Name: लेखक स्पॉटलाइट: रोग की स्थिति में माइक्रोग्लिया-न्यूरोनल इंटरैक्शन का अध्ययन करने के लिए इन विट्रो सह-संस्कृति मॉडल में
Uploaded: 2024-07-26T15:00:00
Description: Microglia are tissue-resident macrophages of the central nervous system (CNS), performing numerous functions that support neuronal health and CNS ...

जेपी कनाडा के प्राकृतिक विज्ञान और इंजीनियरिंग अनुसंधान परिषद और सस्केचेवान कॉलेज ऑफ मेडिसिन विश्वविद्यालय से वित्त पोषण सहायता को स्वीकार करता है। YD यूनिवर्सिटी ऑफ सस्केचेवान कॉलेज ऑफ मेडिसिन स्टार्टअप फंड, नेचुरल साइंसेज एंड इंजीनियरिंग रिसर्च काउंसिल ऑफ कनाडा डिस्कवरी ग्रांट (RGPIN-2023-03659), MS कनाडा कैटलिस्ट ग्रांट (1019973), सस्केचेवान हेल्थ रिसर्च फाउंडेशन एस्टेब्लिशमेंट ग्रांट (6368), और ब्रेन कनाडा फाउंडेशन फ्यूचर लीडर्स इन कैनेडियन ब्रेन रिसर्च ग्रांट से फंडिंग सपोर्ट को स्वीकार करता है। चित्रा 1 ए, चित्रा 2 ए, और चित्रा 3 ए BioRender.com के साथ बनाए गए थे।

इस अध्ययन में इस्तेमाल सभी जानवरों को सस्केचेवान विश्वविद्यालय के विश्वविद्यालय पशु देखभाल समिति (यूएसीसी) और पशु देखभाल पर कनाडाई परिषद (सीसीएसी) से अनुमोदन के साथ रखा और संभाला गया था। प्रसवोत्तर द?...

 सीएनएस इंटरैक्शन अध्ययन के लिए प्राथमिक माइक्रोग्लिया और न्यूरॉन सह-संस्कृति प्रोटोकॉल

यह आलेख माउस प्राथमिक न्यूरॉन्स और प्राथमिक माइक्रोग्लिया को अलग करने और संवर्धन करने के लिए एक प्रोटोकॉल का वर्णन करता है, जो बाद में एक माइक्रोग्लिया-न्यूरोनल सह-संस्कृति स्थापित करने के लिए उपयोग ?...

माइक्रोग्लिया ऊतक-निवासी मैक्रोफेज हैं जो केंद्रीय तंत्रिका तंत्र (सीएनएस)1,2,3में इम्यूनोसर्विलांस और होमियोस्टेसिस की सुविधा प्रदान करते हैं। वे जर्दी थैली एरिथ्रोमाइलॉइड पूर्वज कोशिकाओं से उत्पन्न होते हैं जो भ्रूण के विकास 4,5,6 के दौरान मस्तिष्क को उपनिवेशित करते हैं और आत्म-नवीकरण के माध्यम से जीव के जीवन काल में बनाए रखा जाता है, जिसमें प्रसार और एपोप्टोसिस7 शामिल है। स्थिर अवस्था में, आराम करने वाले माइक्रोग्लिया ने आकृति विज्ञान को प्रभावित किया है और ऊतक निगरानी 8,9,10में संलग्न है।
माइक्रोग्लिया कई सेल सतह रिसेप्टर्स, जो उन्हें तेजी से सीएनएस11,12 में परिवर्तन का जवाब करने के लिए और संक्रमण या ऊतकचोट 12,13,14 की स्थिति में भड़काऊ प्रतिक्रियाओं को बढ़ावा देने के लिए सक्षम बनाता है, साथ ही साथ न्यूरोडीजेनेरेटिव रोगों 9,15 के दौरान, इस तरह के मल्टीपल स्केलेरोसिस (एमएस)16,17 के दौरान. माइक्रोग्लिया भी विभिन्न न्यूरोट्रांसमीटर और न्यूरोपैप्टाइड्स 18,19,20 के लिए रिसेप्टर्स व्यक्त करते हैं, जो बताता है कि वे न्यूरोनल गतिविधि21,22का जवाब और विनियमन भी कर सकते हैं। दरअसल, माइक्रोग्लिया और न्यूरॉन्स द्विदिश संचार 8,23 के विभिन्न रूपों में बातचीत करते हैं जैसे झिल्ली प्रोटीन द्वारा मध्यस्थता की गई प्रत्यक्ष बातचीत या घुलनशील कारकों या मध्यवर्ती कोशिकाओं23,24के माध्यम से अप्रत्यक्ष बातचीत।
उदाहरण के लिए, न्यूरॉन्स द्वारा स्रावित विभिन्न न्यूरोट्रांसमीटर माइक्रोग्लिया25,26,27की न्यूरोप्रोटेक्टिव या भड़काऊ गतिविधि को संशोधित कर सकते हैं। इसके अतिरिक्त, न्यूरॉन्स और माइक्रोग्लिया के बीच प्रत्यक्ष बातचीत एक होमोस्टेटिक राज्य28 में माइक्रोग्लिया को बनाए रखने में मदद करती है। इसके विपरीत, न्यूरॉन्स के साथ माइक्रोग्लिया की प्रत्यक्ष बातचीत न्यूरोनल सर्किटरी29 को आकार दे सकती है और न्यूरोनल सिग्नलिंग30,31,32को प्रभावित कर सकती है। इन बातचीत के व्यवधान न्यूरॉन्स30 और माइक्रोग्लिया प्रतिक्रियाशीलता 33,34 की hyperexcitability प्रेरित के रूप में, dysregulated माइक्रोग्लिया-neuronal बातचीत न्यूरोलॉजिकल रोगों33,35 के लिए एक योगदान कारक के रूप में फंसाया जाता है. दरअसल, मनोवैज्ञानिक23,26 और neurodegenerative रोगों बेकार माइक्रोग्लिया-neuronal बातचीत33 प्रदर्शित करने के लिए वर्णित किया गया है. हालांकि ये अवलोकन सीएनएस में माइक्रोग्लिया-न्यूरोनल संचार के महत्व को उजागर करते हैं, लेकिन स्वास्थ्य और बीमारी में माइक्रोग्लियल और न्यूरोनल कार्यों को नियंत्रित करने के लिए ये इंटरैक्शन कैसे नियंत्रित करते हैं, इसके विशिष्ट तंत्र अपेक्षाकृत अज्ञात हैं।
सीएनएस जैसे जटिल परिवेश के भीतर, कई पर्यावरणीय कारक माइक्रोग्लिया-न्यूरोनल इंटरैक्शन को प्रभावित कर सकते हैं, जो विवो में क्षणिक सेलुलर इंटरैक्शन का अध्ययन करने की क्षमता को सीमित करता है। यहां, हम इन विट्रो माइक्रोग्लिया-न्यूरोनल सह-संस्कृति प्रणाली में प्रस्तुत करते हैं जिसका उपयोग माइक्रोग्लिया और न्यूरॉन्स के बीच प्रत्यक्ष सेलुलर इंटरैक्शन का अध्ययन करने के लिए किया जा सकता है। यह प्रोटोकॉल क्रमशः प्रसवोत्तर दिनों 0-2 और भ्रूण चूहों के दिनों 16-18 के बीच नवजात चूहों के कॉर्टिस से प्राथमिक माइक्रोग्लिया और न्यूरॉन्स की पीढ़ी का वर्णन करता है। न्यूरॉन्स और माइक्रोग्लिया तो बहाव उच्च throughput प्रयोगों के लिए 96 अच्छी तरह से प्लेटों में सह सुसंस्कृत हैं. हमने पहले इस दृष्टिकोण का उपयोग यह प्रदर्शित करने के लिए किया था कि माइक्रोग्लिया फागोसाइटोसिस न्यूरॉन्स को ऑक्सीकृत फॉस्फेटिडिलकोलाइन मध्यस्थताकोशिका मृत्यु 37 से बचाता है, यह सुझाव देता है कि यह विधि न्यूरोडीजेनेरेशन और एमएस के संदर्भ में माइक्रोग्लिया की भूमिकाओं को समझने में मदद कर सकती है। इसी तरह, माइक्रोग्लिया-न्यूरोनल सह-संस्कृतियां वायरल संक्रमण38 या न्यूरोनल चोट जैसे अन्य संदर्भों में माइक्रोग्लिया-न्यूरोनल क्रॉसस्टॉक के प्रभाव की जांच के लिए भी उपयोगी हो सकती हैं और39 की मरम्मत कर सकती हैं। कुल मिलाकर, इन विट्रो माइक्रोग्लिया-न्यूरोनल सह-संस्कृति प्रणालियों में शोधकर्ताओं को एक जोड़ तोड़ और नियंत्रित वातावरण में माइक्रोग्लिया-न्यूरोनल इंटरैक्शन का अध्ययन करने में सक्षम बनाता है, जो विवो मॉडल में पूरक है।

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>10 cm Petri dish&#160;</td>
			<td>Fisher&#160;</td>
			<td>07-202-011</td>
			<td>Sterile</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1x Versene</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15040-066</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B-27 Plus Neuronal Culture System&#160;</td>
			<td>Gibco&#160;</td>
			<td>A3653401</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissection microscope</td>
			<td>VWR</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNase I</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11284932001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#8217;s Modified Eagle Medium (DMEM)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11960-044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum&#160;</td>
			<td>ThermoFisher Sci</td>
			<td>12483-020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HBSS (10x)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14065-056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hemacytometer</td>
			<td>Hausser Scientific</td>
			<td>1475</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES&#160;</td>
			<td>ThermoFisher Sci</td>
			<td>15630080</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leibovitz&#8217;s L-15 Medium (1x)</td>
			<td>Fisher Scientific&#160;</td>
			<td>21083027</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Macrophage colony stimulating factor&#160;</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>315-02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro-Forceps</td>
			<td>RWD</td>
			<td>F11020-11</td>
			<td>Autoclaved/Sterile</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Non-essential amino acids</td>
			<td>Cytiva</td>
			<td>SH3023801</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS (10x)</td>
			<td>ThermoFisher Sci</td>
			<td>AM9625</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin Streptomycin Glutamine (100x)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>103780-16</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-L-ornithine hydrobromide&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P3655-100MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium pyruvate (100 mM)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11360-070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spring scissors</td>
			<td>RWD</td>
			<td>S11008-42</td>
			<td>Autoclaved/Sterile</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical blade</td>
			<td>Feather</td>
			<td>08-916-5D</td>
			<td>Sterile</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T-25 flasks</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>10-126-9</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T-75 flasks&#160;</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>13-680-65</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue forceps</td>
			<td>Codman</td>
			<td>30-4218</td>
			<td>Autoclaved/Sterile</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue scissors</td>
			<td>RWD</td>
			<td>S12052-10</td>
			<td>Autoclaved/Sterile</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan Blue&#160;</td>
			<td>Thermofisher Sci&#160;</td>
			<td>15250-061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin (2.5%)</td>
			<td>ThermoFisher Sci</td>
			<td>15090046</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Widefield Immunofluorescence Microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

generating and co-culturing murine primary microglia and cortical neurons

माइक्रोग्लिया केंद्रीय तंत्रिका तंत्र (सीएनएस) के ऊतक-निवासी मैक्रोफेज हैं, जो न्यूरोनल स्वास्थ्य और सीएनएस होमियोस्टेसिस का समर्थन करने वाले कई कार्य करते हैं। वे सीएनएस रोग गतिविधि से जुड़ी प्रतिरक्षा कोशिकाओं की एक प्रमुख आबादी हैं, प्रतिक्रियाशील फेनोटाइप को अपनाते हैं जो संभावित रूप से मल्टीपल स्केलेरोसिस (एमएस) जैसे क्रोनिक न्यूरोडीजेनेरेटिव रोगों के दौरान न्यूरोनल चोट में योगदान करते हैं। अलग-अलग तंत्र जिसके द्वारा माइक्रोग्लिया न्यूरोनल फ़ंक्शन को विनियमित करता है और स्वास्थ्य और बीमारी के दौरान जीवित रहता है, माइक्रोग्लिया, न्यूरॉन्स और अन्य सीएनएस पर्यावरणीय कारकों के बीच विवो इंटरैक्शन में जटिल को हल करने में चुनौतियों के कारण सीमित रहता है। इस प्रकार, माइक्रोग्लिया और न्यूरॉन्स के सह-संवर्धन के इन विट्रो दृष्टिकोण माइक्रोग्लिया-न्यूरोनल इंटरैक्शन का अध्ययन करने के लिए एक मूल्यवान उपकरण बना हुआ है। यहां, हम चूहों से प्राथमिक माइक्रोग्लिया और न्यूरॉन्स उत्पन्न करने और सह-संस्कृति करने के लिए एक प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं। विशेष रूप से, माइक्रोग्लिया को प्रसवोत्तर दिनों 0-2 के बीच नवजात चूहों से प्राप्त मस्तिष्क समरूप से स्थापित मिश्रित ग्लिया संस्कृति से इन विट्रो में 9-10 दिनों के बाद अलग किया गया था। न्यूरोनल कोशिकाओं भ्रूण दिन 16-18 के बीच माउस भ्रूण के मस्तिष्क cortices से अलग थे. इन विट्रो में 4-5 दिनों के बाद, न्यूरोनल कोशिकाओं को 96-अच्छी प्लेटों में वरीयता दी गई थी, इसके बाद सह-संस्कृति बनाने के लिए माइक्रोग्लिया के अतिरिक्त किया गया था। सावधान समय इस प्रोटोकॉल के लिए महत्वपूर्ण है के रूप में दोनों प्रकार के सेल सह संस्कृति स्थापित करने के लिए प्रयोगात्मक परिपक्वता तक पहुँचने की जरूरत है. कुल मिलाकर, यह सह-संस्कृति माइक्रोग्लिया-न्यूरॉन इंटरैक्शन का अध्ययन करने के लिए उपयोगी हो सकती है और इम्यूनोफ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोपी, लाइव इमेजिंग, साथ ही आरएनए और प्रोटीन परख सहित कई रीडआउट प्रदान कर सकती है।

Microglia are tissue-resident macrophages that facilitate immunosurveillance and homeostasis in the central nervous system (CNS)1,2,3. They originate from yolk sac erythromyeloid progenitor cells that colonize the brain during embryonic development4,5,6&#160;and are maintained throughout the organism&#39;s life span through self-renewal, which involves proliferation and apoptosis7. At steady-state, resting microglia have ramified morphology and engage in tissue surveillance8,9,10.
Microglia express numerous cell-surface receptors, which enables them to rapidly respond to changes in the CNS11,12 and to promote inflammatory responses in the event of infections or tissue injury12,13,14, as well as during neurodegenerative diseases9,15, such as&#160;multiple sclerosis (MS)16,17. Microglia also express receptors to various neurotransmitters and neuropeptides18,19,20, which suggests they may also respond to and regulate neuronal activity21,22. Indeed, microglia and neurons interact in various forms of bidirectional communication8,23 such as direct interactions mediated by membrane proteins or indirect interactions through soluble factors or intermediate cells23,24.
For instance, various neurotransmitters secreted by neurons can modulate the neuroprotective or inflammatory activity of microglia25,26,27. Additionally, direct interactions between neurons and microglia help to maintain microglia in a homeostatic state28. Conversely, direct interactions of microglia with neurons can shape neuronal circuitry29 and influence neuronal signaling30,31,32. As disruptions of these interactions induce hyperexcitability of neurons30 and&#160;microglia reactivity33,34, dysregulated microglia-neuronal interactions&#160;are implicated&#160;as a contributing factor to&#160;neurological diseases33,35. Indeed, psychotic23,26 and neurodegenerative diseases have been described to exhibit dysfunctional microglia-neuronal interactions33. While these observations highlight the importance of microglia-neuronal communication in the CNS, specific mechanisms of how these interactions regulate microglial and neuronal functions in health and disease are relatively unknown.
Within a complex milieu such as the CNS, multiple environmental factors can influence microglia-neuronal interactions, which limits the ability to study transient cellular interactions in vivo. Here, we present an in vitro microglia-neuronal co-culture system that can be used to study direct cellular interactions between microglia and neurons. This protocol describes the generation of primary microglia and neurons from the cortices of neonatal mice between post-natal days 0-2 and embryonic mice days 16-18, respectively. Neurons and microglia are then co-cultured in 96-well plates for downstream high-throughput experiments. We previously used this approach to demonstrate that microglia phagocytosis protects neurons from oxidized phosphatidylcholine mediated cell death37, suggesting that this method can help to understand the roles of microglia in the context of neurodegeneration and MS. Similarly, microglia-neuronal co-cultures may also be useful for investigating the impact of microglia-neuronal crosstalk in other contexts such as viral infections38 or neuronal injury and repair39. Overall, in vitro microglia-neuronal co-culture systems&#160;enable researchers to study microglia-neuronal interactions in a manipulatable and controlled environment, which complements in vivo models.

लेखक स्पॉटलाइट: रोग की स्थिति में माइक्रोग्लिया-न्यूरोनल इंटरैक्शन का अध्ययन करने के लिए इन विट्रो सह-संस्कृति मॉडल में

म्यूरिन प्राइमरी माइक्रोग्लिया और कॉर्टिकल न्यूरॉन्स का निर्माण और सह-संवर्धन

Our research aims to investigate the interactions between neurons and microglia during disease conditions such as multiple sclerosis. We aim to recapitulate microglia neuronal interactions in vitro to better understand their functional importance in the CNS. We previously demonstrated that microglia phagocytosis protects neurons from oxidized phosphatidylcholine-mediated cell death with this co-culture.While other co-culture systems are also employed, this mixed culture system enables direct and close contact between microglia and neurons. In addition, it can remain healthy from 12 days to potentially three weeks, allowing for long-term studies of neuronal microglia interactions. Our protocol offers a simple and accessible method to co-culture microglia neurons that are easily manipulatable and can be further used in downstream assays to determine cellular functional changes.

माइक्रोग्लिया के लिए मिश्रित ग्लिया संस्कृति के प्रमुख चरणों को दिखाने वाला एक फ़्लोचार्ट चित्र 1 ए में दिखाया गया है। कुल मिलाकर, विरल कोशिकाओं और अत्यधिक सेलुलर मलबे 1 दिन (चित्रा 1...

यह प्रोटोकॉल भ्रूण के दिनों 15-16 में माउस भ्रूण से अलग प्राथमिक न्यूरोनल कोशिकाओं से स्थापित एक माइक्रोग्लिया-न्यूरोनल सह-संस्कृति का वर्णन करता है और प्रसवोत्तर दिनों में नवजात चूहों के दिमाग से उत्पन्न प्राथमिक माइक्रोग्लिया 1-2।

Microglia are tissue-resident macrophages of the central nervous system (CNS), performing numerous functions that support neuronal health and CNS ...

generating-co-culturing-murine-primary-microglia-cortical

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Generating and Co-culturing Murine Primary Microglia and Cortical Neurons

Microglia are tissue-resident macrophages of the central nervous system (CNS), performing numerous functions that support neuronal health and CNS homeostasis. They are a major population of immune cells associated with CNS disease activity, adopting&#160;reactive phenotypes that potentially contribute to neuronal injury during chronic neurodegenerative diseases such as multiple sclerosis (MS). The distinct mechanisms by which microglia regulate neuronal function and survival during health and disease remain limited due to challenges in resolving the complex in vivo interactions between microglia, neurons, and other CNS environmental factors. Thus, the in vitro approach of co-culturing microglia and neurons remains a valuable tool for studying microglia-neuronal interactions. Here, we present a protocol to generate and co-culture primary microglia and neurons from mice. Specifically, microglia were isolated after 9-10 days in vitro from a mixed glia culture established from brain homogenates derived from neonatal mice between post-natal days 0-2. Neuronal cells were isolated from brain cortices of mouse embryos between embryonic days 16-18. After 4-5 days in vitro, neuronal cells were seeded in 96-well plates, followed by the addition of microglia to form the co-culture. Careful timing is critical for this protocol as both cell types need to reach experimental maturity to establish the co-culture. Overall, this co-culture can be useful for studying microglia-neuron interactions and can provide multiple readouts, including immunofluorescence microscopy, live imaging, as well as RNA and protein assays.

This protocol describes a microglia-neuronal co-culture established from primary neuronal cells isolated from mouse embryos at embryonic days 15-16 and primary microglia generated from the brains of neonatal mice at post-natal days 1-2.

Brain Isolation from Neonatal Mice for Primary Microglia Culture

To begin, add 5 milliliters of 10 micrograms per milliliter Poly-L-ornithine hydrobromide to each T75 flask. Incubate at 37 degrees Celsius in a 5%carbon dioxide incubator for at least one hour. After decapitating the mouse, gently hold the head and create a midline incision in the cranium, starting from the neck to the nose.Peel the skull back with tissue forceps to reveal the brain. To scoop the brain out, insert the tissue forceps under the brain, and lift the brain out from the head. After placing the brain into a Petri dish containing 20 milliliters of Leibovitz's L-15 media under a dissection microscope, using a pair of micro-forceps, carefully remove the brainstem and the meninges.Collect the brains in a 50-milliliter conical tube containing 5 milliliters of Leibovitz's L15 media.

प्राथमिक माइक्रोग्लिया संस्कृति के लिए नवजात चूहों से मस्तिष्क अलगाव

Preparing and Maintaining Mixed Glia Culture Derived from Neonatal Mice Brains

To begin, mince the isolated brains into approximately one-square-millimeter pieces with a sterile disposable scalpel blade. Carefully transfer the minced brains into a new sterile 50 milliliter tube. Add a final concentration of 0.25%trypsin to the minced brains.Incubate the tissue in a 37-degrees-Celsius water bath for 20 minutes. Add five milliliters of complete glia culture media to neutralize the trypsin and gently mix the tissue suspension using a 10 milliliter pipette. Carefully decant the cell suspension through the cell strainer.Then remove the plunger from a sterile one-milliliter syringe and grind the tissue into the mesh using the plunger. Add equal volumes of cell suspension containing one to two brains with glia culture media to each flask resulting in a final volume of 15 milliliters. Sparse cells and excessive cellular debris were observed on day one.By day four, adherent astrocytes were generated. Confluent cells with typical astrocyte morphology were observed by day eight of culture.

नवजात चूहों के दिमाग से प्राप्त मिश्रित ग्लिया संस्कृति तैयार करना और बनाए रखना

Isolating Brains from E16-E18 Mouse Embryos for Primary Neuron Culture

Begin by coating T25 flasks with five milliliters of 10 micrograms per milliliter poly-L-ornithine, and incubate them. To isolate the brain from mouse embryos, lift the skin of the euthanized pregnant mouse's lower abdomen with tissue forceps. Using dissection scissors, perform a V-shaped incision from this point to the lower rib cage.Grab the uterine horns containing the embryos with tissue forceps, and gently remove the embryos from the abdominal cavity. Using spring scissors, create a midline incision at the top of the skull, starting from the back of the neck to the nose. Lift the skull away from the incision site to reveal the brain.Gently scoop out the brain with tissue forceps and transfer the brain to a 10 centimeter Petri dish containing 15 milliliters of Hanks'balanced salt solution. Under a dissection microscope, carefully remove the brainstem and the meninges on both sides of the brain cortices with a pair of micro forceps.

प्राथमिक न्यूरॉन संस्कृति के लिए E16-E18 माउस भ्रूण से दिमाग को अलग करना

Brain Dissociation and Seeding of Cortical Neurons in Cell Culture 

To begin, mince the isolated brains into pieces in the 50-milliliter conical tube with a sterile disposable scalpel blade. Add trypsin to the tube at a final concentration of 0.25%Immerse the tube in a 35 to 38 degrees Celsius hot water bath for 15 minutes. Gently pipette the tissue suspension up and down to dissociate cells.Then add 0.5 milliliters of fetal bovine serum to the homogenized suspension to neutralize trypsin activity. Filter the cell suspension through the 70-micrometer nylon mesh cell strainer. Using a one-milliliter syringe plunger, gently grind the tissue into the cell strainer.Then centrifuge the conical tube at 300 g for five minutes at four degrees Celsius. Discard the Poly-L-Ornithine in the T25 flasks and rinse the flasks three times with five milliliters of PBS. Carefully decant the tube to remove the supernatant and resuspend the cell pellet by gently pipetting with two to three milliliters of complete neurobasal media.Plate the cells in the Poly-L-Ornithine-coated T25 flasks with approximately 20 million cells per flask in five milliliters of complete neurobasal media. Incubate the cell culture at 37 degrees Celsius in a 5%carbon dioxide incubator. Neurons in T25 flasks and 96-well plates adhered and formed neurite processes by day three.Suboptimal neuron cultures contained cell clumps and debris.

मस्तिष्क पृथक्करण और सेल संस्कृति में कॉर्टिकल न्यूरॉन्स का बीजारोपण 

Co-Culture of Primary Neurons and Microglia for Studying Microglia-Neuron Interactions

To begin, take neurons grown in T25 flasks for co-culture. Replace the media with five milliliters of versene solution containing trypsin and Dnase I.Add 0.5 milliliters of fetal bovine serum to neutralize the trypsin and Dnase I.Transfer cells to a 15 milliliter conical tube. Wash the flask with five milliliters of complete neurobasal media once to maximize the collected neurons.Then, centrifuge the cell suspension at 300 G for five minutes at four degrees celsius. After discarding the supernatant, gently resuspend the cell pellet in two to three milliliters of complete neurobasal media. Seed 100 microliters of the cell suspension to each well to obtain 75, 000 neurons per well, between eight to 10 days of mixed glia cultivation.Using a 10 milliliter pipette, gently wash the T75 flasks with glia culture media to collect microglia and transfer the cells and media into a sterile 50 milliliter conical tube. Centrifuge the cell collection at 300 G for five minutes at four degrees celsius. Once the supernatant is removed, gently resuspend the pellet in two milliliters of complete neurobasal media.From the 96-well neuronal culture plate, remove 100 microliters of neurobasal media and add 100 microliters of 250, 000 cells per milliliter cell suspension. In co-culture round and large microglia were observed on top or between neurons and neurite processes.