Vi studerer bevegelsesdynamikken til forskjellige komponenter i det eukaryote replisomet på enkeltmolekylnivå. For å få en dyp kvantitativ forståelse av hvordan celler kan duplisere hele genomene sine, hver cellesyklus. I et gjennombrudd i 2015 ble eukaryot DNA-replikasjon fullstendig rekonstituert in vitro fra rensede proteinkomponenter.
Og dette ga oss mye kontroll over systemet. Og siden den gang har den blitt brukt mye for å svare på spørsmål om ulike stadier av DNA-replikasjon med økende tidsmessig og romlig oppløsning. Og dette ble gjort ved hjelp av komplementære tilnærminger som kryo-EM og enkeltmolekylbiofysikk.
I enkeltmolekylfeltet er en av de største utfordringene med dette systemet antall proteiner involvert og også konsentrasjonene som disse komponentene er nødvendige ved for å maksimere effektiviteten til den totale reaksjonen fordi dette kan komplisere enkeltmolekylavbildningen. Protokollen beskrevet her introduserer en hybrid tilnærming der et proteinkompleks først settes sammen på en effektiv måte ved hjelp av ensemblebiokjemi før det deretter introduseres og studeres i en enkelt molekylsetting. Dette unngår introduksjon av to høye proteinkonsentrasjoner på enkeltmolekylnivå.
Vi illustrerer denne tilnærmingen for å studere oppførselen til den replikative helikase CMG på DNA på enkeltmolekylnivå etter montering via den opprinnelsesbaserte veien. Men denne tilnærmingen kan også brukes til å studere dynamikken til mange andre typer DNA-bindende proteinkomplekser.