يقر JP بدعم التمويل من مجلس أبحاث العلوم الطبيعية والهندسة في كندا وكلية الطب بجامعة ساسكاتشوان. تقر YD بدعم التمويل المقدم من صندوق بدء التشغيل لكلية الطب بجامعة ساسكاتشوان ، ومنحة اكتشاف مجلس أبحاث العلوم الطبيعية والهندسة في كندا (RGPIN-2023-03659) ، ومنحة MS Canada Catalyst (1019973) ، ومنحة مؤسسة ساسكاتشوان للبحوث الصحية (6368) ، ومنحة قادة المستقبل لمؤسسة Brain Canada في منحة أبحاث الدماغ الكندية. تم إنشاء الشكل 1 أ والشكل 2 أ والشكل 3 أ باستخدام BioRender.com.

تم إيواء جميع المستخدمة في هذه الدراسة والتعامل معها بموافقة لجنة رعاية الجامعية (UACC) بجامعة ساسكاتشوان والمجلس الكندي لرعاية (CCAC). أيام ما بعد الولادة 0-2 CD1 تم استخدام ذكور وإناث الفئران والأيام الجنينية 16-18 (E16-18) من الفئران الحوامل CD1 لهذه الدراسة. يتم سرد تفاصيل الكواشف والمعدات المستخدمة...

 بروتوكول الزراعة المشتركة للخلايا الدبقية الصغيرة والخلايا العصبية الأولية لدراسات تفاعل الجهاز العصبي المركزي

يعلن أصحاب البلاغ عدم وجود تضارب في المصالح.

توضح هذه المقالة بروتوكولا لعزل وزراعة الخلايا العصبية الأولية للفأر والدبقية الصغيرة الأولية ، والتي تستخدم لاحقا لإنشاء ثقافة مشتركة بين الخلايا الدبقية الصغيرة والخلايا العصبية يمكن استخدامها لدراسة كيفية تنظيم تفاعلات الخلايا الدبقية الصغيرة والخلايا العصبية لصحتها الخلوية ووظي?...

الخلايا الدبقية الصغيرة هي بلاعم مقيمة في الأنسجة تسهل المراقبة المناعية والتوازن في الجهاز العصبي المركزي (CNS)1،2،3. وهي تنشأ من الخلايا السلفية لكيس الكريات الحمر التي تستعمر الدماغ أثناء التطور الجنيني4،5،6 ويتم الحفاظ عليها طوال فترة حياة الكائن الحي من خلال التجديد الذاتي ، والذي ينطوي على الانتشار وموت الخلايا المبرمج7. في الحالة المستقرة ، تشعبت الخلايا الدبقية الصغيرة أثناء الراحة وتشارك في مراقبة الأنسجة8،9،10.
تعبر الخلايا الدبقية الصغيرة عن العديد من مستقبلات سطح الخلية ، والتي تمكنها من الاستجابة السريعة للتغيرات في الجهاز العصبي المركزي11,12 وتعزيز الاستجابات الالتهابية في حالة حدوث عدوى أو إصابة الأنسجة 12,13,14 ، وكذلك أثناء الأمراض التنكسية العصبية 9,15 ، مثل التصلب المتعدد (MS)16,17. تعبر الخلايا الدبقية الصغيرة أيضا عن مستقبلات لمختلف الناقلات العصبية والببتيدات العصبية18،19،20 ، مما يشير إلى أنها قد تستجيب أيضا للنشاط العصبي وتنظمه21،22. في الواقع ، تتفاعل الخلايا الدبقية الصغيرة والخلايا العصبية في أشكال مختلفة من الاتصال ثنائي الاتجاه 8,23 مثل التفاعلات المباشرة بوساطة بروتينات الغشاء أو التفاعلات غير المباشرة من خلال العوامل القابلة للذوبان أو الخلايا الوسيطة23,24.
على سبيل المثال ، يمكن للناقلات العصبية المختلفة التي تفرزها الخلايا العصبية تعديل النشاط العصبي أو الالتهابي للخلايا الدبقية الصغيرة25،26،27. بالإضافة إلى ذلك ، تساعد التفاعلات المباشرة بين الخلايا العصبية والدبقية الصغيرة في الحفاظ على الخلايا الدبقية الصغيرة في حالة الاستتباب28. على العكس من ذلك ، يمكن للتفاعلات المباشرة للخلايا الدبقية الصغيرة مع الخلايا العصبية تشكيل الدوائر العصبية29 والتأثير على الإشارات العصبية30،31،32. نظرا لأن اضطرابات هذه التفاعلات تحفز فرط استثارة الخلايا العصبية30 وتفاعل الخلايا الدبقية الصغيرة33,34 ، فإن التفاعلات العصبية الدبقية الصغيرة غير المنظمة متورطة كعامل مساهم في الأمراض العصبية33,35. في الواقع ، تم وصف الأمراض الذهانية23,26 والأمراض التنكسية العصبية لإظهار تفاعلات الخلايا الدبقية الصغيرة المختلةوظيفيا 33. في حين أن هذه الملاحظات تسلط الضوء على أهمية التواصل بين الخلايا العصبية الدبقية الصغيرة في الجهاز العصبي المركزي ، فإن الآليات المحددة لكيفية تنظيم هذه التفاعلات للوظائف الدبقية الصغيرة والخلايا العصبية في الصحة والمرض غير معروفة نسبيا.
داخل بيئة معقدة مثل الجهاز العصبي المركزي ، يمكن أن تؤثر عوامل بيئية متعددة على التفاعلات العصبية الدبقية الصغيرة ، مما يحد من القدرة على دراسة التفاعلات الخلوية العابرة في الجسم الحي. هنا ، نقدم نظام زراعة الخلايا الدبقية الصغيرة في المختبر والذي يمكن استخدامه لدراسة التفاعلات الخلوية المباشرة بين الخلايا الدبقية الصغيرة والخلايا العصبية. يصف هذا البروتوكول توليد الخلايا الدبقية الصغيرة الأولية والخلايا العصبية من قشرة الفئران حديثي الولادة بين أيام ما بعد الولادة 0-2 وأيام الفئران الجنينية 16-18 ، على التوالي. ثم يتم استزراع الخلايا العصبية والدبقية الصغيرة في 96 لوحة بئر لإجراء تجارب عالية الإنتاجية في المصب. استخدمنا هذا النهج سابقا لإثبات أن البلعمة الدبقية الصغيرة تحمي الخلايا العصبية من موت الخلايا بوساطة الفوسفاتيديل كولينالمؤكسد 37 ، مما يشير إلى أن هذه الطريقة يمكن أن تساعد في فهم أدوار الخلايا الدبقية الصغيرة في سياق التنكس العصبي والتصلب العصبي المتعدد. وبالمثل ، قد تكون الثقافات المشتركة للخلايا الدبقية الصغيرة مفيدة أيضا للتحقيق في تأثير الحديث المتبادل بين الخلايا الدبقية الصغيرة والخلايا العصبية في سياقات أخرى مثل الالتهابات الفيروسية38 أو إصابة الخلايا العصبية وإصلاحها39. بشكل عام ، تمكن أنظمة الزراعة المشتركة للخلايا الدبقية الصغيرة في المختبر الباحثين من دراسة التفاعلات العصبية الدبقية الصغيرة في بيئة قابلة للتلاعب والتحكم ، والتي تكمل النماذج في الجسم الحي.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>10 cm Petri dish&#160;</td>
			<td>Fisher&#160;</td>
			<td>07-202-011</td>
			<td>Sterile</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1x Versene</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15040-066</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B-27 Plus Neuronal Culture System&#160;</td>
			<td>Gibco&#160;</td>
			<td>A3653401</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissection microscope</td>
			<td>VWR</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNase I</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11284932001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#8217;s Modified Eagle Medium (DMEM)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11960-044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum&#160;</td>
			<td>ThermoFisher Sci</td>
			<td>12483-020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HBSS (10x)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14065-056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hemacytometer</td>
			<td>Hausser Scientific</td>
			<td>1475</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES&#160;</td>
			<td>ThermoFisher Sci</td>
			<td>15630080</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leibovitz&#8217;s L-15 Medium (1x)</td>
			<td>Fisher Scientific&#160;</td>
			<td>21083027</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Macrophage colony stimulating factor&#160;</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>315-02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro-Forceps</td>
			<td>RWD</td>
			<td>F11020-11</td>
			<td>Autoclaved/Sterile</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Non-essential amino acids</td>
			<td>Cytiva</td>
			<td>SH3023801</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS (10x)</td>
			<td>ThermoFisher Sci</td>
			<td>AM9625</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin Streptomycin Glutamine (100x)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>103780-16</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-L-ornithine hydrobromide&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P3655-100MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium pyruvate (100 mM)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11360-070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spring scissors</td>
			<td>RWD</td>
			<td>S11008-42</td>
			<td>Autoclaved/Sterile</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical blade</td>
			<td>Feather</td>
			<td>08-916-5D</td>
			<td>Sterile</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T-25 flasks</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>10-126-9</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T-75 flasks&#160;</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>13-680-65</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue forceps</td>
			<td>Codman</td>
			<td>30-4218</td>
			<td>Autoclaved/Sterile</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue scissors</td>
			<td>RWD</td>
			<td>S12052-10</td>
			<td>Autoclaved/Sterile</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan Blue&#160;</td>
			<td>Thermofisher Sci&#160;</td>
			<td>15250-061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin (2.5%)</td>
			<td>ThermoFisher Sci</td>
			<td>15090046</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Widefield Immunofluorescence Microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

generating and co-culturing murine primary microglia and cortical neurons

الخلايا الدبقية الصغيرة هي بلاعم مقيمة في الأنسجة في الجهاز العصبي المركزي (CNS) ، تؤدي العديد من الوظائف التي تدعم صحة الخلايا العصبية وتوازن الجهاز العصبي المركزي. هم مجموعة كبيرة من الخلايا المناعية المرتبطة بنشاط مرض الجهاز العصبي المركزي ، واعتماد الأنماط الظاهرية التفاعلية التي من المحتمل أن تسهم في إصابة الخلايا العصبية أثناء الأمراض العصبية المزمنة مثل التصلب المتعدد (MS). لا تزال الآليات المتميزة التي تنظم بها الخلايا الدبقية الصغيرة وظيفة الخلايا العصبية والبقاء على قيد الحياة أثناء الصحة والمرض محدودة بسبب التحديات في حل التفاعلات المعقدة في الجسم الحي بين الخلايا الدبقية الصغيرة والخلايا العصبية والعوامل البيئية الأخرى في الجهاز العصبي المركزي. وبالتالي ، فإن النهج في المختبر للاستزراع المشترك للخلايا الدبقية الصغيرة والخلايا العصبية يظل أداة قيمة لدراسة التفاعلات العصبية الدبقية الصغيرة. هنا ، نقدم بروتوكولا لتوليد الخلايا الدبقية الصغيرة الأولية والخلايا العصبية من الفئران والمشاركة في استزراعها. على وجه التحديد ، تم عزل الخلايا الدبقية الصغيرة بعد 9-10 أيام في المختبر من ثقافة دبقية مختلطة تم إنشاؤها من متجانسات الدماغ المشتقة من الفئران الوليدية بين أيام ما بعد الولادة 0-2. تم عزل الخلايا العصبية من القشرة الدماغية لأجنة الفئران بين الأيام الجنينية 16-18. بعد 4-5 أيام في المختبر ، تم زرع الخلايا العصبية في 96 لوحة بئر ، تليها إضافة الخلايا الدبقية الصغيرة لتشكيل الثقافة المشتركة. يعد التوقيت الدقيق أمرا بالغ الأهمية لهذا البروتوكول حيث يحتاج كلا النوعين من الخلايا إلى الوصول إلى مرحلة النضج التجريبي لإنشاء الثقافة المشتركة. بشكل عام ، يمكن أن تكون هذه الثقافة المشتركة مفيدة لدراسة تفاعلات الخلايا العصبية الدبقية الصغيرة ويمكن أن توفر قراءات متعددة ، بما في ذلك الفحص المجهري المناعي ، والتصوير الحي ، وكذلك فحوصات الحمض النووي الريبي والبروتين.

Microglia are tissue-resident macrophages that facilitate immunosurveillance and homeostasis in the central nervous system (CNS)1,2,3. They originate from yolk sac erythromyeloid progenitor cells that colonize the brain during embryonic development4,5,6&#160;and are maintained throughout the organism&#39;s life span through self-renewal, which involves proliferation and apoptosis7. At steady-state, resting microglia have ramified morphology and engage in tissue surveillance8,9,10.
Microglia express numerous cell-surface receptors, which enables them to rapidly respond to changes in the CNS11,12 and to promote inflammatory responses in the event of infections or tissue injury12,13,14, as well as during neurodegenerative diseases9,15, such as&#160;multiple sclerosis (MS)16,17. Microglia also express receptors to various neurotransmitters and neuropeptides18,19,20, which suggests they may also respond to and regulate neuronal activity21,22. Indeed, microglia and neurons interact in various forms of bidirectional communication8,23 such as direct interactions mediated by membrane proteins or indirect interactions through soluble factors or intermediate cells23,24.
For instance, various neurotransmitters secreted by neurons can modulate the neuroprotective or inflammatory activity of microglia25,26,27. Additionally, direct interactions between neurons and microglia help to maintain microglia in a homeostatic state28. Conversely, direct interactions of microglia with neurons can shape neuronal circuitry29 and influence neuronal signaling30,31,32. As disruptions of these interactions induce hyperexcitability of neurons30 and&#160;microglia reactivity33,34, dysregulated microglia-neuronal interactions&#160;are implicated&#160;as a contributing factor to&#160;neurological diseases33,35. Indeed, psychotic23,26 and neurodegenerative diseases have been described to exhibit dysfunctional microglia-neuronal interactions33. While these observations highlight the importance of microglia-neuronal communication in the CNS, specific mechanisms of how these interactions regulate microglial and neuronal functions in health and disease are relatively unknown.
Within a complex milieu such as the CNS, multiple environmental factors can influence microglia-neuronal interactions, which limits the ability to study transient cellular interactions in vivo. Here, we present an in vitro microglia-neuronal co-culture system that can be used to study direct cellular interactions between microglia and neurons. This protocol describes the generation of primary microglia and neurons from the cortices of neonatal mice between post-natal days 0-2 and embryonic mice days 16-18, respectively. Neurons and microglia are then co-cultured in 96-well plates for downstream high-throughput experiments. We previously used this approach to demonstrate that microglia phagocytosis protects neurons from oxidized phosphatidylcholine mediated cell death37, suggesting that this method can help to understand the roles of microglia in the context of neurodegeneration and MS. Similarly, microglia-neuronal co-cultures may also be useful for investigating the impact of microglia-neuronal crosstalk in other contexts such as viral infections38 or neuronal injury and repair39. Overall, in vitro microglia-neuronal co-culture systems&#160;enable researchers to study microglia-neuronal interactions in a manipulatable and controlled environment, which complements in vivo models.

تسليط الضوء على المؤلف: نموذج الثقافة المشتركة في المختبر لدراسة التفاعلات العصبية الصغيرة في الحالات المرضية

توليد وزراعة الفئران الخلايا الدبقية الصغيرة الأولية والخلايا العصبية القشرية

Our research aims to investigate the interactions between neurons and microglia during disease conditions such as multiple sclerosis. We aim to recapitulate microglia neuronal interactions in vitro to better understand their functional importance in the CNS. We previously demonstrated that microglia phagocytosis protects neurons from oxidized phosphatidylcholine-mediated cell death with this co-culture.While other co-culture systems are also employed, this mixed culture system enables direct and close contact between microglia and neurons. In addition, it can remain healthy from 12 days to potentially three weeks, allowing for long-term studies of neuronal microglia interactions. Our protocol offers a simple and accessible method to co-culture microglia neurons that are easily manipulatable and can be further used in downstream assays to determine cellular functional changes.

يظهر مخطط انسيابي يوضح الخطوات الرئيسية لثقافة الخلايا الدبقية المختلطة للخلايا الدبقية الصغيرة في الشكل 1 أ. بشكل عام ، من المتوقع وجود خلايا متناثرة وحطام خلوي مفرط في اليوم الأول (الشكل 1 ب). بحلول اليوم 4 ، يجب ملاحظة زيادة عدد الخلايا ، خاصة مع توليد الخل...

يصف هذا البروتوكول ثقافة الخلايا الدبقية الصغيرة والخلايا العصبية المشتركة التي تم إنشاؤها من الخلايا العصبية الأولية المعزولة من أجنة الفئران في الأيام الجنينية 15-16 والخلايا الدبقية الصغيرة الأولية المتولدة من أدمغة الفئران حديثي الولادة في أيام ما بعد الولادة 1-2.

Microglia are tissue-resident macrophages of the central nervous system (CNS), performing numerous functions that support neuronal health and CNS ...

generating-co-culturing-murine-primary-microglia-cortical

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Generating and Co-culturing Murine Primary Microglia and Cortical Neurons

523 Views.  University of Saskatchewan. Our research aims to investigate the interactions between neurons and microglia during disease conditions such as multiple sclerosis. We aim to recapitulate microglia neuronal interactions in vitro to better understand their functional importance in the CNS. We previously demonstrated that microglia phagocytosis protects neurons from oxidized phosphatidylcholine-mediated cell death with this co-culture.While other co-culture systems are also employed, this mixed culture system enables ...