JP erkent financiële steun van de Natural Sciences and Engineering Research Council of Canada en het University of Saskatchewan College of Medicine. YD erkent financiële steun van het University of Saskatchewan College of Medicine Startup Fund, de Natural Sciences and Engineering Research Council of Canada Discovery Grant (RGPIN-2023-03659), MS Canada Catalyst Grant (1019973), Saskatchewan Health Research Foundation Establishment Grant (6368) en Brain Canada Foundation Future Leaders in Canadian Brain Research Grant. Figuur 1A, Figuur 2A en Figuur 3A zijn gemaakt met BioRender.com.

Alle dieren die in dit onderzoek werden gebruikt, werden gehuisvest en behandeld met goedkeuring van de University Animal Care Committee (UACC) van de University of Saskatchewan en de Canadian Council on Animal Care (CCAC). Voor dit onderzoek werden postnatale dagen 0-2 CD1 mannelijke en vrouwelijke muizen en embryonale dagen 16-18 (E16-18) embryo's van zwangere CD1-muizen gebruikt. De details van de reagentia en de gebruikte apparatuur staan vermeld in de materiaaltabel.
<stron...

 Primair microglia- en neuron-cocultuurprotocol voor onderzoeken naar CZS-interacties

De auteurs verklaren geen belangenconflicten.

Dit artikel beschrijft een protocol voor het isoleren en cultiveren van primaire neuronen en primaire microglia van muizen, die vervolgens worden gebruikt om een microglia-neuronale co-cultuur tot stand te brengen die kan worden gebruikt om te bestuderen hoe microglia- en neuroninteracties hun cellulaire gezondheid en functie reguleren. Deze relatief eenvoudige en toegankelijke benadering kan kritische inzichten verschaffen in de mechanismen en functionele resultaten van interacties tussen microglia-neuronen in het CZS.<...

Microglia zijn in het weefsel levende macrofagen die immunosurveillance en homeostase in het centrale zenuwstelsel (CZS) vergemakkelijken1,2,3. Ze zijn afkomstig van erytromyeloïde voorlopercellen van de dooierzak die de hersenen koloniseren tijdens de embryonale ontwikkeling 4,5,6 en worden gedurende de hele levensduur van het organisme in stand gehouden door zelfvernieuwing, wat proliferatie en apoptose met zich meebrengt7. In steady-state hebben rustende microglia een vertakte morfologie en houden ze zich bezig met weefselbewaking 8,9,10.
Microglia brengen talrijke receptoren op het celoppervlak tot expressie, waardoor ze snel kunnen reageren op veranderingen in het CZS11,12 en ontstekingsreacties kunnen bevorderen in geval van infecties of weefselbeschadiging 12,13,14, evenals tijdens neurodegeneratieve ziekten 9,15, zoals multiple sclerose (MS)16,17. Microglia brengen ook receptoren tot expressie voor verschillende neurotransmitters en neuropeptiden 18,19,20, wat suggereert dat ze ook kunnen reageren op neuronale activiteit en deze kunnen reguleren 21,22. Microglia en neuronen interageren inderdaad in verschillende vormen van bidirectionele communicatie 8,23, zoals directe interacties gemedieerd door membraaneiwitten of indirecte interacties via oplosbare factoren of tussenliggende cellen23,24.
Verschillende neurotransmitters die door neuronen worden uitgescheiden, kunnen bijvoorbeeld de neuroprotectieve of inflammatoire activiteit van microglia moduleren 25,26,27. Bovendien helpen directe interacties tussen neuronen en microglia om microglia in een homeostatische toestand te houden28. Omgekeerd kunnen directe interacties van microglia met neuronen neuronale circuits vormen29 en neuronale signalering beïnvloeden 30,31,32. Aangezien verstoringen van deze interacties hyperexcitabiliteit van neuronenveroorzaken 30 en microglia-reactiviteit33,34, worden ontregelde microglia-neuronale interacties geïmpliceerd als een bijdragende factor aan neurologische aandoeningen33,35. Er is inderdaad beschreven dat psychotische23,26 en neurodegeneratieve ziekten disfunctionele microglia-neuronale interacties vertonen33. Hoewel deze observaties het belang van microglia-neuronale communicatie in het CZS benadrukken, zijn specifieke mechanismen van hoe deze interacties microgliale en neuronale functies in gezondheid en ziekte reguleren relatief onbekend.
Binnen een complex milieu zoals het CZS kunnen meerdere omgevingsfactoren microglia-neuronale interacties beïnvloeden, wat het vermogen beperkt om voorbijgaande cellulaire interacties in vivo te bestuderen. Hier presenteren we een in vitro microglia-neuronaal co-cultuursysteem dat kan worden gebruikt om directe cellulaire interacties tussen microglia en neuronen te bestuderen. Dit protocol beschrijft de generatie van primaire microglia en neuronen uit de cortex van neonatale muizen tussen respectievelijk postnatale dagen 0-2 en embryonale muizen dag 16-18. Neuronen en microglia worden vervolgens samen gekweekt in platen met 96 putjes voor stroomafwaartse high-throughput-experimenten. We hebben deze benadering eerder gebruikt om aan te tonen dat microglia-fagocytose neuronen beschermt tegen geoxideerde fosfatidylcholine-gemedieerde celdood37, wat suggereert dat deze methode kan helpen om de rol van microglia in de context van neurodegeneratie en MS te begrijpen. Evenzo kunnen microglia-neuronale co-culturen ook nuttig zijn voor het onderzoeken van de impact van microglia-neuronale overspraak in andere contexten, zoals virale infecties38 of neuronaal letsel en herstel39. Over het algemeen stellen in vitro microglia-neuronale co-cultuursystemen onderzoekers in staat om microglia-neuronale interacties te bestuderen in een manipuleerbare en gecontroleerde omgeving, die een aanvulling vormt op in vivo modellen.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>10 cm Petri dish&#160;</td>
			<td>Fisher&#160;</td>
			<td>07-202-011</td>
			<td>Sterile</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1x Versene</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15040-066</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B-27 Plus Neuronal Culture System&#160;</td>
			<td>Gibco&#160;</td>
			<td>A3653401</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissection microscope</td>
			<td>VWR</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNase I</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11284932001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#8217;s Modified Eagle Medium (DMEM)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11960-044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum&#160;</td>
			<td>ThermoFisher Sci</td>
			<td>12483-020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HBSS (10x)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14065-056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hemacytometer</td>
			<td>Hausser Scientific</td>
			<td>1475</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES&#160;</td>
			<td>ThermoFisher Sci</td>
			<td>15630080</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leibovitz&#8217;s L-15 Medium (1x)</td>
			<td>Fisher Scientific&#160;</td>
			<td>21083027</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Macrophage colony stimulating factor&#160;</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>315-02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro-Forceps</td>
			<td>RWD</td>
			<td>F11020-11</td>
			<td>Autoclaved/Sterile</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Non-essential amino acids</td>
			<td>Cytiva</td>
			<td>SH3023801</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS (10x)</td>
			<td>ThermoFisher Sci</td>
			<td>AM9625</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin Streptomycin Glutamine (100x)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>103780-16</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-L-ornithine hydrobromide&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P3655-100MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium pyruvate (100 mM)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11360-070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spring scissors</td>
			<td>RWD</td>
			<td>S11008-42</td>
			<td>Autoclaved/Sterile</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical blade</td>
			<td>Feather</td>
			<td>08-916-5D</td>
			<td>Sterile</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T-25 flasks</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>10-126-9</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T-75 flasks&#160;</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>13-680-65</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue forceps</td>
			<td>Codman</td>
			<td>30-4218</td>
			<td>Autoclaved/Sterile</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue scissors</td>
			<td>RWD</td>
			<td>S12052-10</td>
			<td>Autoclaved/Sterile</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan Blue&#160;</td>
			<td>Thermofisher Sci&#160;</td>
			<td>15250-061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin (2.5%)</td>
			<td>ThermoFisher Sci</td>
			<td>15090046</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Widefield Immunofluorescence Microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

generating and co-culturing murine primary microglia and cortical neurons

Microglia zijn in weefsel levende macrofagen van het centrale zenuwstelsel (CZS), die tal van functies uitvoeren die de neuronale gezondheid en CZS-homeostase ondersteunen. Ze vormen een belangrijke populatie van immuuncellen die geassocieerd zijn met de ziekteactiviteit van het CZS en nemen reactieve fenotypes aan die mogelijk bijdragen aan neuronaal letsel tijdens chronische neurodegeneratieve ziekten zoals multiple sclerose (MS). De verschillende mechanismen waarmee microglia de neuronale functie en overleving tijdens gezondheid en ziekte reguleren, blijven beperkt vanwege uitdagingen bij het oplossen van de complexe in vivo interacties tussen microglia, neuronen en andere CZS-omgevingsfactoren. De in vitro benadering van het gelijktijdig kweken van microglia en neuronen blijft dus een waardevol hulpmiddel voor het bestuderen van microglia-neuronale interacties. Hier presenteren we een protocol om primaire microglia en neuronen van muizen te genereren en samen te kweken. In het bijzonder werden microglia na 9-10 dagen in vitro geïsoleerd uit een gemengde gliacultuur die was vastgesteld op basis van hersenhomogenaten afkomstig van neonatale muizen tussen postnatale dagen 0-2. Neuronale cellen werden geïsoleerd uit hersenschors van muizenembryo's tussen embryonale dagen 16-18. Na 4-5 dagen in vitro werden neuronale cellen gezaaid in platen met 96 putjes, gevolgd door de toevoeging van microglia om de co-cultuur te vormen. Zorgvuldige timing is van cruciaal belang voor dit protocol, aangezien beide celtypen experimentele rijpheid moeten bereiken om de co-cultuur tot stand te brengen. Over het algemeen kan deze co-cultuur nuttig zijn voor het bestuderen van interacties tussen microglia en neuronen en kan het meerdere uitlezingen bieden, waaronder immunofluorescentiemicroscopie, live beeldvorming en RNA- en eiwittests.

Microglia are tissue-resident macrophages that facilitate immunosurveillance and homeostasis in the central nervous system (CNS)1,2,3. They originate from yolk sac erythromyeloid progenitor cells that colonize the brain during embryonic development4,5,6&#160;and are maintained throughout the organism&#39;s life span through self-renewal, which involves proliferation and apoptosis7. At steady-state, resting microglia have ramified morphology and engage in tissue surveillance8,9,10.
Microglia express numerous cell-surface receptors, which enables them to rapidly respond to changes in the CNS11,12 and to promote inflammatory responses in the event of infections or tissue injury12,13,14, as well as during neurodegenerative diseases9,15, such as&#160;multiple sclerosis (MS)16,17. Microglia also express receptors to various neurotransmitters and neuropeptides18,19,20, which suggests they may also respond to and regulate neuronal activity21,22. Indeed, microglia and neurons interact in various forms of bidirectional communication8,23 such as direct interactions mediated by membrane proteins or indirect interactions through soluble factors or intermediate cells23,24.
For instance, various neurotransmitters secreted by neurons can modulate the neuroprotective or inflammatory activity of microglia25,26,27. Additionally, direct interactions between neurons and microglia help to maintain microglia in a homeostatic state28. Conversely, direct interactions of microglia with neurons can shape neuronal circuitry29 and influence neuronal signaling30,31,32. As disruptions of these interactions induce hyperexcitability of neurons30 and&#160;microglia reactivity33,34, dysregulated microglia-neuronal interactions&#160;are implicated&#160;as a contributing factor to&#160;neurological diseases33,35. Indeed, psychotic23,26 and neurodegenerative diseases have been described to exhibit dysfunctional microglia-neuronal interactions33. While these observations highlight the importance of microglia-neuronal communication in the CNS, specific mechanisms of how these interactions regulate microglial and neuronal functions in health and disease are relatively unknown.
Within a complex milieu such as the CNS, multiple environmental factors can influence microglia-neuronal interactions, which limits the ability to study transient cellular interactions in vivo. Here, we present an in vitro microglia-neuronal co-culture system that can be used to study direct cellular interactions between microglia and neurons. This protocol describes the generation of primary microglia and neurons from the cortices of neonatal mice between post-natal days 0-2 and embryonic mice days 16-18, respectively. Neurons and microglia are then co-cultured in 96-well plates for downstream high-throughput experiments. We previously used this approach to demonstrate that microglia phagocytosis protects neurons from oxidized phosphatidylcholine mediated cell death37, suggesting that this method can help to understand the roles of microglia in the context of neurodegeneration and MS. Similarly, microglia-neuronal co-cultures may also be useful for investigating the impact of microglia-neuronal crosstalk in other contexts such as viral infections38 or neuronal injury and repair39. Overall, in vitro microglia-neuronal co-culture systems&#160;enable researchers to study microglia-neuronal interactions in a manipulatable and controlled environment, which complements in vivo models.

Auteur in de schijnwerpers: In vitro co-cultuurmodel voor het bestuderen van microglia-neuronale interacties bij ziektetoestanden

Genereren en co-cultureren van primaire microglia en corticale neuronen van muizen

Our research aims to investigate the interactions between neurons and microglia during disease conditions such as multiple sclerosis. We aim to recapitulate microglia neuronal interactions in vitro to better understand their functional importance in the CNS. We previously demonstrated that microglia phagocytosis protects neurons from oxidized phosphatidylcholine-mediated cell death with this co-culture.While other co-culture systems are also employed, this mixed culture system enables direct and close contact between microglia and neurons. In addition, it can remain healthy from 12 days to potentially three weeks, allowing for long-term studies of neuronal microglia interactions. Our protocol offers a simple and accessible method to co-culture microglia neurons that are easily manipulatable and can be further used in downstream assays to determine cellular functional changes.

Een stroomdiagram met de belangrijkste stappen van de gemengde gliacultuur voor microglia is weergegeven in figuur 1A. Over het algemeen worden dunne cellen en overmatig cellulair afval verwacht op dag 1 (Figuur 1B). Tegen dag 4 moet een verhoogd aantal cellen worden waargenomen, vooral bij het genereren van aanhangende astrocyten, zoals aangegeven door hun langwerpige morfologie (Figuur 1C). Een paar microglia kunnen worden waargen...

Dit protocol beschrijft een microglia-neuronale co-cultuur die is opgezet uit primaire neuronale cellen geïsoleerd uit muizenembryo's op embryonale dagen 15-16 en primaire microglia gegenereerd uit de hersenen van neonatale muizen op postnatale dagen 1-2.

Microglia are tissue-resident macrophages of the central nervous system (CNS), performing numerous functions that support neuronal health and CNS ...

generating-co-culturing-murine-primary-microglia-cortical

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Generating and Co-culturing Murine Primary Microglia and Cortical Neurons

521 Views.  University of Saskatchewan. Our research aims to investigate the interactions between neurons and microglia during disease conditions such as multiple sclerosis. We aim to recapitulate microglia neuronal interactions in vitro to better understand their functional importance in the CNS. We previously demonstrated that microglia phagocytosis protects neurons from oxidized phosphatidylcholine-mediated cell death with this co-culture.While other co-culture systems are also employed, this mixed culture system enables ...