Name: В центре внимания автора: Модель ко-культуры in vitro для изучения взаимодействия микроглии и нейронов в условиях заболевания
Uploaded: 2024-07-26T15:00:00
Description: Microglia are tissue-resident macrophages of the central nervous system (CNS), performing numerous functions that support neuronal health and CNS ...

JP выражает признательность за финансовую поддержку со стороны Совета по естественным наукам и инженерным исследованиям Канады и Медицинского колледжа Университета Саскачевана. YD выражает признательность за финансовую поддержку от Фонда стартапов Медицинского колледжа Университета Саскачевана, Гранта на открытие Совета по естественным наукам и инженерным исследованиям Канады (RGPIN-2023-03659), Гранта MS Canada Catalyst (1019973), Гранта на создание Фонда исследований в области здравоохранения Саскачевана (6368) и Гранта Фонда Brain Canada для будущих лидеров в канадских исследованиях мозга. Рисунок 1A, Рисунок 2A и Рисунок 3A были созданы с помощью BioRender.com.

Все животные, использованные в этом исследовании, были размещены и обработаны с одобрения Университетского комитета по уходу за животными (UACC) Университета Саскачевана и Канадского совета по уходу за животными (CCAC). Для исследования использовали эмбрионы 0-2 дней CD1 самцов и самок мышей ?...

 Протокол первичной микроглии и кокультуры нейронов для изучения взаимодействия ЦНС

В этой статье описывается протокол выделения и культивирования первичных нейронов и первичной микроглии мыши, которые впоследствии используются для создания кокультуры микроглии и нейронов, которая может быть использована для изучения того, как взаимодействия микроглии и нейронов р...

Микроглия – это тканевые резидентные макрофаги, которые способствуют иммунонадзору и гомеостазу в центральной нервной системе (ЦНС)1,2,3. Они происходят из эритромиелоидных клеток-предшественников желточного мешка, которые колонизируют мозг во время эмбрионального развития 4,5,6 и поддерживаются на протяжении всей жизни организма за счет самообновления, которое включает пролиферацию и апоптоз7. В равновесном состоянии микроглия в состоянии покоя имеет разветвленную морфологию и участвует в тканевом контроле 8,9,10.
Микроглия экспрессирует многочисленные рецепторы клеточной поверхности, что позволяет ей быстро реагировать на изменения в ЦНС11,12 и стимулировать воспалительные реакции в случае инфекций или повреждений тканей 12,13,14, а также при нейродегенеративных заболеваниях 9,15, таких как рассеянный склероз (РС)16,17. Микроглия также экспрессирует рецепторы к различным нейротрансмиттерам и нейропептидам 18,19,20, что позволяет предположить, что они также могут реагировать и регулировать активность нейронов 21,22. Действительно, микроглия и нейроны взаимодействуют в различных формах двунаправленной коммуникации 8,23, таких как прямые взаимодействия, опосредованные мембранными белками, или косвенные взаимодействия через растворимые факторы или промежуточные клетки23,24.
Например, различные нейротрансмиттеры, секретируемые нейронами, могут модулировать нейропротекторную или воспалительную активность микроглии 25,26,27. Кроме того, прямое взаимодействие между нейронами и микроглией помогает поддерживать микроглию в гомеостатическом состоянии28. И наоборот, прямое взаимодействие микроглии с нейронами может формировать нейронные схемы29 и влиять на передачу нейронных сигналов 30,31,32. Поскольку нарушения этих взаимодействий вызывают гипервозбудимость нейронов30 и реактивность микроглии 33,34, нерегулируемые взаимодействия микроглии и нейронов участвуют в качестве фактора, способствующего развитию неврологических заболеваний33,35. Действительно, было описано, что психотические заболевания23,26 и нейродегенеративные заболевания демонстрируют дисфункциональные взаимодействия микроглии и нейронов33. В то время как эти наблюдения подчеркивают важность микроглиально-нейрональной коммуникации в ЦНС, конкретные механизмы того, как эти взаимодействия регулируют микроглиальные и нейрональные функции в здоровом и заболеваемом состоянии, относительно неизвестны.
В такой сложной среде, как ЦНС, многочисленные факторы окружающей среды могут влиять на микроглиально-нейронные взаимодействия, что ограничивает возможность изучения транзиторных клеточных взаимодействий in vivo. В данной работе мы представляем систему совместного культивирования микроглии и нейронов in vitro, которая может быть использована для изучения прямых клеточных взаимодействий между микроглией и нейронами. Этот протокол описывает генерацию первичной микроглии и нейронов из коры головного мозга неонатальных мышей между 0-2 днями после рождения и эмбриональными мышами 16-18 днями соответственно. Затем нейроны и микроглия совместно культивируются в 96-луночных планшетах для последующих высокопроизводительных экспериментов. Ранее мы использовали этот подход, чтобы продемонстрировать, что фагоцитоз микроглии защищает нейроны от окисленной опосредованной фосфатидилхолином клеточной смерти37, предполагая, что этот метод может помочь понять роль микроглии в контексте нейродегенерации и рассеянного склероза. Аналогичным образом, культуры микроглии и нейронов также могут быть полезны для исследования влияния перекрестных помех микроглия и нейронов в других контекстах, таких как вирусные инфекции38 или повреждение и восстановление нейронов39. В целом, системы сокультуры микроглии и нейронов in vitro позволяют исследователям изучать микроглии-нейрональные взаимодействия в управляемой и контролируемой среде, которая дополняет модели in vivo.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>10 cm Petri dish&#160;</td>
			<td>Fisher&#160;</td>
			<td>07-202-011</td>
			<td>Sterile</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1x Versene</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15040-066</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B-27 Plus Neuronal Culture System&#160;</td>
			<td>Gibco&#160;</td>
			<td>A3653401</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissection microscope</td>
			<td>VWR</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNase I</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11284932001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#8217;s Modified Eagle Medium (DMEM)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11960-044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum&#160;</td>
			<td>ThermoFisher Sci</td>
			<td>12483-020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HBSS (10x)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14065-056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hemacytometer</td>
			<td>Hausser Scientific</td>
			<td>1475</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES&#160;</td>
			<td>ThermoFisher Sci</td>
			<td>15630080</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leibovitz&#8217;s L-15 Medium (1x)</td>
			<td>Fisher Scientific&#160;</td>
			<td>21083027</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Macrophage colony stimulating factor&#160;</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>315-02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro-Forceps</td>
			<td>RWD</td>
			<td>F11020-11</td>
			<td>Autoclaved/Sterile</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Non-essential amino acids</td>
			<td>Cytiva</td>
			<td>SH3023801</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS (10x)</td>
			<td>ThermoFisher Sci</td>
			<td>AM9625</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin Streptomycin Glutamine (100x)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>103780-16</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-L-ornithine hydrobromide&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P3655-100MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium pyruvate (100 mM)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11360-070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spring scissors</td>
			<td>RWD</td>
			<td>S11008-42</td>
			<td>Autoclaved/Sterile</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical blade</td>
			<td>Feather</td>
			<td>08-916-5D</td>
			<td>Sterile</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T-25 flasks</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>10-126-9</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T-75 flasks&#160;</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>13-680-65</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue forceps</td>
			<td>Codman</td>
			<td>30-4218</td>
			<td>Autoclaved/Sterile</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue scissors</td>
			<td>RWD</td>
			<td>S12052-10</td>
			<td>Autoclaved/Sterile</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan Blue&#160;</td>
			<td>Thermofisher Sci&#160;</td>
			<td>15250-061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin (2.5%)</td>
			<td>ThermoFisher Sci</td>
			<td>15090046</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Widefield Immunofluorescence Microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

generating and co-culturing murine primary microglia and cortical neurons

Микроглия — это тканевые резидентные макрофаги центральной нервной системы (ЦНС), выполняющие многочисленные функции, поддерживающие здоровье нейронов и гомеостаз ЦНС. Они представляют собой основную популяцию иммунных клеток, связанных с активностью заболевания ЦНС, принимая реактивные фенотипы, которые потенциально способствуют повреждению нейронов во время хронических нейродегенеративных заболеваний, таких как рассеянный склероз (РС). Различные механизмы, с помощью которых микроглия регулируют функцию нейронов и выживаемость во время здоровья и болезни, остаются ограниченными из-за проблем в разрешении сложных взаимодействий in vivo между микроглией, нейронами и другими факторами окружающей среды ЦНС. Таким образом, подход in vitro к совместному культивированию микроглии и нейронов остается ценным инструментом для изучения микроглии и нейронных взаимодействий. В этой статье мы представляем протокол генерации и совместного культивирования первичной микроглии и нейронов у мышей. В частности, микроглия была выделена через 9-10 дней in vitro из смешанной культуры глии, полученной из гомогенатов мозга, полученных от неонатальных мышей между 0-2 днями после рождения. Нейрональные клетки были выделены из коры головного мозга эмбрионов мышей между 16-18 днями эмбрионального периода. После 4-5 дней in vitro нейрональные клетки засеивали в 96-луночные планшеты с последующим добавлением микроглии для формирования кокультуры. Тщательное определение времени имеет решающее значение для этого протокола, поскольку оба типа клеток должны достичь экспериментальной зрелости для создания совместной культуры. В целом, эта кокультура может быть полезна для изучения взаимодействий микроглии и нейронов и может обеспечить многократное считывание, включая иммунофлуоресцентную микроскопию, живую визуализацию, а также анализы РНК и белков.

Microglia are tissue-resident macrophages that facilitate immunosurveillance and homeostasis in the central nervous system (CNS)1,2,3. They originate from yolk sac erythromyeloid progenitor cells that colonize the brain during embryonic development4,5,6&#160;and are maintained throughout the organism&#39;s life span through self-renewal, which involves proliferation and apoptosis7. At steady-state, resting microglia have ramified morphology and engage in tissue surveillance8,9,10.
Microglia express numerous cell-surface receptors, which enables them to rapidly respond to changes in the CNS11,12 and to promote inflammatory responses in the event of infections or tissue injury12,13,14, as well as during neurodegenerative diseases9,15, such as&#160;multiple sclerosis (MS)16,17. Microglia also express receptors to various neurotransmitters and neuropeptides18,19,20, which suggests they may also respond to and regulate neuronal activity21,22. Indeed, microglia and neurons interact in various forms of bidirectional communication8,23 such as direct interactions mediated by membrane proteins or indirect interactions through soluble factors or intermediate cells23,24.
For instance, various neurotransmitters secreted by neurons can modulate the neuroprotective or inflammatory activity of microglia25,26,27. Additionally, direct interactions between neurons and microglia help to maintain microglia in a homeostatic state28. Conversely, direct interactions of microglia with neurons can shape neuronal circuitry29 and influence neuronal signaling30,31,32. As disruptions of these interactions induce hyperexcitability of neurons30 and&#160;microglia reactivity33,34, dysregulated microglia-neuronal interactions&#160;are implicated&#160;as a contributing factor to&#160;neurological diseases33,35. Indeed, psychotic23,26 and neurodegenerative diseases have been described to exhibit dysfunctional microglia-neuronal interactions33. While these observations highlight the importance of microglia-neuronal communication in the CNS, specific mechanisms of how these interactions regulate microglial and neuronal functions in health and disease are relatively unknown.
Within a complex milieu such as the CNS, multiple environmental factors can influence microglia-neuronal interactions, which limits the ability to study transient cellular interactions in vivo. Here, we present an in vitro microglia-neuronal co-culture system that can be used to study direct cellular interactions between microglia and neurons. This protocol describes the generation of primary microglia and neurons from the cortices of neonatal mice between post-natal days 0-2 and embryonic mice days 16-18, respectively. Neurons and microglia are then co-cultured in 96-well plates for downstream high-throughput experiments. We previously used this approach to demonstrate that microglia phagocytosis protects neurons from oxidized phosphatidylcholine mediated cell death37, suggesting that this method can help to understand the roles of microglia in the context of neurodegeneration and MS. Similarly, microglia-neuronal co-cultures may also be useful for investigating the impact of microglia-neuronal crosstalk in other contexts such as viral infections38 or neuronal injury and repair39. Overall, in vitro microglia-neuronal co-culture systems&#160;enable researchers to study microglia-neuronal interactions in a manipulatable and controlled environment, which complements in vivo models.

В центре внимания автора: Модель ко-культуры in vitro для изучения взаимодействия микроглии и нейронов в условиях заболевания

Генерация и совместное культивирование первичной микроглии и корковых нейронов мышей

Our research aims to investigate the interactions between neurons and microglia during disease conditions such as multiple sclerosis. We aim to recapitulate microglia neuronal interactions in vitro to better understand their functional importance in the CNS. We previously demonstrated that microglia phagocytosis protects neurons from oxidized phosphatidylcholine-mediated cell death with this co-culture.While other co-culture systems are also employed, this mixed culture system enables direct and close contact between microglia and neurons. In addition, it can remain healthy from 12 days to potentially three weeks, allowing for long-term studies of neuronal microglia interactions. Our protocol offers a simple and accessible method to co-culture microglia neurons that are easily manipulatable and can be further used in downstream assays to determine cellular functional changes.

Блок-схема, показывающая основные этапы формирования смешанной культуры глии для микроглии, показана на рисунке 1A. В целом, в 1-й день ожидается разреженность клеток и чрезмерное количество клеточного мусора (рисунок 1B). К 4-му дню следует наблюдать увелич...

Этот протокол описывает кокультуру микроглии и нейронов, созданную из первичных нейрональных клеток, выделенных из эмбрионов мышей на 15-16 день эмбрионального периода, и первичной микроглии, полученной из мозга неонатальных мышей на 1-2 день после рождения.

Microglia are tissue-resident macrophages of the central nervous system (CNS), performing numerous functions that support neuronal health and CNS ...

generating-co-culturing-murine-primary-microglia-cortical

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Generating and Co-culturing Murine Primary Microglia and Cortical Neurons

Microglia are tissue-resident macrophages of the central nervous system (CNS), performing numerous functions that support neuronal health and CNS homeostasis. They are a major population of immune cells associated with CNS disease activity, adopting&#160;reactive phenotypes that potentially contribute to neuronal injury during chronic neurodegenerative diseases such as multiple sclerosis (MS). The distinct mechanisms by which microglia regulate neuronal function and survival during health and disease remain limited due to challenges in resolving the complex in vivo interactions between microglia, neurons, and other CNS environmental factors. Thus, the in vitro approach of co-culturing microglia and neurons remains a valuable tool for studying microglia-neuronal interactions. Here, we present a protocol to generate and co-culture primary microglia and neurons from mice. Specifically, microglia were isolated after 9-10 days in vitro from a mixed glia culture established from brain homogenates derived from neonatal mice between post-natal days 0-2. Neuronal cells were isolated from brain cortices of mouse embryos between embryonic days 16-18. After 4-5 days in vitro, neuronal cells were seeded in 96-well plates, followed by the addition of microglia to form the co-culture. Careful timing is critical for this protocol as both cell types need to reach experimental maturity to establish the co-culture. Overall, this co-culture can be useful for studying microglia-neuron interactions and can provide multiple readouts, including immunofluorescence microscopy, live imaging, as well as RNA and protein assays.

This protocol describes a microglia-neuronal co-culture established from primary neuronal cells isolated from mouse embryos at embryonic days 15-16 and primary microglia generated from the brains of neonatal mice at post-natal days 1-2.

Brain Isolation from Neonatal Mice for Primary Microglia Culture

To begin, add 5 milliliters of 10 micrograms per milliliter Poly-L-ornithine hydrobromide to each T75 flask. Incubate at 37 degrees Celsius in a 5%carbon dioxide incubator for at least one hour. After decapitating the mouse, gently hold the head and create a midline incision in the cranium, starting from the neck to the nose.Peel the skull back with tissue forceps to reveal the brain. To scoop the brain out, insert the tissue forceps under the brain, and lift the brain out from the head. After placing the brain into a Petri dish containing 20 milliliters of Leibovitz's L-15 media under a dissection microscope, using a pair of micro-forceps, carefully remove the brainstem and the meninges.Collect the brains in a 50-milliliter conical tube containing 5 milliliters of Leibovitz's L15 media.

Выделение мозга у неонатальных мышей для культивирования первичной микроглии

Preparing and Maintaining Mixed Glia Culture Derived from Neonatal Mice Brains

To begin, mince the isolated brains into approximately one-square-millimeter pieces with a sterile disposable scalpel blade. Carefully transfer the minced brains into a new sterile 50 milliliter tube. Add a final concentration of 0.25%trypsin to the minced brains.Incubate the tissue in a 37-degrees-Celsius water bath for 20 minutes. Add five milliliters of complete glia culture media to neutralize the trypsin and gently mix the tissue suspension using a 10 milliliter pipette. Carefully decant the cell suspension through the cell strainer.Then remove the plunger from a sterile one-milliliter syringe and grind the tissue into the mesh using the plunger. Add equal volumes of cell suspension containing one to two brains with glia culture media to each flask resulting in a final volume of 15 milliliters. Sparse cells and excessive cellular debris were observed on day one.By day four, adherent astrocytes were generated. Confluent cells with typical astrocyte morphology were observed by day eight of culture.

Приготовление и поддержание смешанной культуры глии, полученной из мозга неонатальных мышей

Isolating Brains from E16-E18 Mouse Embryos for Primary Neuron Culture

Begin by coating T25 flasks with five milliliters of 10 micrograms per milliliter poly-L-ornithine, and incubate them. To isolate the brain from mouse embryos, lift the skin of the euthanized pregnant mouse's lower abdomen with tissue forceps. Using dissection scissors, perform a V-shaped incision from this point to the lower rib cage.Grab the uterine horns containing the embryos with tissue forceps, and gently remove the embryos from the abdominal cavity. Using spring scissors, create a midline incision at the top of the skull, starting from the back of the neck to the nose. Lift the skull away from the incision site to reveal the brain.Gently scoop out the brain with tissue forceps and transfer the brain to a 10 centimeter Petri dish containing 15 milliliters of Hanks'balanced salt solution. Under a dissection microscope, carefully remove the brainstem and the meninges on both sides of the brain cortices with a pair of micro forceps.

Выделение мозга из эмбрионов мышей E16-E18 для культивирования первичных нейронов

Brain Dissociation and Seeding of Cortical Neurons in Cell Culture 

To begin, mince the isolated brains into pieces in the 50-milliliter conical tube with a sterile disposable scalpel blade. Add trypsin to the tube at a final concentration of 0.25%Immerse the tube in a 35 to 38 degrees Celsius hot water bath for 15 minutes. Gently pipette the tissue suspension up and down to dissociate cells.Then add 0.5 milliliters of fetal bovine serum to the homogenized suspension to neutralize trypsin activity. Filter the cell suspension through the 70-micrometer nylon mesh cell strainer. Using a one-milliliter syringe plunger, gently grind the tissue into the cell strainer.Then centrifuge the conical tube at 300 g for five minutes at four degrees Celsius. Discard the Poly-L-Ornithine in the T25 flasks and rinse the flasks three times with five milliliters of PBS. Carefully decant the tube to remove the supernatant and resuspend the cell pellet by gently pipetting with two to three milliliters of complete neurobasal media.Plate the cells in the Poly-L-Ornithine-coated T25 flasks with approximately 20 million cells per flask in five milliliters of complete neurobasal media. Incubate the cell culture at 37 degrees Celsius in a 5%carbon dioxide incubator. Neurons in T25 flasks and 96-well plates adhered and formed neurite processes by day three.Suboptimal neuron cultures contained cell clumps and debris.

Диссоциация мозга и посев корковых нейронов в клеточной культуре 

Co-Culture of Primary Neurons and Microglia for Studying Microglia-Neuron Interactions

To begin, take neurons grown in T25 flasks for co-culture. Replace the media with five milliliters of versene solution containing trypsin and Dnase I.Add 0.5 milliliters of fetal bovine serum to neutralize the trypsin and Dnase I.Transfer cells to a 15 milliliter conical tube. Wash the flask with five milliliters of complete neurobasal media once to maximize the collected neurons.Then, centrifuge the cell suspension at 300 G for five minutes at four degrees celsius. After discarding the supernatant, gently resuspend the cell pellet in two to three milliliters of complete neurobasal media. Seed 100 microliters of the cell suspension to each well to obtain 75, 000 neurons per well, between eight to 10 days of mixed glia cultivation.Using a 10 milliliter pipette, gently wash the T75 flasks with glia culture media to collect microglia and transfer the cells and media into a sterile 50 milliliter conical tube. Centrifuge the cell collection at 300 G for five minutes at four degrees celsius. Once the supernatant is removed, gently resuspend the pellet in two milliliters of complete neurobasal media.From the 96-well neuronal culture plate, remove 100 microliters of neurobasal media and add 100 microliters of 250, 000 cells per milliliter cell suspension. In co-culture round and large microglia were observed on top or between neurons and neurite processes.