Name: מחבר זרקור: מודל תרבות משותפת במבחנה לחקר אינטראקציות מיקרוגליה-נוירונליות במצבי מחלה
Uploaded: 2024-07-26T15:00:00
Description: Microglia are tissue-resident macrophages of the central nervous system (CNS), performing numerous functions that support neuronal health and CNS ...

JP מודה במימון תמיכה ממועצת המחקר למדעי הטבע וההנדסה של קנדה והמכללה לרפואה של אוניברסיטת ססקצ'ואן. YD מודה בתמיכת מימון מקרן הסטארט-אפ של מכללת ססקצ'ואן לרפואה, מענק התגליות של מועצת המחקר למדעי הטבע וההנדסה של קנדה (RGPIN-2023-03659), מענק MS Canada Catalyst (1019973), מענק הקמת קרן מחקר הבריאות של ססקצ'ואן (6368) ומענק מנהיגי העתיד של קרן Brain Canada בקנדה לחקר המוח. איור 1A, איור 2A ואיור 3A נוצרו עם BioRender.com.

כל בעלי החיים ששימשו במחקר זה שוכנו וטופלו באישור הוועדה האוניברסיטאית לטיפול בבעלי חיים (UACC) של אוניברסיטת ססקצ'ואן והמועצה הקנדית לטיפול בבעלי חיים (CCAC). ימים לאחר הלידה 0-2 CD1 עכברים ונקבות זכר ונקבה וימים עובריים 16-18 (E16-18) עוברים מעכברות CD1 בהריון שימשו למחקר זה. פרטי הריאגנטים והציוד בו נ?...

 פרוטוקול ראשוני של תאי מיקרוגליה ותאי עצב למחקרי אינטראקציה של מערכת העצבים המרכזית

מאמר זה מתאר פרוטוקול לבידוד וטיפוח תאי עצב ראשוניים בעכברים ותאי מיקרוגליה ראשוניים, אשר משמשים לאחר מכן ליצירת תרבית משותפת של תאי מיקרוגליה-נוירונים שניתן להשתמש בהם כדי לחקור כיצד אינטראקציות מיקרוגליה ונוירונים מווסתות את בריאותם ותפקודם בתאים. גישה פשוטה ונגישה יחסית זו יכולה לספ...

מיקרוגליה הם מקרופאגים שוכני רקמות המאפשרים מעקב חיסוני והומאוסטזיס במערכת העצבים המרכזית (CNS)1,2,3. מקורם בתאי אב אריתרומיאלואידים של שק החלמון המאכלסים את המוח במהלך ההתפתחות העוברית 4,5,6 ונשמרים לאורך כל חיי האורגניזם באמצעות התחדשות עצמית, הכוללת התרבות ואפופטוזיס7. במצב יציב, תאי מיקרוגליה במנוחה הם בעלי מורפולוגיה מוגברת ועוסקים במעקב רקמות 8,9,10.
מיקרוגליה מבטאת קולטנים רבים לפני השטח של התא, מה שמאפשר להם להגיב במהירות לשינויים במערכת העצבים המרכזית11,12 ולקדם תגובות דלקתיות במקרה של זיהומים או פגיעה ברקמות 12,13,14, כמו גם במהלך מחלות נוירודגנרטיביות 9,15, כגון טרשת נפוצה (MS)16,17. מיקרוגליה גם מבטאת קולטנים למוליכים עצביים שונים ולנוירופפטידים 18,19,20, מה שמרמז שהם עשויים גם להגיב ולווסת את הפעילות העצבית 21,22. ואכן, מיקרוגליה ונוירונים מתקשרים בצורות שונות של תקשורת דו-כיוונית 8,23 כגון אינטראקציות ישירות בתיווך חלבוני ממברנה או אינטראקציות עקיפות באמצעות גורמים מסיסים או תאי ביניים23,24.
לדוגמה, מוליכים עצביים שונים המופרשים על ידי נוירונים יכולים לווסת את הפעילות הנוירופרוטקטיבית או הדלקתית של מיקרוגליה 25,26,27. בנוסף, אינטראקציות ישירות בין נוירונים למיקרוגליה עוזרות לשמור על תאי מיקרוגליה במצב הומיאוסטטי28. לעומת זאת, אינטראקציות ישירות של מיקרוגליה עם נוירונים יכולות לעצב מעגלים עצביים29 ולהשפיע על איתות עצבי 30,31,32. מכיוון שהפרעות באינטראקציות אלה גורמות להתרגשות יתר של נוירונים30 ותגובתיות מיקרוגליה 33,34, אינטראקציות מיקרוגליה-נוירונים לא מווסתות מעורבות כגורם תורם למחלות נוירולוגיות33,35. ואכן, מחלות פסיכוטיות23,26 ומחלות נוירודגנרטיביות תוארו כמציגות אינטראקציות מיקרוגליה-נוירונים לא מתפקדות33. בעוד שתצפיות אלה מדגישות את החשיבות של תקשורת מיקרוגליה-עצבית במערכת העצבים המרכזית, מנגנונים ספציפיים של האופן שבו אינטראקציות אלה מווסתות תפקודים מיקרוגליאליים ועצביים בבריאות ובמחלות אינם ידועים יחסית.
בסביבה מורכבת כמו מערכת העצבים המרכזית, גורמים סביבתיים מרובים יכולים להשפיע על אינטראקציות מיקרוגליה-נוירונים, מה שמגביל את היכולת לחקור אינטראקציות תאיות חולפות in vivo. במאמר זה אנו מציגים מערכת תרבית משותפת של תאי מיקרוגליה-נוירונים במבחנה שניתן להשתמש בה כדי לחקור אינטראקציות תאיות ישירות בין תאי מיקרוגליה לתאי עצב. פרוטוקול זה מתאר את היצירה של תאי מיקרוגליה ראשוניים ותאי עצב מקליפת המוח של עכברים ילודים בין ימים 0-2 לאחר הלידה לבין ימים 16-18 של עכברים עובריים, בהתאמה. תאי עצב ותאי מיקרוגליה מתורבתים במשותף בלוחות של 96 בארות לצורך ניסויים במורד הזרם, בעלי תפוקה גבוהה. בעבר השתמשנו בגישה זו כדי להדגים כי פגוציטוזה של מיקרוגליה מגנה על תאי עצב מפני מוות תאי מתווך של פוספטידילכולין מחומצן37, מה שמרמז על כך ששיטה זו יכולה לסייע בהבנת תפקידי תאי מיקרוגליה בהקשר של ניוון עצבי וטרשת נפוצה. באופן דומה, תרביות מיקרו-נוירונים עשויות להיות שימושיות גם לחקר ההשפעה של דיבור צולב מיקרוגליה-עצבי בהקשרים אחרים כגון זיהומים ויראליים38 או פגיעה עצבית ותיקון39. בסך הכל, מערכות תרבית משותפת של תאי מיקרוגליה-נוירונים במבחנה מאפשרות לחוקרים לחקור אינטראקציות מיקרוגליה-נוירונים בסביבה מניפולטיבית ומבוקרת, אשר משלימה מודלים in vivo.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>10 cm Petri dish&#160;</td>
			<td>Fisher&#160;</td>
			<td>07-202-011</td>
			<td>Sterile</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1x Versene</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15040-066</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B-27 Plus Neuronal Culture System&#160;</td>
			<td>Gibco&#160;</td>
			<td>A3653401</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissection microscope</td>
			<td>VWR</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNase I</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11284932001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#8217;s Modified Eagle Medium (DMEM)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11960-044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum&#160;</td>
			<td>ThermoFisher Sci</td>
			<td>12483-020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HBSS (10x)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14065-056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hemacytometer</td>
			<td>Hausser Scientific</td>
			<td>1475</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES&#160;</td>
			<td>ThermoFisher Sci</td>
			<td>15630080</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leibovitz&#8217;s L-15 Medium (1x)</td>
			<td>Fisher Scientific&#160;</td>
			<td>21083027</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Macrophage colony stimulating factor&#160;</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>315-02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro-Forceps</td>
			<td>RWD</td>
			<td>F11020-11</td>
			<td>Autoclaved/Sterile</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Non-essential amino acids</td>
			<td>Cytiva</td>
			<td>SH3023801</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS (10x)</td>
			<td>ThermoFisher Sci</td>
			<td>AM9625</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin Streptomycin Glutamine (100x)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>103780-16</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-L-ornithine hydrobromide&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P3655-100MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium pyruvate (100 mM)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11360-070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spring scissors</td>
			<td>RWD</td>
			<td>S11008-42</td>
			<td>Autoclaved/Sterile</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical blade</td>
			<td>Feather</td>
			<td>08-916-5D</td>
			<td>Sterile</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T-25 flasks</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>10-126-9</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T-75 flasks&#160;</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>13-680-65</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue forceps</td>
			<td>Codman</td>
			<td>30-4218</td>
			<td>Autoclaved/Sterile</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue scissors</td>
			<td>RWD</td>
			<td>S12052-10</td>
			<td>Autoclaved/Sterile</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan Blue&#160;</td>
			<td>Thermofisher Sci&#160;</td>
			<td>15250-061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin (2.5%)</td>
			<td>ThermoFisher Sci</td>
			<td>15090046</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Widefield Immunofluorescence Microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

generating and co-culturing murine primary microglia and cortical neurons

מיקרוגליה הם מקרופאגים שוכנים ברקמה של מערכת העצבים המרכזית (CNS), המבצעים פונקציות רבות התומכות בבריאות העצבית והומאוסטזיס CNS. הם אוכלוסייה עיקרית של תאי חיסון הקשורים לפעילות מחלת CNS, ומאמצים פנוטיפים תגובתיים שעלולים לתרום לפגיעה עצבית במהלך מחלות נוירודגנרטיביות כרוניות כגון טרשת נפוצה (MS). המנגנונים הייחודיים שבאמצעותם תאי מיקרוגליה מווסתים את התפקוד העצבי ואת הישרדותו במהלך בריאות ומחלות נותרו מוגבלים עקב אתגרים בפתרון האינטראקציות המורכבות in vivo בין מיקרוגליה, נוירונים וגורמים סביבתיים אחרים במערכת העצבים המרכזית. לפיכך, גישת ה-in vitro של תרבית משותפת של תאי מיקרוגליה ונוירונים נותרה כלי רב ערך לחקר אינטראקציות מיקרוגליה-נוירונים. כאן, אנו מציגים פרוטוקול ליצירה ולתרבית משותפת של תאי מיקרוגליה ראשוניים ותאי עצב מעכברים. באופן ספציפי, תאי מיקרוגליה בודדו לאחר 9-10 ימים במבחנה מתרבית גליה מעורבת שהוקמה מהומוגנטים במוח שמקורם בעכברים ילודים בין הימים שלאחר הלידה 0-2. תאי עצב בודדו מקליפות המוח של עוברי עכברים בין הימים 16-18. לאחר 4-5 ימים במבחנה, תאי עצב נזרעו בצלחות 96 באר, ולאחר מכן תוספת של מיקרוגליה כדי ליצור את התרבות המשותפת. תזמון זהיר הוא קריטי עבור פרוטוקול זה מכיוון ששני סוגי התאים צריכים להגיע לבשלות ניסויית כדי לבסס את התרבית המשותפת. בסך הכל, תרבית משותפת זו יכולה להיות שימושית לחקר אינטראקציות מיקרוגליה-נוירון ויכולה לספק קריאות מרובות, כולל מיקרוסקופ אימונופלואורסצנטי, הדמיה חיה, כמו גם בדיקות RNA וחלבונים.

Microglia are tissue-resident macrophages that facilitate immunosurveillance and homeostasis in the central nervous system (CNS)1,2,3. They originate from yolk sac erythromyeloid progenitor cells that colonize the brain during embryonic development4,5,6&#160;and are maintained throughout the organism&#39;s life span through self-renewal, which involves proliferation and apoptosis7. At steady-state, resting microglia have ramified morphology and engage in tissue surveillance8,9,10.
Microglia express numerous cell-surface receptors, which enables them to rapidly respond to changes in the CNS11,12 and to promote inflammatory responses in the event of infections or tissue injury12,13,14, as well as during neurodegenerative diseases9,15, such as&#160;multiple sclerosis (MS)16,17. Microglia also express receptors to various neurotransmitters and neuropeptides18,19,20, which suggests they may also respond to and regulate neuronal activity21,22. Indeed, microglia and neurons interact in various forms of bidirectional communication8,23 such as direct interactions mediated by membrane proteins or indirect interactions through soluble factors or intermediate cells23,24.
For instance, various neurotransmitters secreted by neurons can modulate the neuroprotective or inflammatory activity of microglia25,26,27. Additionally, direct interactions between neurons and microglia help to maintain microglia in a homeostatic state28. Conversely, direct interactions of microglia with neurons can shape neuronal circuitry29 and influence neuronal signaling30,31,32. As disruptions of these interactions induce hyperexcitability of neurons30 and&#160;microglia reactivity33,34, dysregulated microglia-neuronal interactions&#160;are implicated&#160;as a contributing factor to&#160;neurological diseases33,35. Indeed, psychotic23,26 and neurodegenerative diseases have been described to exhibit dysfunctional microglia-neuronal interactions33. While these observations highlight the importance of microglia-neuronal communication in the CNS, specific mechanisms of how these interactions regulate microglial and neuronal functions in health and disease are relatively unknown.
Within a complex milieu such as the CNS, multiple environmental factors can influence microglia-neuronal interactions, which limits the ability to study transient cellular interactions in vivo. Here, we present an in vitro microglia-neuronal co-culture system that can be used to study direct cellular interactions between microglia and neurons. This protocol describes the generation of primary microglia and neurons from the cortices of neonatal mice between post-natal days 0-2 and embryonic mice days 16-18, respectively. Neurons and microglia are then co-cultured in 96-well plates for downstream high-throughput experiments. We previously used this approach to demonstrate that microglia phagocytosis protects neurons from oxidized phosphatidylcholine mediated cell death37, suggesting that this method can help to understand the roles of microglia in the context of neurodegeneration and MS. Similarly, microglia-neuronal co-cultures may also be useful for investigating the impact of microglia-neuronal crosstalk in other contexts such as viral infections38 or neuronal injury and repair39. Overall, in vitro microglia-neuronal co-culture systems&#160;enable researchers to study microglia-neuronal interactions in a manipulatable and controlled environment, which complements in vivo models.

מחבר זרקור: מודל תרבות משותפת במבחנה לחקר אינטראקציות מיקרוגליה-נוירונליות במצבי מחלה

יצירה וטיפוח משותף של תאי מיקרוגליה ראשוניים של מורין ונוירונים קורטיקליים

Our research aims to investigate the interactions between neurons and microglia during disease conditions such as multiple sclerosis. We aim to recapitulate microglia neuronal interactions in vitro to better understand their functional importance in the CNS. We previously demonstrated that microglia phagocytosis protects neurons from oxidized phosphatidylcholine-mediated cell death with this co-culture.While other co-culture systems are also employed, this mixed culture system enables direct and close contact between microglia and neurons. In addition, it can remain healthy from 12 days to potentially three weeks, allowing for long-term studies of neuronal microglia interactions. Our protocol offers a simple and accessible method to co-culture microglia neurons that are easily manipulatable and can be further used in downstream assays to determine cellular functional changes.

תרשים זרימה שמראה את השלבים העיקריים של תרבית גליה מעורבת עבור מיקרוגליה מוצג באיור 1A. באופן כללי, תאים דלילים ופסולת תאית מוגזמת צפויים ביום הראשון (איור 1B). ביום ה-4 יש לראות עלייה במספר התאים, במיוחד עם יצירת אסטרוציטים דבקים, כפי שמצוין על-ידי המורפולוגיה...

פרוטוקול זה מתאר תרבית מיקרוגליה-נוירונים שנוצרה מתאים עצביים ראשוניים שבודדו מעוברי עכברים בימים עובריים 15-16 ומתאי מיקרוגליה ראשוניים שנוצרו ממוחם של עכברים ילודים בימים 1-2 שלאחר הלידה.

Microglia are tissue-resident macrophages of the central nervous system (CNS), performing numerous functions that support neuronal health and CNS ...

generating-co-culturing-murine-primary-microglia-cortical

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Generating and Co-culturing Murine Primary Microglia and Cortical Neurons

Microglia are tissue-resident macrophages of the central nervous system (CNS), performing numerous functions that support neuronal health and CNS homeostasis. They are a major population of immune cells associated with CNS disease activity, adopting&#160;reactive phenotypes that potentially contribute to neuronal injury during chronic neurodegenerative diseases such as multiple sclerosis (MS). The distinct mechanisms by which microglia regulate neuronal function and survival during health and disease remain limited due to challenges in resolving the complex in vivo interactions between microglia, neurons, and other CNS environmental factors. Thus, the in vitro approach of co-culturing microglia and neurons remains a valuable tool for studying microglia-neuronal interactions. Here, we present a protocol to generate and co-culture primary microglia and neurons from mice. Specifically, microglia were isolated after 9-10 days in vitro from a mixed glia culture established from brain homogenates derived from neonatal mice between post-natal days 0-2. Neuronal cells were isolated from brain cortices of mouse embryos between embryonic days 16-18. After 4-5 days in vitro, neuronal cells were seeded in 96-well plates, followed by the addition of microglia to form the co-culture. Careful timing is critical for this protocol as both cell types need to reach experimental maturity to establish the co-culture. Overall, this co-culture can be useful for studying microglia-neuron interactions and can provide multiple readouts, including immunofluorescence microscopy, live imaging, as well as RNA and protein assays.

This protocol describes a microglia-neuronal co-culture established from primary neuronal cells isolated from mouse embryos at embryonic days 15-16 and primary microglia generated from the brains of neonatal mice at post-natal days 1-2.

Brain Isolation from Neonatal Mice for Primary Microglia Culture

To begin, add 5 milliliters of 10 micrograms per milliliter Poly-L-ornithine hydrobromide to each T75 flask. Incubate at 37 degrees Celsius in a 5%carbon dioxide incubator for at least one hour. After decapitating the mouse, gently hold the head and create a midline incision in the cranium, starting from the neck to the nose.Peel the skull back with tissue forceps to reveal the brain. To scoop the brain out, insert the tissue forceps under the brain, and lift the brain out from the head. After placing the brain into a Petri dish containing 20 milliliters of Leibovitz's L-15 media under a dissection microscope, using a pair of micro-forceps, carefully remove the brainstem and the meninges.Collect the brains in a 50-milliliter conical tube containing 5 milliliters of Leibovitz's L15 media.

בידוד מוחי מעכברי יילודים לתרבית מיקרוגליה ראשונית

Preparing and Maintaining Mixed Glia Culture Derived from Neonatal Mice Brains

To begin, mince the isolated brains into approximately one-square-millimeter pieces with a sterile disposable scalpel blade. Carefully transfer the minced brains into a new sterile 50 milliliter tube. Add a final concentration of 0.25%trypsin to the minced brains.Incubate the tissue in a 37-degrees-Celsius water bath for 20 minutes. Add five milliliters of complete glia culture media to neutralize the trypsin and gently mix the tissue suspension using a 10 milliliter pipette. Carefully decant the cell suspension through the cell strainer.Then remove the plunger from a sterile one-milliliter syringe and grind the tissue into the mesh using the plunger. Add equal volumes of cell suspension containing one to two brains with glia culture media to each flask resulting in a final volume of 15 milliliters. Sparse cells and excessive cellular debris were observed on day one.By day four, adherent astrocytes were generated. Confluent cells with typical astrocyte morphology were observed by day eight of culture.

הכנה ותחזוקה של תרבית גליה מעורבת שמקורה במוחות עכברים ילודים

Isolating Brains from E16-E18 Mouse Embryos for Primary Neuron Culture

Begin by coating T25 flasks with five milliliters of 10 micrograms per milliliter poly-L-ornithine, and incubate them. To isolate the brain from mouse embryos, lift the skin of the euthanized pregnant mouse's lower abdomen with tissue forceps. Using dissection scissors, perform a V-shaped incision from this point to the lower rib cage.Grab the uterine horns containing the embryos with tissue forceps, and gently remove the embryos from the abdominal cavity. Using spring scissors, create a midline incision at the top of the skull, starting from the back of the neck to the nose. Lift the skull away from the incision site to reveal the brain.Gently scoop out the brain with tissue forceps and transfer the brain to a 10 centimeter Petri dish containing 15 milliliters of Hanks'balanced salt solution. Under a dissection microscope, carefully remove the brainstem and the meninges on both sides of the brain cortices with a pair of micro forceps.

בידוד מוחות מעוברי עכברים E16-E18 לתרבית נוירונים ראשונית

Brain Dissociation and Seeding of Cortical Neurons in Cell Culture 

To begin, mince the isolated brains into pieces in the 50-milliliter conical tube with a sterile disposable scalpel blade. Add trypsin to the tube at a final concentration of 0.25%Immerse the tube in a 35 to 38 degrees Celsius hot water bath for 15 minutes. Gently pipette the tissue suspension up and down to dissociate cells.Then add 0.5 milliliters of fetal bovine serum to the homogenized suspension to neutralize trypsin activity. Filter the cell suspension through the 70-micrometer nylon mesh cell strainer. Using a one-milliliter syringe plunger, gently grind the tissue into the cell strainer.Then centrifuge the conical tube at 300 g for five minutes at four degrees Celsius. Discard the Poly-L-Ornithine in the T25 flasks and rinse the flasks three times with five milliliters of PBS. Carefully decant the tube to remove the supernatant and resuspend the cell pellet by gently pipetting with two to three milliliters of complete neurobasal media.Plate the cells in the Poly-L-Ornithine-coated T25 flasks with approximately 20 million cells per flask in five milliliters of complete neurobasal media. Incubate the cell culture at 37 degrees Celsius in a 5%carbon dioxide incubator. Neurons in T25 flasks and 96-well plates adhered and formed neurite processes by day three.Suboptimal neuron cultures contained cell clumps and debris.

דיסוציאציה מוחית וזריעה של נוירונים קורטיקליים בתרבית תאים 

Co-Culture of Primary Neurons and Microglia for Studying Microglia-Neuron Interactions

To begin, take neurons grown in T25 flasks for co-culture. Replace the media with five milliliters of versene solution containing trypsin and Dnase I.Add 0.5 milliliters of fetal bovine serum to neutralize the trypsin and Dnase I.Transfer cells to a 15 milliliter conical tube. Wash the flask with five milliliters of complete neurobasal media once to maximize the collected neurons.Then, centrifuge the cell suspension at 300 G for five minutes at four degrees celsius. After discarding the supernatant, gently resuspend the cell pellet in two to three milliliters of complete neurobasal media. Seed 100 microliters of the cell suspension to each well to obtain 75, 000 neurons per well, between eight to 10 days of mixed glia cultivation.Using a 10 milliliter pipette, gently wash the T75 flasks with glia culture media to collect microglia and transfer the cells and media into a sterile 50 milliliter conical tube. Centrifuge the cell collection at 300 G for five minutes at four degrees celsius. Once the supernatant is removed, gently resuspend the pellet in two milliliters of complete neurobasal media.From the 96-well neuronal culture plate, remove 100 microliters of neurobasal media and add 100 microliters of 250, 000 cells per milliliter cell suspension. In co-culture round and large microglia were observed on top or between neurons and neurite processes.