmolekyleniveau, hvilket giver os adgang til nogle tidligere oversete præaktiveringsdynamikker28. Derudover, selvom vi for det meste ser en CMG pr. DNA, var vi i stand til at observere flere tilfælde af to CMG-komplekser, der bevæger sig i modsatte retninger, og vi kunne endda fange den indledende adskillelse af søster-CMG'er fra hinanden28, hvilket gav en vis indsigt i etableringen af tovejsreplikation.
En anden fordel ved dette assay sammenlignet med tidligere CMG-bevægelse ligger i den fuldt dobbeltstrengede karakter af det DNA-substrat, vi anvender (figur 1A). I tidligere præaktiveret CMG-arbejde er den mest almindelige måde at binde CMG til DNA-substratet på gennem en 3' ssDNA-klap. Dette resulterer i en DNA-konstruktion, der ikke let kan vrides og dermed forbyder undersøgelsen af supercoilingens rolle i replisomprogression. Omvendt kan den nye tilgang, vi beskriver her, have potentiale til at blive tilpasset til at studere drejningsmomentets rolle i denne proces, da det anvendte DNA-substrat er fuldstændig dobbeltstrenget.
Bredere anvendelser af metoden Den beskrevne hybridanalyse vil bane vejen for den fulde rekonstituering af et komplet eukaryot replisom, hvilket giver os og andre mulighed for at observere og kvantificere de vigtige dynamikker, der gør det muligt for replisomet at lykkes med alle sine forskellige opgaver. Bortset fra DNA-replikation repræsenterer det analyse, vi rapporterer, et vigtigt fremskridt i at oversætte en kompliceret biokemisk reaktion fra bulk-biokemikaliet til enkeltmolekyleniveauet. Vi forventer, at dette assay let kan modificeres til at studere lignende komplekse DNA:protein-interaktioner involveret i forskellige DNA-behandlingsmekanismer.

DNA-replikation i eukaryoter udføres af et dynamisk proteinkompleks kendt som replisomet1. En nøglekomponent i dette kompleks er den eukaryote replikative helikase Cdc45/Mcm2-7/GINS (CMG), som driver og centralt organiserer replisomet og fører an foran replikationsgafler 1,2. At opnå en dyb kvantitativ forståelse af dynamikken i CMG er derfor afgørende for at forstå dynamikken i replisomet. En sådan forståelse kan opnås med enkeltmolekyleteknikker, som er unikt egnede til at studere molekylære motorer, såsom CMG, på grund af deres uovertrufne rumlige og tidsmæssige opløsning og kan give os en uovertruffen kvantitativ forståelse af deres funktion, stokasticitet og dynamik 2,3,4,5,6,7,8,9.
In vivo indlæses og aktiveres CMG på en tidsmæssigt adskilt måde for at sikre, at replikation kun sker én gang pr. cellecyklus 1,10,11. For det første, i G1-fasen af cellecyklussen, indlæser et sæt proteiner kendt som belastningsfaktorer den første komponent af CMG, Mcm2-7 hexamerkomplekset, på dsDNA 12,13,14,15,16 i form af dobbelte hexamerer med en head-to-head konfiguration 15,17,18 . I det specifikke tilfælde af gær sker denne indledende proces ved specifikke DNA-sekvenser kendt som replikationsoprindelse1. Selvom Mcm2-7 er den motoriske kerne i den replikative helikase, er den i sig selv ikke i stand til at afvikle DNA19 uden de to helikaseaktiverende faktorer Cdc45 og GINS, som skal rekrutteres til den belastede Mcm2-7 for at give anledning til fuldt aktiv CMG 11,19,20,21. Processen med helikaseaktivering finder sted i S-fasen af cellecyklussen og starter med den selektive phosphorylering af Mcm2-7 dobbelthexamorer af den cellecyklusregulerede kinase DDK 22,23,24. Disse phosphoryleringsbegivenheder letter rekrutteringen af Cdc45 og GINS til Mcm2-7 dobbelthexamerne 10,22,23,24,25,26 ved hjælp af et andet sæt proteiner kendt som affyringsfaktorer 10,11,26 . Bindingen af Cdc45 og GINS giver anledning til to søster-CMG-helikaser, som oprindeligt omslutter begge strenge af forældre-DNA og stadig er placeret i en head-to-head konfiguration11,27. I det sidste aktiveringstrin katalyserer affyringsfaktoren Mcm10 den ATP-hydrolyseafhængige ekstrudering af en DNA-streng fra hver søster CMG11. Efter strengekstrudering omgår og adskilles søster-CMG-helikaser fra hinanden ved at translokere langs ssDNA på en ATP-hydrolyseafhængig måde 11,20,21,28, afvikle DNA ved sterisk at udelukke ikke-translokationsstrengen 29. Hele denne proces er blevet fuldt rekonstitueret in vitro fra et minimalt sæt af 36 oprensede S. cerevisiae polypeptider10,11.
På trods af den udsøgte in vivo-regulering af CMG-samling og aktivering beskrevet ovenfor, har in vitro-rekonstituerede enkeltmolekylebevægelsesundersøgelser af CMG 2,30,31,32,33,34 hidtil været afhængige af præaktiveret CMG oprenset som et kompleks fra celler 20,21, der mangler alle trinene før dens aktivering og den tovejs karakter af dens bevægelse. Denne præaktiverede CMG-tilgang har været guldstandarden inden for enkeltmolekyleområdet, delvist på grund af den biokemiske kompleksitet af den fuldt rekonstituerede CMG-samlingsreaktion10,11. Denne biokemiske reaktion har været udfordrende at oversætte fra det biokemiske niveau til enkeltmolekyleniveauet af flere årsager. For det første, for at maksimere reaktionseffektiviteten, kræves de belastnings- og affyringsfaktorer, der er nødvendige for CMG-samling og aktivering ved koncentrationer i området 10-200 nM 10,11,27. Disse koncentrationsintervaller svarer til den høje ende af, hvad de fleste enkeltmolekyleteknikker kan tolerere, især når der anvendes fluorescerende mærkede komponenter35. Endelig har CMG udviklet sig til at krydse gennem tusindvis af basepar i en celle 36,37,38,39. For at studere dens bevægelse på en biologisk relevant rumlig skala kræver man derfor lange DNA-substrater (typisk af længder i størrelsesordenen titusinder af kilobaser)30,31,34,40,41,42. Anvendelsen af så lange DNA-substrater udgør den yderligere udfordring, at jo længere DNA-substratet er, jo flere potentielle uspecifikke bindingssteder for proteiner og proteinaggregater har det. I tilfældet med CMG er sidstnævnte punkt særligt vigtigt, da flere af de belastnings- og affyringsfaktorer, der er involveret i CMG-samling og aktivering, indeholder iboende uordnede regioner43 og er tilbøjelige til aggregering.
Her rapporterer vi et hybridensemble og enkeltmolekyleassay, der tillod observation og kvantificering af bevægelsen af CMG efter fuldstændig rekonstituering af dens samling og aktivering fra 36 oprensede S. cerevisiae-polypeptider 28. Dette assay er afhængig af den dobbelte funktionalisering af begge ender af et DNA-substrat med to ortogonale vedhæftningsdele: desthiobiotin og digoxigenin2 (figur 1A). Den første del, desthiobiotin, bruges til reversibelt at binde DNA-substratet til streptavidin-belagte magnetiske perler44 (figur 1B). Herefter samles fluorescerende mærket CMG og aktiveres på det perlebundne DNA, og et magnetisk stativ bruges til at rense og vaske de resulterende magnetiske perlebundne DNA:CMG-komplekser (figur 1C). Derved fjernes det overskydende protein, der ellers ville aggregere på DNA-substratet; dette giver praktisk talt aggregeringsfrie DNA:CMG-komplekser. Intakte komplekser elueres derefter fra de magnetiske perler ved tilsætning af et molært overskud af frit biotin, som kan udkonkurrere desthiobiotin-streptavidin-interaktionen (figur 1D). Individuelle DNA:CMG-komplekser bindes derefter mellem to optisk fangede polystyrenperler belagt med anti-digoxigenin-antistof (anti-Dig); til dette trin anvendes den anden del af DNA'et, digoxigenin, da den kan binde sig til anti-Dig selv i en bufferopløsning, der indeholder et overskud af frit biotin (figur 1E). Når DNA:CMG-komplekset holdes på plads i den optiske fælde, afbildes bevægelsen af fluorescerende mærket CMG med en konfokal scanningslaser (figur 1F). Vi forventer, at dette assay let kan tilpasses til undersøgelsen på enkeltmolekyleniveau af lignende komplekse DNA:protein-interaktioner.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>AflII&#160;</td>
			<td>NEB</td>
			<td>R0520L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-digoxigenin coated polystyrene beads&#160;</td>
			<td>Spheroteck</td>
			<td>DIGP-20-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ATP solution</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>R0441</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ATP&#947;S</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11162306001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA</td>
			<td>NEB</td>
			<td>B9000S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C-Trap</td>
			<td>Lumicks</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CutSmart Buffer</td>
			<td>NEB</td>
			<td>B6004S</td>
			<td>Provided with AflII</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dCTP</td>
			<td>Promega</td>
			<td>U122B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-Desthiobiotin-7-dATP</td>
			<td>Jena Bioscience&#160;</td>
			<td>NU-835-Desthiobio</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dGTP</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>10218014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Digoxigenin-11-dUTP</td>
			<td>Jena Bioscience</td>
			<td>NU-803-DIGXL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dynabeads M-280 Streptavidin magnetic beads</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>11205D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Klenow Fragment (3&#39;&#8594;5&#39; exo-)&#160;</td>
			<td>NEB</td>
			<td>M0212L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microspin S-400 HR spin columns&#160;</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>GE27-5140-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NEBuffer2</td>
			<td>NEB</td>
			<td>B7002S</td>
			<td>Provided with Klenow Fragment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nonidet&#160;P 40 Substitute</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>74385</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pluronic F-127&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P2443</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

hybrid ensemble and single-molecule assay to image the motion of fully reconstituted cmg

Eukaryoter har en replikativ helikase kendt som CMG, som centralt organiserer og driver replisomet og fører an foran replikationsgafler. At opnå en dyb mekanistisk forståelse af dynamikken i CMG er afgørende for at belyse, hvordan celler opnår den enorme opgave med effektivt og præcist at replikere hele deres genom én gang pr. cellecyklus. Enkeltmolekyleteknikker er unikt velegnede til at kvantificere dynamikken i CMG på grund af deres uovertrufne tidsmæssige og rumlige opløsning. Ikke desto mindre har enkeltmolekyleundersøgelser af CMG-bevægelse hidtil været afhængige af præformet CMG renset fra celler som et kompleks, hvilket udelukker undersøgelsen af de trin, der fører op til dets aktivering. Her beskriver vi et hybridensemble og enkeltmolekyleassay, der tillod billeddannelse på enkeltmolekyleniveau af bevægelsen af fluorescerende mærket CMG efter fuld rekonstituering af dets samling og aktivering fra 36 forskellige oprensede S. cerevisiae-polypeptider . Dette assay er afhængig af den dobbelte funktionalisering af enderne af et lineært DNA-substrat med to ortogonale vedhæftningsdele og kan tilpasses til at studere lignende komplekse DNA-behandlingsmekanismer på enkeltmolekyleniveau.

DNA replication in eukaryotes is carried out by a dynamic protein complex known as the replisome1. A key component of this complex is the eukaryotic replicative helicase Cdc45/Mcm2-7/GINS (CMG), which drives and centrally organizes the replisome, leading the way at the front of replication forks1,2. Obtaining a deep quantitative understanding of the dynamics of CMG is therefore critical to understanding the dynamics of the replisome. Such an understanding could be acquired with single-molecule techniques, which are uniquely suited to study molecular motors, such as CMG, due to their unmatched spatial and temporal resolution, and can provide us with an unparalleled quantitative understanding of their function, stochasticity, and dynamics2,3,4,5,6,7,8,9.
In vivo, CMG is loaded and activated in temporally separated fashion to ensure that replication occurs only once per cell cycle1,10,11. First, in the G1 phase of the cell cycle, a set of proteins known as loading factors loads the first component of CMG, the Mcm2-7 hexameric complex, onto dsDNA12,13,14,15,16 in the form of double hexamers with&#160;a head-to-head configuration15,17,18. In the specific case of yeast, this initial process occurs at specific DNA sequences known as origins of replication1. Although Mcm2-7 is the motor core of the replicative helicase, it is by itself unable to unwind DNA19 without the two helicase-activating factors Cdc45 and GINS, which need to be recruited to the loaded Mcm2-7 to give rise to fully active CMG11,19,20,21. The process of helicase activation takes place in the S&#160;phase of the cell cycle and starts with the selective phosphorylation of Mcm2-7 double hexamers by the cell cycle-regulated kinase DDK22,23,24. These phosphorylation events facilitate the recruitment of Cdc45 and GINS to the Mcm2-7 double hexamers10,22,23,24,25,26 by a second set of proteins known as firing factors10,11,26. The binding of Cdc45 and GINS gives rise to two sister CMG helicases, which initially enclose both strands of the parental DNA and are still located in a head-to-head configuration11,27. In the final activation step, the firing factor Mcm10 catalyzes the ATP hydrolysis-dependent extrusion of one DNA strand from each sister CMG11. After strand extrusion, sister CMG helicases bypass and separate from each other by translocating along ssDNA in an ATP hydrolysis-dependent manner11,20,21,28, unwinding DNA by sterically excluding the non-translocation strand29. This entire process has been fully reconstituted in vitro from a minimal set of 36 purified S. cerevisiae polypeptides10,11.
Despite the exquisite in vivo regulation of CMG assembly and activation described above, in vitro reconstituted single-molecule motion studies of CMG2,30,31,32,33,34 have thus far relied on pre-activated CMG purified as a complex from cells20,21, missing all the steps prior to its activation and the bidirectional nature of its motion. This pre-activated CMG approach has been the gold standard in the single-molecule field partly due to the biochemical complexity of the fully reconstituted CMG assembly reaction10,11. This biochemical reaction has been challenging to translate from the bulk biochemical level to the single-molecule level for several reasons. First, to maximize reaction efficiencies, the loading and firing factors needed for CMG assembly and activation are required at concentrations in the range of 10-200 nM10,11,27. These ranges of concentration correspond to the high end of what most single-molecule techniques can tolerate, especially when using fluorescently labeled components35. Finally, CMG has evolved to cruise through thousands of base pairs in a cell36,37,38,39. Therefore, to study its motion at a biologically relevant spatial scale, one requires long DNA substrates (typically of lengths in the order of tens of kilobases)30,31,34,40,41,42. Employing such long DNA substrates poses the additional challenge that the longer the DNA substrate is, the more potential non-specific binding sites for proteins and protein aggregates it has. In the case of CMG, the latter point is particularly important, as several of the loading and firing factors involved in CMG assembly and activation contain intrinsically disordered regions43 and are aggregation-prone.
Here, we report a hybrid ensemble and single-molecule assay that allowed the observation and quantification of the motion of CMG after fully reconstituting its assembly and activation from 36 purified S. cerevisiae polypeptides28. This assay relies on the double functionalization of both ends of a DNA substrate with two orthogonal attachment moieties: desthiobiotin and digoxigenin2 (Figure 1A). The first moiety, desthiobiotin, is used to reversibly bind the DNA substrate to streptavidin-coated magnetic beads44 (Figure 1B). Following this, fluorescently labeled CMG is assembled and activated onto the bead-bound DNA, and a magnetic rack is used to purify and wash the resulting magnetic bead-bound DNA:CMG complexes (Figure 1C). In doing so, the excess protein that would otherwise aggregate on the DNA substrate is removed; this provides virtually aggregation-free DNA:CMG complexes. Intact complexes are then eluted from the magnetic beads by the addition of a molar excess of free biotin, which can outcompete the desthiobiotin-streptavidin interaction (Figure 1D). Individual DNA:CMG complexes are then bound between two optically trapped polystyrene beads coated with anti-digoxigenin antibody (anti-Dig); for this step, the second moiety on the DNA, digoxigenin, is used as it can bind to anti-Dig even in a buffer solution containing an excess of free biotin (Figure 1E). Once the DNA:CMG complex is held in place in the optical trap, the motion of fluorescently labeled CMG is imaged with a confocal scanning laser (Figure 1F). We anticipate that this assay can be easily adapted for the study at the single-molecule level of similarly complex DNA:protein interactions.

Forfatter Spotlight: Undersøgelse af bevægelsesdynamikken af de eukaryote replisomkomponenter på enkeltmolekyleniveau

Hybrid Ensemble og enkeltmolekyleanalyse til at afbilde bevægelsen af fuldt rekonstitueret CMG

We study the motion dynamics of different components of the eukaryotic replisome at the single molecule level. In order to obtain a deep quantitative understanding of how cells can duplicate their entire genomes, every cell cycle. In a breakthrough in 2015, eukaryotic DNA replication was fully reconstituted in vitro from purified protein components.And this gave us a lot of control over the system. And since then, it's been used extensively to answer questions about different stages of DNA replication with increasing temporal and spatial resolution. And this was done using complementary approaches such as cryo EM and single molecule biophysics.In the single molecule field, one of the biggest challenges with this system is the number of proteins involved and also the concentrations at which these components are required in order to maximize the efficiency of the overall reaction because this can complicate the single molecule imaging. The protocol described here introduces a hybrid approach in which a protein complex is first assembled in an efficient manner using ensemble biochemistry before then being introduced and studied in a single molecule setting. This avoids the introduction of two high protein concentrations at the single molecule level.We illustrate this approach for studying the behavior of the replicative helicase CMG on DNA at the single molecule level following its assembly via the origin based pathway. But this approach can also be used to study the dynamics of many other types of DNA binding protein complexes.

Når den udføres korrekt, skal den her beskrevne protokol give praktisk talt aggregatfrie DNA:CMG-komplekser. En aggregeringsfri reaktion bør ikke tilstoppe nogen af kanalerne i den mikrofluidiske flowcelle, og det bør være muligt at strække de fangede DNA-molekyler til en ende-til-ende-forlængelse inden for 10 % af dens konturlængde uden at bryde DNA'et. Omvendt, hvis der er aggregering i reaktionen, kan DNA-molekyler nogle gange blive komprimeret af aggregaterne, hvilket ofte forårsager DNA-brud, hvis de strækkes. En god måde at genkende proteinaggregater på er ved at se på 2D-scanninger af DNA'et. I en aggregeringsfri reaktion fremstår CMG som diskrete, symmetriske diffraktionsbegrænsede pletter, der sparsomt trænger DNA'et, såsom dem i scanningerne vist i figur 2A. Tværtimod er aggregater mindre diskrete, nogle gange asymmetriske klatter, der trænger sig sammen i en større længde af DNA'et, som dem i scanningerne vist i figur 2B. Desuden, hvis analysen udføres med succes, og høj renhed af de rensede proteiner opnås, vil langtrækkende bevægelse af CMG i nærvær af ATP blive set, som observeret i kymografen vist i figur 2C.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67076/67076fig01v2.jpg"> Figur 1: Billedbeskrivelse af hybrid ensemble- og enkeltmolekyleanalyse for at afbilde og kvantificere bevægelsen af fuldt rekonstitueret CMG. (A) Et 23,6 kb lineært DNA, der indeholder en naturligt forekommende ARS1-replikationsoprindelse, er dobbelt funktionaliseret i begge ender med desthiobiotin- og digoxigenin-dele. (B) Dobbelt funktionaliseret DNA er bundet til streptavidin-belagte magnetiske perler gennem dets desthiobiotin-dele. (C) CMG samles trinvis og aktiveres på det magnetiske perlebundne DNA med forskellige vasketrin inkluderet for at fjerne overskydende ubundne protein- og proteinaggregater. (D) Intakte DNA:CMG-komplekser elueres derefter fra de magnetiske perler ved tilsætning af et overskud af frit biotin, som udkonkurrerer desthiobiotin-streptavidin-interaktionen. (E) Individuelle DNA:CMG-komplekser er bundet mellem to anti-digoxigenin-belagte optisk fangede polystyrenperler ved hjælp af en mikrofluidisk flowcelle. Bemærk, at Dig-anti-Dig-interaktionen er ortogonal til biotin-avidin-interaktioner, så den påvirkes ikke af tilstedeværelsen af frit biotin. (F) Når DNA:CMG-komplekser holdes på plads af den optiske pincet, overføres de til forskellige bufferforhold, hvor DNA-planet derefter scannes med en konfokal scanningslaser for at afbilde bevægelsen af CMG langs DNA'et over tid. (G) Det øverste panel viser et diagram af et DNA:CMG-kompleks, der holdes på plads mellem to optisk fangede anti-Dig-belagte polystyrenperler, der scannes af en konfokal scanningslaser. Det nederste panel viser et eksempel på en 2D-scanning af CMG bundet til et DNA, der holdes på plads med en optisk fælde. DNA'et er umærket i disse eksperimenter, men det kan opfattes som en vandret linje, der løber gennem midten af billedet. Dette tal er ændret fra28. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67076/67076fig01largev2.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af denne figur.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67076/67076fig02.jpg"> Figur 2: Eksempler på data fra et vellykket og et mislykket eksperiment. (A) Eksempel 2D-scanninger af et CMG-holdigt DNA i en aggregeringsfri prøve. I begge scanninger viser CMG symmetriske og diskrete diffraktionsbegrænsede pletter sparsomt fordelt langs DNA'et. (B) Eksempel 2D-scanninger af et CMG-holdigt DNA i en prøve indeholdende aggregater. I begge scanninger danner CMG mindre symmetriske klatter, der trænger sig sammen med DNA'et. (C) Kymograf, der viser positionen på DNA'et af CMG-diffraktionsbegrænsede pletter over tid i nærvær af ATP, der viser CMG-kompleksernes langtrækkende bevægelse. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67076/67076fig02large.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af denne figur.</a>

Vi rapporterer et hybridensemble og enkeltmolekyleassay til direkte at afbilde og kvantificere bevægelsen af fluorescerende mærket, fuldt rekonstitueret Cdc45/Mcm2-7/GINS (CMG) helikase på lineære DNA-molekyler holdt på plads i en optisk fælde.

Eukaryotes have one replicative helicase known as CMG, which centrally organizes and drives the replisome, and leads the way at the front of replication ...

hybrid-ensemble-single-molecule-assay-to-image-motion-fully

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Hybrid Ensemble and Single-molecule Assay to Image the Motion of Fully Reconstituted CMG

367 Views.  Delft University of Technology. We study the motion dynamics of different components of the eukaryotic replisome at the single molecule level. In order to obtain a deep quantitative understanding of how cells can duplicate their entire genomes, every cell cycle. In a breakthrough in 2015, eukaryotic DNA replication was fully reconstituted in vitro from purified protein components.And this gave us a lot of control over the system. And since then, it's been used extensively to answer questions about different stages of...