Forfatterne takker Anne Early, Lucy Drury og Max Douglas for å gi gjærstammer for overekspresjon av umerkede proteiner, samt ND-laboratoriemedlemmene Anuj Kumar, Katinka Ligthart og Julien Gros for deres hjelp til å rense lastefaktorer og DDK. Forfatterne takker også Kaley McCluskey, Dorian Mikolajczak, Joseph Yeeles, Jacob Lewis, Alessandro Costa, Hasan Yardimci og Taekjip Ha for nyttige vitenskapelige diskusjoner. D.R.M. anerkjenner finansiering fra et Boehringer Ingelheim Fonds PhD Fellowship.  N.D. anerkjenner finansiering fra den nederlandske organisasjonen for vitenskapelig forskning (NWO) gjennom toppbevilgning 714.017.002 og fra Det europeiske forskningsrådet gjennom et avansert stipend (REPLICHROMA; tilskuddsnummer 789267).

1. Syntese av dobbelt funksjonalisert lineært DNA-substrat og binding til magnetiske perler
<ol><li>Dobbel funksjonalisering av DNA-substrat med destiobiotin- og digoksigenindeler<ol><li>Linearisere 20 μg 23,6 kb plasmid pGL50-ARS1 (som inneholder en naturlig ARS1-opprinnelse til replikasjon, klonet internt og tilgjengelig på forespørsel) med 200 enheter restriksjonsenzym AflII i 16 timer ved 37 °C i et sluttvolum på 200 μL 1x buffer (50 mM kaliumacetat, 20 mM Tris-acetat, 10 mM magnesiumacetat, 100 μg/ml BSA, pH 7,9). NOTAT: Dette trinnet kan reduseres til 4 timer uten å redusere utbyttet, hvis det er mer praktisk.</li>
		<li>Inaktiver AflII ved å inkubere reaksjonen ved 65 °C i 20 minutter. Sløv de resulterende 4-nukleotid TTAA-overhengene ved å supplere 200 μL lineariseringsreaksjonen med 60 enheter Klenow Fragment (3' til 5' exo-) polymerase, 17 μL 10x buffer (500 mM NaCl, 100 mM Tris-HCl, 100 mM MgCl2, 10 mM DTT, pH 7,9), 33 μM D-Desthiobiotin-7-dATP, 33 μM Digoxigenin-11-dUTP, 33 μM dCTP, 33 μM dGTP, og ultrarent vann til et sluttvolum på 370 μM. Inkuber reaksjonen ved 37 °C i 30 minutter. MERK: I dette trinnet sløver Klenow-fragmentet overhengene i begge ender av det lineariserte DNAet ved å inkorporere to D-Desthiobiotin-7-dATP og to Digoxigenin-11-dUTP-nukleotider i hver ende.</li>
		<li>Suppler reaksjonen med 10 mM EDTA og inaktiver Klenow-fragmentet ved å inkubere reaksjonen ved 75 °C i 20 minutter. Ta reaksjonsvolumet til 400 μL med ultrarent vann.</li>
		<li>Ta fire S-400 spinnkolonner, virvel dem i minst 30 s for å suspendere harpiksen på nytt, og sentrifuger dem deretter i 1 minutt ved 735 x g for å fjerne lagringsbufferen. Overfør søylene til rene 1,5 ml rør.</li>
		<li>Tilsett umiddelbart 100 μL av DNA-løsningen til hver kolonne og sentrifuger dem i 2 minutter ved 735 x g. DNA-et er nå i gjennomstrømningen, og kolonnene kan kastes.</li>
		<li>Slå sammen gjennomstrømningen av de fire kolonnene, mål volumet med en pipette og mål DNA-konsentrasjonen med et spektrofotometer. Dette vil bli brukt til å beregne mengden DNA bundet til perlene.</li>
	</ol></li>
	<li>Binding av dobbelt funksjonalisert lineært DNA til streptavidinbelagte magnetiske perler<ol><li>Vortex M-280 streptavidin-belagte magnetiske perler i 30 s for å suspendere dem på nytt.</li>
		<li>Overfør 4 mg resuspenderte M-280 streptavidin-belagte magnetiske perler til et rent 1,5 ml rør. Plasser røret i et magnetisk stativ, vent 1 minutt til perlene skal samles opp, og fjern oppbevaringsbufferen.</li>
		<li>Tilsett 1 ml 1x buffer A (5 mM Tris-HCl pH 7,5, 0,5 mM EDTA og 1 M NaCl) til perlene og suspender på nytt ved virvling i 5 s. Inkuber perlene ved romtemperatur i 5 min. MERK: Alle buffere skal være sterilt filtrert. Lag et stort volum av 2x buffer A, 1x buffer B (se nedenfor) og 1x buffer C (se nedenfor) på forhånd for å spare tid (anbefalt). Disse bufferne er de som er anbefalt av produsenten av magnetperlene og kan lagres ved -20 °C.</li>
		<li>Plasser røret i en magnetisk holder, vent 1 minutt til perlene er samlet, og fjern buffer A.</li>
		<li>Resuspender perlene i 400 μL 2x buffer A ved pipettering, og tilsett deretter 400 μL funksjonalisert DNA-løsning (merk at dette fortynner 2x buffer A til en endelig konsentrasjon på 1x, som er optimal for DNA-binding til perlene). Bland forsiktig ved pipettering.</li>
		<li>Inkuber perle/DNA-blandingen over natten ved 4 °C med ende-over-ende-rotasjon for å la det funksjonaliserte DNA-et binde seg til perlene.</li>
		<li>Bruk det magnetiske stativet til å fjerne supernatanten (ikke kast før du måler volumet med en pipette og konsentrasjonen av ubundet DNA med et spektrofotometer) og vask perlene 2x med 500 μL buffer B (10 mM HEPES-KOH pH 7.6, 1 mM EDTA og 1 M KOAc) for å fjerne ikke-spesifikt bundet DNA. Vask perlene 2x med 500 μL buffer C (10 mM HEPES-KOH pH 7,6 og 1 mM EDTA), som er lagringsbufferen anbefalt av produsenten.<ol><li>Beregn den totale mengden DNA bundet til de magnetiske perlene ved å sammenligne den totale mengden DNA som er tilsatt perlene med mengden DNA som er igjen i supernatanten. Utbyttet bør være i området 2,3-2,9 mg DNA (~150-190 fmol) per mg magnetiske perler. Hvis lavere utbytte oppnås, må du kontrollere at S400-kolonnene ikke er tørre før du bruker dem. Overvåk kontinuerlig DNA-integriteten ved gelelektroforese for å sikre at det opprinnelige plasmid-DNA-substratet ikke brytes ned.</li>
		</ol></li>
		<li>Resuspender perlene i 300 μL buffer C og oppbevar ved 4 °C. For å forhindre hakking, lag 4 engangsalikvoter av 1 mg magnetiske perler, og ikke oppbevar DNA i mer enn 2 uker.</li>
	</ol></li>
</ol>2. Hybrid ensemble- og enkeltmolekylanalyse for å avbilde og kvantifisere bevegelsen til fullstendig rekonstituert CMG med korrelativ tostråle optisk pinsett og konfokalmikroskopi
<ol><li>Ensemblemontering og aktivering av fluorescerende merket CMG på magnetisk perlebundet DNA (Figur 1C). NOTAT: CMG-montering og aktiveringsreaksjoner ble utført i to trinn: Mcm2-7 lasting og fosforylering, og CMG-montering og aktivering. Med mindre annet er spesifisert, ble alle bufferbyttetrinn utført ved hjelp av et magnetisk stativ ved å la perlene samles opp av magneten i 1 minutt og deretter fjerne supernatanten. Alle inkubasjoner ble utført i en temperaturkontrollert varmeblokk med lokk for å forhindre fotobleking av fluorescerende proteiner. Hvis et lokk ikke er tilgjengelig, bør rørene dekkes med tinnfolie. Rensing og fluorescerende merking av alle proteinene som brukes i denne protokollen er utført som tidligere beskrevet10,11,28.<ol style="margin-left: 40px;"><li>Mcm2-7 lasting og fosforylering<ol><li>Ta 1 mg DNA-bundne streptavidinbelagte magnetperler og fjern lagringsbufferen (buffer C).</li>
			<li>Vask perlene med 200 μL belastningsbuffer (25 mM HEPES-KOH pH 7,6, 100 mM K glutamat, 10 mM MgOAc, 0,02 % NP40-erstatning, 10 % glyserol, 2 mM DTT, 100 μg/ml BSA og 5 mM ATP).</li>
			<li>Fjern lastebufferen og heng perlene på nytt i 75 μL lastebuffer. Bland forsiktig ved pipettering.</li>
			<li>Tilsett ORC ved en endelig konsentrasjon på 37,5 nM til det perlebundne DNA-et og inkuber reaksjonen i 5 minutter ved 30 °C med 800 rpm omrøring.</li>
			<li>Tilsett Cdc6 ved en sluttkonsentrasjon på 50 nM og inkuber reaksjonen i 5 minutter ved 30 °C med 800 rpm omrøring.</li>
			<li>Tilsett Mcm2-7/Cdt1 (eller fluorescerende merket Mcm2-7JF646-Halo-Mcm3/Cdt1) ved en endelig konsentrasjon på 100 nM og inkuber reaksjonen i 20 minutter ved 30 °C med 800 rpm omrøring.</li>
			<li>Tilsett DDK ved en endelig konsentrasjon på 100 nM og inkuber reaksjonen i 30 minutter ved 30 °C med 800 rpm omrøring.</li>
			<li>Fjern supernatanten og vask det perlebundne DNA-et (som nå inneholder fosforylerte Mcm2-7 hexamere) med 200 μL høysaltvask (HSW) buffer (25 mM HEPES-KOH pH 7,6, 300 mM KCl, 10 mM MgOAc, 0,02 % NP40-erstatning, 10 % glyserol, 1 mM DTT og 400 μg/ml BSA). Bland ved pipettering, og sørg for at perlene er helt resuspendert i bufferen, og at ingen klumper er synlige.</li>
			<li>Fjern HSW-bufferen og vask perlene én gang med 200 μL CMG-buffer (25 mM HEPES-KOH pH 7,6, 250 mM K glutamat, 10 mM MgOAc, 0,02 % NP40-erstatning, 10 % glyserol, 1 mM DTT og 400 μg/ml BSA).</li>
		</ol></li>
		<li>Montering og aktivering av fluorescerende merket CMG<ol><li>Fjern CMG-bufferen og resuspender de DNA-bundne perlene i 50 μL CMG-buffer supplert med 5 mM ATP.</li>
			<li>Legg til 50 nM Dpb11, 200 nM GINS, 30 nM Polɛ, 20 nM S-CDK, 50 nM Cdc45LD555, 30 nM Sld3/7, 55 nM Sld2 og 10 nM Mcm10 til det perlebundne DNA. For dette trinnet, bland alle proteinene i ett rør rett før du legger dem til DNA og legg det på is. Tilsett det resuspenderte perlebundne DNA-et til proteinblandingen. Inkuber reaksjonen i 15 minutter ved 30 °C med 800 rpm omrøring.</li>
			<li>Vask perlene 3x med 200 μL HSW-buffer. Vask perlene én gang med 200 μL CMG-buffer.</li>
		</ol></li>
		<li>Eluering av intakt DNA:CMG-komplekser fra magnetiske perler (figur 1D)<ol><li>Fjern CMG-buffer og eluer DNA:CMG-komplekser fra de magnetiske perlene ved å resuspendere de CMG-holdige DNA-bundne magnetiske perlene i 200 μL elueringsbuffer (CMG-buffer supplert med 10 mM biotin). Inkuber ved romtemperatur i 1 time med 800 rpm omrøring.</li>
			<li>Plasser røret i et magnetisk stativ og la perlene samles i 5 minutter. Samle forsiktig supernatanten (som nå inneholder de eluerte DNA:CMG-kompleksene) uten å forstyrre de sedimenterte perlene og overfør den til et nytt rør.</li>
			<li>For å sikre at ingen perler forblir i løsningen (da magnetiske perler som er igjen i løsningen kan forstyrre den optiske fangstdelen av analysen), plasser den oppsamlede supernatanten igjen i et magnetisk stativ og la eventuelle gjenværende perler samles i ytterligere 5 minutter. Samle supernatanten forsiktig og overfør den til et nytt rør.</li>
			<li>Tilsett 1400 μL CMG-buffer til 200 μL supernatant. Prøven er nå klar for avbildning av enkeltmolekyler.</li>
		</ol></li>
	</ol></li>
	<li>Enkeltmolekylavbildning av fullt rekonstituert CMG med korrelativ tostråle optisk pinsett og konfokalmikroskopi (Figur 1E-G). NOTAT: Enkeltmolekyldelen av analysen utføres i et kommersielt oppsett som kombinerer tostråle optisk pinsett med konfokalmikroskopi og mikrofluidikk45,46 (Figur 1E-G), men kan også utføres i et hjemmebygd oppsett. Det kommersielle oppsettet som brukes her er utstyrt med en mikrofluidisk strømningscelle med fem innløp (referert til som henholdsvis kanal 1-5) og ett utløp (Figur 1E). I trinnene nedenfor er alle knappe- og/eller panelnavn spesifikke for programvaren som følger med dette kommersielle oppsettet.<ol><li>Bruk de fem inntakene i det kommersielle oppsettet som følger: Injiser kanal 1-3 fra venstre og bruk dem til perlefangst (kanal 1), DNA-proteinkompleksbinding (kanal 2) og sjekk for tilstedeværelse av CMG (kanal 3). Bruk kanal 4 og 5 som proteinreservoarer og bufferutvekslingssteder. Før hvert eksperiment, passiver den mikrofluidiske strømningscellen i minst 30 minutter med 1 mg/ml bovint serumalbumin, etterfulgt av 0,5 % Pluronic F-127 oppløst i ultrarent vann.<ol><li>Sørg for at innholdet i hver kanal i hvert eksperiment er som beskrevet (figur 1E): Kanal 1: Anti-digoksigenin-belagte polystyrenperler (2,06 μm diameter) fortynnet 1:50 i PBS; Kanal 2: DNA: CMG-komplekser eluert fra magnetiske perler; Kanal 3: Bildebuffer (CMG-buffer supplert med 2 mM 1,3,5,7 cyklooktatetraen, 2 mM 4-nitrobenzylalchohol og 2 mM Trolox); Kanal 4 og 5: Bildebuffer supplert med 25 nM RPA, 10 nM Mcm10 og enten 5 mM ATP, 5 mM ATPγS eller ingen nukleotid.</li>
		</ol></li>
		<li>Før eksperimentet, juster fangstlasereffekten for å oppnå en stivhet på 0.3 pN/nm i begge fellene33,46 ved å klikke på Re-kalibrer-knappen i Power Controls-panelet i programvaren. Sett den konfokale pikselstørrelsen til 50 x 50 nm, bildestørrelsen til 160 x 18 piksler, belysningstiden per piksel til 0.2 ms og bildefrekvensen til 5 s i Image Scan-panelet til programvaren. Sett temperaturkontrollen til 30 °C i temperaturpanelet. NOTAT: I tillegg anbefaler vi å sette maksimal stage hastighet (brukes til å bevege seg mellom kanaler) til 0.2 mm/s for å minimere CMG-dissosiasjon fra DNA ved hjelp av dragkraften.</li>
		<li>Flyt alle løsninger inn i strømningscellen med et konstant trykk på 0,5 bar i injeksjonsporten (som kan settes opp i trykkstangpanelet i programvaren). Slå deretter av strømmen i kanal 4 og 5. Etter å ha strømmet alle løsningene, reduser trykket til 0,2 bar.</li>
		<li>Flytt overlappingslasere til kanal 1 til én perle er fanget i hver optiske felle. Flytt fastklemte perler til kanal 2 ved å flytte styrespaken mens du trykker på avtrekkeren. Deretter fisker du et DNA:CMG-kompleks ved å flytte den høyre perlen mot og bort fra den venstre perlen ved hjelp av joysticken uten å trykke på avtrekkeren, til en DNA-tjoring er fanget (som er kjent ved å overvåke kraftforlengelseskurven til det fangede DNA47 i FD Viewer-panelet til programvaren).<ol><li>For DNA-tjoring, sørg for å legge inn DNA-lengden og riktig temperaturverdi i referansemodellpanelet, som automatisk vil plotte en teoretisk utvidbar ormlignende kjedemodell av DNA-konstruksjonen i FD Viewer-panelet. Hvis et enkelt DNA-molekyl blir fanget mellom de to perlene, bør kraftforlengelsesoppførselen til DNA-et samsvare tett med den plottede utvidbare ormlignende kjedemodellen. Sørg for at dette er tilfelle ved å overvåke den eksperimentelle kraftforlengelseskurven, som programvaren automatisk vil plotte på toppen av den teoretiske. MERK: Avvik fra den teoretiske modellen kan indikere tilstedeværelsen av flere DNA-molekyler bundet mellom perlene og/eller tilstedeværelsen av proteinaggregater bundet til DNA og komprimerer det. For å forhindre kraftmediert dissosiasjon av proteiner fra DNA, må du ikke overskride en spenning på 10 pN under denne første testen.</li>
		</ol></li>
		<li>Flytt perlene til kanal 3 og stopp flyten umiddelbart i alle kanaler. Ta en testskanning med ett bilde i kanal 3 for å bekrefte tilstedeværelsen av CMG, og lys opp med en 561 nm laser med en effekt på 4 μW målt ved objektivet. Juster bildelaserstyrkene i panelet Excitation Lasere. Hvis den er tilstede, vil CMG vises som todimensjonale diffraksjonsbegrensede flekker som vist i figur 1G og figur 2A.<ol><li>Hvis ingen DNA kan fanges, sjekk kanal 2 for bobler, noe som kan bremse strømmen i kanal 2 (sammenlignet med kanal 1 og 3). Hvis det er bobler, øk trykket i kanal 2 til 1 bar for å prøve å skylle boblene gjennom.</li>
		</ol></li>
		<li>Hvis CMG er tilstede, flytt DNA-tauet til enten kanal 4 eller 5 for avbildning; Ellers slår du på flyten igjen, kaster perlene og går tilbake til trinn 2.2.4.</li>
		<li>I kanal 4 eller 5, juster avstanden mellom perlene for å oppnå en startspenning på 2 pN i DNA-tauet. For dette, skriv inn 2 pN i Force Spectroscopy-panelet og klikk på Aktiver-knappen for å starte en kraftklemme. Når startspenningen når 2 pN, deaktiverer du kraftklemmen før avbildning ved å klikke på Aktiver-knappen i Force Spectroscopy-panelet.</li>
		<li>Ta bilde av CMGCdc45-LD555 hvert femte sekund med en 561 nm laser med en effekt på 4 μW målt ved objektivet (figur 1F). For å gjøre dette, klikk på Start skanning-knappen i Bildeskanning-panelet. I slike skanninger vil CMG vises som todimensjonale diffraksjonsbegrensede flekker, slik som eksemplet i figur 1G.<ol><li>Hvis CMG observeres, men det ikke ser ut til å bevege seg før bleking, test alle proteinene som brukes til nukleaseaktivitet, da hakk på DNA vil føre til at CMG dissosierer fra DNA41, noe som reduserer dens tilsynelatende prosessivitet alvorlig. NOTAT: En lasereffekt på 4 μW bør gi konsistente resultater hvis du bruker det kommersielle mikroskopet som brukes her. Hvis du bruker et hjemmebygd oppsett, anbefaler vi å estimere den optimale lasereffekten empirisk. En optimal lasereffekt bør gi nok signal fra fluoroforen til å lokalisere den med ønsket presisjon, og en fluoroforlevetid nær ønsket tidsområde for eksperimentet. MERK: Selv om denne publikasjonen fokuserer på hybridensemble- og enkeltmolekylanalysen, har vi tidligere publisert en omfattende beskrivelse av analysen av dataene generert med denne analysen48.</li>
		</ol></li>
	</ol></li>
</ol>

Avbildning av bevegelsen til fullstendig rekonstituert Cdc45/Mcm2-7/GINS (CMG)

Forfatterne har ingenting å avsløre.

Kritiske trinn og viktige kvalitetskontroller av reagenser De kritiske trinnene og kvalitetskontrollene av biologiske reagenser i analysen er fremhevet her. For det første er renheten til proteinene som brukes viktig fordi DNA-nedbrytning forårsaket av selv små nukleaseforurensninger i proteinprøvene vil påvirke dataene negativt. Dette er fordi bare intakte (eller delvis hakkede) DNA-molekyler kan fanges i den tostrålede optiske pinsetten. Enda viktigere, hakk på DNA vil føre til at CMG dissosierer41, noe som kompliserer observasjonen av CMGs langdistansebevegelse. Vi anbefaler på det sterkeste å teste hvert renset protein for nukleaseaktivitet, samt kontinuerlig overvåke integriteten til startplasmidsubstratet for å sikre at hakking reduseres til et minimum. Det andre viktige trinnet er forsiktig fjerning av de magnetiske perlene etter eluering av DNA:CMG-komplekser. Fjerning av supernatant i dette trinnet bør utføres sakte for ikke å forstyrre de innsamlede perlene. Hvis magnetiske perler blir igjen i prøven som flys inn i den optiske pinsetten, vil de ofte treffe de optisk fangede polystyrenperlene, noe som får dem til å unnslippe den optiske fellen og komplisere datainnsamlingen. Til slutt bør DNA:CMG-komplekser håndteres forsiktig i den optiske pinsetten. For dette formål anbefaler vi ikke å øke spenningen til DNA over 10 pN, da påføring av kraft kan dissosiere CMG fra DNA. Videre bør bevegelse mellom kanaler i den mikrofluidiske strømningscellen gjøres så sakte som mulig (~ 0.2 mm/s) for å forhindre at de resulterende dragkreftene dissosierer CMG fra DNA.
Modifikasjoner av metoden Det er flere trinn i analysen som kan endres. For eksempel har vi vist at elueringstiden kan reduseres fra 60 min til 30 min uten å påvirke elueringsutbyttet nevneverdig. I tillegg anbefaler vi å supplere elueringsbufferen med en lav (under 1 mM) konsentrasjon av enten ATP eller ATPγS for å forhindre at CMG diffunderer fra DNA-endene, samt for generelt å stabilisere CMG28. Videre, selv om buffersammensetningene og proteinkonsentrasjonene vi rapporterer her er basert på de som ble brukt i tidligere biokjemisk og enkeltmolekylarbeid11,18, er analysen vi beskriver fullt kompatibel med andre protokoller for å sette sammen CMG26,27. Derfor kan og bør ethvert biokjemisk fremskritt som rapporteres for å øke effektiviteten til CMG-montering eller aktivering implementeres i hoveddelen av analysen for å øke utbyttet. Til slutt, å øke tiden mellom bildene øker den totale tiden CMG kan avbildes, noe som letter observasjonen av langdistanse CMG-bevegelse før fluoroforbleking.
Begrensninger ved metoden Hybridmetoden vi beskriver er begrenset ved at man bare kan avbilde CMG etter at den er aktivert i bulk. Ytterligere arbeid vil være nødvendig for å observere aktiveringen av CMG i sanntid. En annen viktig begrensning er at mens vi forventer at CMG skal settes sammen i par 17,26,27, er det totale antallet CMG-komplekser per DNA som vi observerer stort sett én28, noe som tyder på at CMG, eller i det minste Cdc45, dissosierer fra DNA under håndteringen av de sensitive DNA:CMG-kompleksene. Å redusere antall håndteringstrinn før enkeltmolekylavbildningen, samt utvikle bedre passiveringsstrategier for plastrøret og glasset i den mikrofluidiske strømningscellen, er klar til å øke dette utbyttet.
Betydningen av metoden Enkeltmolekylbevegelsesstudier av CMG har så langt brukt preaktivert CMG renset som et kompleks fra celler. Selv om den er relativt enklere, er denne forhåndsaktiverte CMG-tilnærmingen begrenset ved at den går glipp av noen av trinnene som fører opp til CMG-aktivering, så vel som den toveis naturen til CMG og replikombevegelse. På den annen side har full rekonstituering av CMG-montering og aktivering potensial til å studere eventuelle pre-aktiveringstrinn, samt å studere CMG-bevegelse på en toveis måte. Likevel er denne tilnærmingen vanskeligere å oversette fra det biokjemiske nivået til enkeltmolekylnivået, da det involverer mye mer rensede proteinfaktorer og trinn. Analysen vi beskriver her har bidratt til å overvinne disse utfordringene ved å tillate oss å avbilde bevegelsen til fullstendig rekonstituert CMG på enkeltmolekylnivå, slik at vi får tilgang til noen tidligere savnede pre-aktiveringsdynamikk28. I tillegg, selv om vi stort sett ser én CMG per DNA, var vi i stand til å observere flere tilfeller av to CMG-komplekser som beveger seg i motsatte retninger, og vi kunne til og med fange den første separasjonen av søster-CMG-er fra hverandre28, noe som gir litt innsikt i etableringen av toveis replikasjon.
En annen fordel med denne analysen sammenlignet med tidligere CMG-bevegelse ligger i den fullstendig dobbelttrådede naturen til DNA-substratet vi bruker (figur 1A). I tidligere pre-aktivert CMG-arbeid er den vanligste måten å binde CMG til DNA-substratet gjennom en 3' ssDNA-klaff. Dette resulterer i en DNA-konstruksjon som ikke lett kan torsjonsbegrenses og dermed forbyr studiet av rollen til supercoiling i replikomprogresjon. Omvendt kan den nye tilnærmingen vi beskriver her ha potensial til å bli tilpasset for å studere dreiemomentets rolle i denne prosessen, ettersom DNA-substratet som brukes er fullstendig dobbelttrådet.
Bredere anvendelser av metoden Den beskrevne hybridanalysen vil bane vei mot full rekonstituering av et komplett eukaryot replisom, slik at vi og andre kan observere og kvantifisere den viktige dynamikken som gjør at replisomet kan lykkes med alle sine forskjellige oppgaver. Bortsett fra DNA-replikasjon, representerer analysen vi rapporterer et viktig fremskritt i å oversette en komplisert biokjemisk reaksjon fra bulk biokjemisk til enkeltmolekylnivå. Vi forventer at denne analysen enkelt kan modifiseres for å studere lignende komplekse DNA:protein-interaksjoner involvert i forskjellige DNA-prosesseringsmekanismer.

DNA-replikasjon i eukaryoter utføres av et dynamisk proteinkompleks kjent som replisomet1. En nøkkelkomponent i dette komplekset er den eukaryote replikative helikasen Cdc45/Mcm2-7/GINS (CMG), som driver og sentralt organiserer replisomet, og leder an foran replikasjonsgaflene 1,2. Å oppnå en dyp kvantitativ forståelse av dynamikken til CMG er derfor avgjørende for å forstå dynamikken til replisomet. En slik forståelse kan oppnås med enkeltmolekylteknikker, som er unikt egnet til å studere molekylære motorer, som CMG, på grunn av deres uovertrufne romlige og tidsmessige oppløsning, og kan gi oss en enestående kvantitativ forståelse av deres funksjon, stokastisitet og dynamikk 2,3,4,5,6,7,8,9.
In vivo lastes og aktiveres CMG på en tidsmessig atskilt måte for å sikre at replikasjon bare skjer én gang per cellesyklus 1,10,11. For det første, i G1-fasen av cellesyklusen, laster et sett med proteiner kjent som belastningsfaktorer den første komponenten av CMG, Mcm2-7 hexameric complex, på dsDNA 12,13,14,15,16 i form av doble hexamere med en head-to-head-konfigurasjon 15,17,18 . I det spesifikke tilfellet med gjær skjer denne innledende prosessen ved spesifikke DNA-sekvenser kjent som replikasjonsopprinnelse1. Selv om Mcm2-7 er den motoriske kjernen i den replikative helikasen, er den i seg selv ikke i stand til å slappe av DNA19 uten de to helikaseaktiverende faktorene Cdc45 og GINS, som må rekrutteres til den belastede Mcm2-7 for å gi opphav til fullt aktiv CMG 11,19,20,21. Prosessen med helikaseaktivering finner sted i S-fasen av cellesyklusen og starter med selektiv fosforylering av Mcm2-7 doble hexamerer av den cellesyklusregulerte kinasen DDK 22,23,24. Disse fosforyleringshendelsene letter rekrutteringen av Cdc45 og GINS til Mcm2-7 doble hexamere 10,22,23,24,25,26 av et andre sett med proteiner kjent som avfyringsfaktorer 10,11,26 . Bindingen av Cdc45 og GINS gir opphav til to søster CMG-helikaser, som i utgangspunktet omslutter begge trådene av foreldre-DNA og fortsatt er lokalisert i en head-to-head-konfigurasjon11,27. I det siste aktiveringstrinnet katalyserer avfyringsfaktoren Mcm10 den ATP-hydrolyseavhengige ekstruderingen av en DNA-streng fra hver søster CMG11. Etter strengekstrudering omgår og skiller søster CMG-helikaser seg fra hverandre ved å translokere langs ssDNA på en ATP-hydrolyseavhengig måte 11,20,21,28, avvikle DNA ved sterisk å ekskludere ikke-translokasjonsstrengen 29. Hele denne prosessen har blitt fullstendig rekonstituert in vitro fra et minimalt sett med 36 rensede S. cerevisiae-polypeptider 10,11.
Til tross for den utsøkte in vivo-reguleringen av CMG-montering og aktivering beskrevet ovenfor, har in vitro-rekonstituerte enkeltmolekylbevegelsesstudier av CMG 2,30,31,32,33,34 så langt vært avhengig av preaktivert CMG renset som et kompleks fra celler 20,21, mangler alle trinnene før aktiveringen og den toveis naturen til bevegelsen. Denne pre-aktiverte CMG-tilnærmingen har vært gullstandarden i enkeltmolekylfeltet, delvis på grunn av den biokjemiske kompleksiteten til den fullstendig rekonstituerte CMG-monteringsreaksjonen10,11. Denne biokjemiske reaksjonen har vært utfordrende å oversette fra bulkbiokjemisk nivå til enkeltmolekylnivå av flere grunner. For det første, for å maksimere reaksjonseffektiviteten, kreves belastnings- og avfyringsfaktorene som trengs for CMG-montering og aktivering ved konsentrasjoner i området 10-200 nM 10,11,27. Disse konsentrasjonsområdene tilsvarer den høye enden av hva de fleste enkeltmolekylteknikker kan tolerere, spesielt ved bruk av fluorescerende merkede komponenter35. Til slutt har CMG utviklet seg til å cruise gjennom tusenvis av basepar i en celle 36,37,38,39. Derfor, for å studere bevegelsen på en biologisk relevant romlig skala, trenger man lange DNA-substrater (typisk med lengder i størrelsesorden titalls kilobaser)30,31,34,40,41,42. Å bruke så lange DNA-substrater utgjør den ekstra utfordringen at jo lengre DNA-substratet er, jo flere potensielle uspesifikke bindingssteder for proteiner og proteinaggregater har det. Når det gjelder CMG, er sistnevnte punkt spesielt viktig, siden flere av belastnings- og avfyringsfaktorene som er involvert i CMG-montering og aktivering inneholder iboende uordnede regioner43 og er aggregeringsutsatte.
Her rapporterer vi en hybrid ensemble- og enkeltmolekylanalyse som tillot observasjon og kvantifisering av bevegelsen til CMG etter fullstendig rekonstituering og aktivering fra 36 rensede S. cerevisiae-polypeptider 28. Denne analysen er avhengig av dobbel funksjonalisering av begge ender av et DNA-substrat med to ortogonale festedeler: destiobiotin og digoksigenin2 (figur 1A). Den første delen, destiobiotin, brukes til reversibelt å binde DNA-substratet til streptavidinbelagte magnetiske perler44 (figur 1B). Etter dette blir fluorescerende merket CMG satt sammen og aktivert på det perlebundne DNA, og et magnetisk stativ brukes til å rense og vaske de resulterende magnetiske perlebundne DNA:CMG-kompleksene (figur 1C). Ved å gjøre dette fjernes overflødig protein som ellers ville samlet seg på DNA-substratet; dette gir praktisk talt aggregeringsfrie DNA:CMG-komplekser. Intakte komplekser elueres deretter fra de magnetiske perlene ved tilsetning av et molært overskudd av fritt biotin, som kan utkonkurrere destiobiotin-streptavidin-interaksjonen (figur 1D). Individuelle DNA:CMG-komplekser bindes deretter mellom to optisk fangede polystyrenperler belagt med anti-digoksigenin-antistoff (anti-Dig); for dette trinnet brukes den andre delen på DNA, digoksigenin, da den kan binde seg til anti-Dig selv i en bufferløsning som inneholder et overskudd av fritt biotin (figur 1E). Når DNA:CMG-komplekset holdes på plass i den optiske fellen, avbildes bevegelsen til fluorescerende merket CMG med en konfokal skanningslaser (figur 1F). Vi forventer at denne analysen enkelt kan tilpasses for studien på enkeltmolekylnivå av lignende komplekse DNA:protein-interaksjoner.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>AflII&#160;</td>
			<td>NEB</td>
			<td>R0520L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-digoxigenin coated polystyrene beads&#160;</td>
			<td>Spheroteck</td>
			<td>DIGP-20-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ATP solution</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>R0441</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ATP&#947;S</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11162306001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA</td>
			<td>NEB</td>
			<td>B9000S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C-Trap</td>
			<td>Lumicks</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CutSmart Buffer</td>
			<td>NEB</td>
			<td>B6004S</td>
			<td>Provided with AflII</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dCTP</td>
			<td>Promega</td>
			<td>U122B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-Desthiobiotin-7-dATP</td>
			<td>Jena Bioscience&#160;</td>
			<td>NU-835-Desthiobio</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dGTP</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>10218014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Digoxigenin-11-dUTP</td>
			<td>Jena Bioscience</td>
			<td>NU-803-DIGXL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dynabeads M-280 Streptavidin magnetic beads</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>11205D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Klenow Fragment (3&#39;&#8594;5&#39; exo-)&#160;</td>
			<td>NEB</td>
			<td>M0212L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microspin S-400 HR spin columns&#160;</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>GE27-5140-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NEBuffer2</td>
			<td>NEB</td>
			<td>B7002S</td>
			<td>Provided with Klenow Fragment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nonidet&#160;P 40 Substitute</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>74385</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pluronic F-127&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P2443</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

hybrid ensemble and single-molecule assay to image the motion of fully reconstituted cmg

Eukaryoter har en replikativ helikase kjent som CMG, som sentralt organiserer og driver replisomet, og leder an foran replikasjonsgafler. Å oppnå en dyp mekanistisk forståelse av dynamikken til CMG er avgjørende for å belyse hvordan celler oppnår den enorme oppgaven med å effektivt og nøyaktig replikere hele genomet en gang per cellesyklus. Enkeltmolekylteknikker er unikt egnet til å kvantifisere dynamikken til CMG på grunn av deres enestående tidsmessige og romlige oppløsning. Likevel har enkeltmolekylstudier av CMG-bevegelse så langt vært avhengig av forhåndsformet CMG renset fra celler som et kompleks, noe som utelukker studiet av trinnene som fører til aktiveringen. Her beskriver vi et hybridensemble og enkeltmolekylanalyse som tillot avbildning på enkeltmolekylnivå av bevegelsen til fluorescerende merket CMG etter fullstendig rekonstituering og aktivering fra 36 forskjellige rensede S. cerevisiae-polypeptider . Denne analysen er avhengig av dobbel funksjonalisering av endene av et lineært DNA-substrat med to ortogonale festedeler, og kan tilpasses for å studere lignende komplekse DNA-prosesseringsmekanismer på enkeltmolekylnivå.

DNA replication in eukaryotes is carried out by a dynamic protein complex known as the replisome1. A key component of this complex is the eukaryotic replicative helicase Cdc45/Mcm2-7/GINS (CMG), which drives and centrally organizes the replisome, leading the way at the front of replication forks1,2. Obtaining a deep quantitative understanding of the dynamics of CMG is therefore critical to understanding the dynamics of the replisome. Such an understanding could be acquired with single-molecule techniques, which are uniquely suited to study molecular motors, such as CMG, due to their unmatched spatial and temporal resolution, and can provide us with an unparalleled quantitative understanding of their function, stochasticity, and dynamics2,3,4,5,6,7,8,9.
In vivo, CMG is loaded and activated in temporally separated fashion to ensure that replication occurs only once per cell cycle1,10,11. First, in the G1 phase of the cell cycle, a set of proteins known as loading factors loads the first component of CMG, the Mcm2-7 hexameric complex, onto dsDNA12,13,14,15,16 in the form of double hexamers with&#160;a head-to-head configuration15,17,18. In the specific case of yeast, this initial process occurs at specific DNA sequences known as origins of replication1. Although Mcm2-7 is the motor core of the replicative helicase, it is by itself unable to unwind DNA19 without the two helicase-activating factors Cdc45 and GINS, which need to be recruited to the loaded Mcm2-7 to give rise to fully active CMG11,19,20,21. The process of helicase activation takes place in the S&#160;phase of the cell cycle and starts with the selective phosphorylation of Mcm2-7 double hexamers by the cell cycle-regulated kinase DDK22,23,24. These phosphorylation events facilitate the recruitment of Cdc45 and GINS to the Mcm2-7 double hexamers10,22,23,24,25,26 by a second set of proteins known as firing factors10,11,26. The binding of Cdc45 and GINS gives rise to two sister CMG helicases, which initially enclose both strands of the parental DNA and are still located in a head-to-head configuration11,27. In the final activation step, the firing factor Mcm10 catalyzes the ATP hydrolysis-dependent extrusion of one DNA strand from each sister CMG11. After strand extrusion, sister CMG helicases bypass and separate from each other by translocating along ssDNA in an ATP hydrolysis-dependent manner11,20,21,28, unwinding DNA by sterically excluding the non-translocation strand29. This entire process has been fully reconstituted in vitro from a minimal set of 36 purified S. cerevisiae polypeptides10,11.
Despite the exquisite in vivo regulation of CMG assembly and activation described above, in vitro reconstituted single-molecule motion studies of CMG2,30,31,32,33,34 have thus far relied on pre-activated CMG purified as a complex from cells20,21, missing all the steps prior to its activation and the bidirectional nature of its motion. This pre-activated CMG approach has been the gold standard in the single-molecule field partly due to the biochemical complexity of the fully reconstituted CMG assembly reaction10,11. This biochemical reaction has been challenging to translate from the bulk biochemical level to the single-molecule level for several reasons. First, to maximize reaction efficiencies, the loading and firing factors needed for CMG assembly and activation are required at concentrations in the range of 10-200 nM10,11,27. These ranges of concentration correspond to the high end of what most single-molecule techniques can tolerate, especially when using fluorescently labeled components35. Finally, CMG has evolved to cruise through thousands of base pairs in a cell36,37,38,39. Therefore, to study its motion at a biologically relevant spatial scale, one requires long DNA substrates (typically of lengths in the order of tens of kilobases)30,31,34,40,41,42. Employing such long DNA substrates poses the additional challenge that the longer the DNA substrate is, the more potential non-specific binding sites for proteins and protein aggregates it has. In the case of CMG, the latter point is particularly important, as several of the loading and firing factors involved in CMG assembly and activation contain intrinsically disordered regions43 and are aggregation-prone.
Here, we report a hybrid ensemble and single-molecule assay that allowed the observation and quantification of the motion of CMG after fully reconstituting its assembly and activation from 36 purified S. cerevisiae polypeptides28. This assay relies on the double functionalization of both ends of a DNA substrate with two orthogonal attachment moieties: desthiobiotin and digoxigenin2 (Figure 1A). The first moiety, desthiobiotin, is used to reversibly bind the DNA substrate to streptavidin-coated magnetic beads44 (Figure 1B). Following this, fluorescently labeled CMG is assembled and activated onto the bead-bound DNA, and a magnetic rack is used to purify and wash the resulting magnetic bead-bound DNA:CMG complexes (Figure 1C). In doing so, the excess protein that would otherwise aggregate on the DNA substrate is removed; this provides virtually aggregation-free DNA:CMG complexes. Intact complexes are then eluted from the magnetic beads by the addition of a molar excess of free biotin, which can outcompete the desthiobiotin-streptavidin interaction (Figure 1D). Individual DNA:CMG complexes are then bound between two optically trapped polystyrene beads coated with anti-digoxigenin antibody (anti-Dig); for this step, the second moiety on the DNA, digoxigenin, is used as it can bind to anti-Dig even in a buffer solution containing an excess of free biotin (Figure 1E). Once the DNA:CMG complex is held in place in the optical trap, the motion of fluorescently labeled CMG is imaged with a confocal scanning laser (Figure 1F). We anticipate that this assay can be easily adapted for the study at the single-molecule level of similarly complex DNA:protein interactions.

Forfatter Spotlight: Undersøkelse av bevegelsesdynamikken til de eukaryote replisomkomponentene på enkeltmolekylnivå

Hybrid ensemble- og enkeltmolekylanalyse for å avbilde bevegelsen til fullstendig rekonstituert CMG

We study the motion dynamics of different components of the eukaryotic replisome at the single molecule level. In order to obtain a deep quantitative understanding of how cells can duplicate their entire genomes, every cell cycle. In a breakthrough in 2015, eukaryotic DNA replication was fully reconstituted in vitro from purified protein components.And this gave us a lot of control over the system. And since then, it's been used extensively to answer questions about different stages of DNA replication with increasing temporal and spatial resolution. And this was done using complementary approaches such as cryo EM and single molecule biophysics.In the single molecule field, one of the biggest challenges with this system is the number of proteins involved and also the concentrations at which these components are required in order to maximize the efficiency of the overall reaction because this can complicate the single molecule imaging. The protocol described here introduces a hybrid approach in which a protein complex is first assembled in an efficient manner using ensemble biochemistry before then being introduced and studied in a single molecule setting. This avoids the introduction of two high protein concentrations at the single molecule level.We illustrate this approach for studying the behavior of the replicative helicase CMG on DNA at the single molecule level following its assembly via the origin based pathway. But this approach can also be used to study the dynamics of many other types of DNA binding protein complexes.

Når den utføres riktig, bør protokollen beskrevet her gi praktisk talt aggregatfrie DNA:CMG-komplekser. En aggregeringsfri reaksjon bør ikke tette noen av kanalene i den mikrofluidiske strømningscellen, og det bør være mulig å strekke de fangede DNA-molekylene til en ende-til-ende-forlengelse innenfor 10 % av konturlengden uten å bryte DNA. Omvendt, hvis det er aggregering i reaksjonen, kan DNA-molekyler noen ganger bli komprimert av aggregatene, og ofte forårsake DNA-brudd hvis de strekkes. En god måte å gjenkjenne proteinaggregater på er ved å se på 2D-skanningene av DNA. I en aggregeringsfri reaksjon fremstår CMG som diskrete, symmetriske diffraksjonsbegrensede flekker som tynt fyller DNA, slik som de i skanningene vist i figur 2A. Tvert imot er aggregater mindre diskrete, noen ganger asymmetriske klumper som trengs sammen i en større lengde av DNA, som de i skanningene vist i figur 2B. Videre, hvis analysen er vellykket utført, og høy renhet av de rensede proteinene oppnås, vil langdistansebevegelse av CMG i nærvær av ATP bli sett, som observert i kymografen vist i figur 2C.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67076/67076fig01v2.jpg"> Figur 1: Bildebeskrivelse av hybrid ensemble- og enkeltmolekylanalyse for å avbilde og kvantifisere bevegelsen til fullt rekonstituert CMG. (A) Et 23,6 kb lineært DNA som inneholder en naturlig forekommende ARS1-opprinnelse til replikasjon er dobbelt funksjonalisert i begge ender med destiobiotin- og digoksigenindeler. (B) Dobbelt funksjonalisert DNA er bundet til streptavidin-belagte magnetiske perler gjennom destiobiotin-delene. (C) CMG er trinnvis montert og aktivert på det magnetiske perlebundne DNA-et med forskjellige vasketrinn inkludert for å fjerne overflødig ubundet protein og proteinaggregater. (D) Intakte DNA:CMG-komplekser elueres deretter fra de magnetiske perlene ved tilsetning av et overskudd av fritt biotin, som utkonkurrerer destiobiotin-streptavidin-interaksjonen. (E) Individuelle DNA:CMG-komplekser er bundet mellom to anti-digoksigenin-belagte optisk fangede polystyrenperler ved hjelp av en mikrofluidisk strømningscelle. Merk at Dig-anti-Dig-interaksjonen er ortogonal til biotin-avidin-interaksjoner, så den påvirkes ikke av tilstedeværelsen av fritt biotin. (F) Når de holdes på plass av den optiske pinsetten, overføres DNA:CMG-komplekser til forskjellige bufferforhold, hvor DNA-planet deretter skannes med en konfokal skanningslaser for å avbilde bevegelsen til CMG langs DNA over tid. (G) Det øverste panelet viser et diagram av et DNA:CMG-kompleks holdt på plass mellom to optisk fangede anti-Dig-belagte polystyrenperler som skannes av en konfokal skanningslaser. Det nederste panelet viser et eksempel på en 2D-skanning av CMG bundet til et DNA holdt på plass med en optisk felle. DNA-et er umerket i disse eksperimentene, men det kan betraktes som en horisontal linje som går gjennom midten av bildet. Dette tallet er endret fra28. Klikk <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67076/67076fig01largev2.jpg" target="_blank">her for å se en større versjon av denne figuren.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67076/67076fig02.jpg"> Figur 2: Eksempler på data fra et vellykket og et mislykket eksperiment. (A) Eksempel på 2D-skanninger av et CMG-holdig DNA i en aggregeringsfri prøve. I begge skanningene viser CMG symmetriske og diskrete diffraksjonsbegrensede flekker spredt langs DNA. (B) Eksempel på 2D-skanninger av et CMG-holdig DNA i en prøve som inneholder aggregater. I begge skanningene danner CMG mindre symmetriske klatter som fyller DNA. (C) Kymograf som viser posisjonen på DNA av CMG-diffraksjonsbegrensede flekker over tid i nærvær av ATP, som viser langdistansebevegelsen til CMG-komplekser. Klikk <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67076/67076fig02large.jpg" target="_blank">her for å se en større versjon av denne figuren.</a>

Vi rapporterer et hybridensemble og enkeltmolekylanalyse for direkte å avbilde og kvantifisere bevegelsen til fluorescerende merket, fullt rekonstituert Cdc45/Mcm2-7/GINS (CMG) helikase på lineære DNA-molekyler holdt på plass i en optisk felle.

Eukaryotes have one replicative helicase known as CMG, which centrally organizes and drives the replisome, and leads the way at the front of replication ...

hybrid-ensemble-single-molecule-assay-to-image-motion-fully

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Hybrid Ensemble and Single-molecule Assay to Image the Motion of Fully Reconstituted CMG

367 Views.  Delft University of Technology. We study the motion dynamics of different components of the eukaryotic replisome at the single molecule level. In order to obtain a deep quantitative understanding of how cells can duplicate their entire genomes, every cell cycle. In a breakthrough in 2015, eukaryotic DNA replication was fully reconstituted in vitro from purified protein components.And this gave us a lot of control over the system. And since then, it's been used extensively to answer questions about different stages of...