Vi studerar rörelsedynamiken hos olika komponenter i den eukaryota replikosomen på enmolekylsnivå. För att få en djup kvantitativ förståelse för hur celler kan duplicera hela sin arvsmassa, varje cellcykel. I ett genombrott 2015 rekonstituerades eukaryot DNA-replikation helt in vitro från renade proteinkomponenter.
Och detta gav oss mycket kontroll över systemet. Och sedan dess har det använts i stor utsträckning för att svara på frågor om olika stadier av DNA-replikation med ökande tidsmässig och rumslig upplösning. Och detta gjordes med hjälp av komplementära metoder som kryo-EM och biofysik med enskilda molekyler.
Inom området för enskilda molekyler är en av de största utmaningarna med detta system antalet proteiner som är inblandade och även de koncentrationer vid vilka dessa komponenter krävs för att maximera effektiviteten i den totala reaktionen eftersom detta kan komplicera avbildningen av enskilda molekyler. Protokollet som beskrivs här introducerar ett hybridtillvägagångssätt där ett proteinkomplex först sätts samman på ett effektivt sätt med hjälp av ensemblebiokemi innan det sedan introduceras och studeras i en enda molekylmiljö. På så sätt undviker man att införa två höga proteinkoncentrationer på nivån för en enda molekyl.
Vi illustrerar detta tillvägagångssätt för att studera beteendet hos den replikativa helikasen CMG på DNA på enmolekylsnivå efter dess sammansättning via den ursprungsbaserade vägen. Men detta tillvägagångssätt kan också användas för att studera dynamiken hos många andra typer av DNA-bindande proteinkomplex.
