JP выражает признательность за финансовую поддержку со стороны Совета по естественным наукам и инженерным исследованиям Канады и Медицинского колледжа Университета Саскачевана. YD выражает признательность за финансовую поддержку от Фонда стартапов Медицинского колледжа Университета Саскачевана, Гранта на открытие Совета по естественным наукам и инженерным исследованиям Канады (RGPIN-2023-03659), Гранта MS Canada Catalyst (1019973), Гранта на создание Фонда исследований в области здравоохранения Саскачевана (6368) и Гранта Фонда Brain Canada для будущих лидеров в канадских исследованиях мозга. Рисунок 1A, Рисунок 2A и Рисунок 3A были созданы с помощью BioRender.com.

Все животные, использованные в этом исследовании, были размещены и обработаны с одобрения Университетского комитета по уходу за животными (UACC) Университета Саскачевана и Канадского совета по уходу за животными (CCAC). Для исследования использовали эмбрионы 0-2 дней CD1 самцов и самок мышей ?...

 Протокол первичной микроглии и кокультуры нейронов для изучения взаимодействия ЦНС

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

В этой статье описывается протокол выделения и культивирования первичных нейронов и первичной микроглии мыши, которые впоследствии используются для создания кокультуры микроглии и нейронов, которая может быть использована для изучения того, как взаимодействия микроглии и нейронов р...

Микроглия – это тканевые резидентные макрофаги, которые способствуют иммунонадзору и гомеостазу в центральной нервной системе (ЦНС)1,2,3. Они происходят из эритромиелоидных клеток-предшественников желточного мешка, которые колонизируют мозг во время эмбрионального развития 4,5,6 и поддерживаются на протяжении всей жизни организма за счет самообновления, которое включает пролиферацию и апоптоз7. В равновесном состоянии микроглия в состоянии покоя имеет разветвленную морфологию и участвует в тканевом контроле 8,9,10.
Микроглия экспрессирует многочисленные рецепторы клеточной поверхности, что позволяет ей быстро реагировать на изменения в ЦНС11,12 и стимулировать воспалительные реакции в случае инфекций или повреждений тканей 12,13,14, а также при нейродегенеративных заболеваниях 9,15, таких как рассеянный склероз (РС)16,17. Микроглия также экспрессирует рецепторы к различным нейротрансмиттерам и нейропептидам 18,19,20, что позволяет предположить, что они также могут реагировать и регулировать активность нейронов 21,22. Действительно, микроглия и нейроны взаимодействуют в различных формах двунаправленной коммуникации 8,23, таких как прямые взаимодействия, опосредованные мембранными белками, или косвенные взаимодействия через растворимые факторы или промежуточные клетки23,24.
Например, различные нейротрансмиттеры, секретируемые нейронами, могут модулировать нейропротекторную или воспалительную активность микроглии 25,26,27. Кроме того, прямое взаимодействие между нейронами и микроглией помогает поддерживать микроглию в гомеостатическом состоянии28. И наоборот, прямое взаимодействие микроглии с нейронами может формировать нейронные схемы29 и влиять на передачу нейронных сигналов 30,31,32. Поскольку нарушения этих взаимодействий вызывают гипервозбудимость нейронов30 и реактивность микроглии 33,34, нерегулируемые взаимодействия микроглии и нейронов участвуют в качестве фактора, способствующего развитию неврологических заболеваний33,35. Действительно, было описано, что психотические заболевания23,26 и нейродегенеративные заболевания демонстрируют дисфункциональные взаимодействия микроглии и нейронов33. В то время как эти наблюдения подчеркивают важность микроглиально-нейрональной коммуникации в ЦНС, конкретные механизмы того, как эти взаимодействия регулируют микроглиальные и нейрональные функции в здоровом и заболеваемом состоянии, относительно неизвестны.
В такой сложной среде, как ЦНС, многочисленные факторы окружающей среды могут влиять на микроглиально-нейронные взаимодействия, что ограничивает возможность изучения транзиторных клеточных взаимодействий in vivo. В данной работе мы представляем систему совместного культивирования микроглии и нейронов in vitro, которая может быть использована для изучения прямых клеточных взаимодействий между микроглией и нейронами. Этот протокол описывает генерацию первичной микроглии и нейронов из коры головного мозга неонатальных мышей между 0-2 днями после рождения и эмбриональными мышами 16-18 днями соответственно. Затем нейроны и микроглия совместно культивируются в 96-луночных планшетах для последующих высокопроизводительных экспериментов. Ранее мы использовали этот подход, чтобы продемонстрировать, что фагоцитоз микроглии защищает нейроны от окисленной опосредованной фосфатидилхолином клеточной смерти37, предполагая, что этот метод может помочь понять роль микроглии в контексте нейродегенерации и рассеянного склероза. Аналогичным образом, культуры микроглии и нейронов также могут быть полезны для исследования влияния перекрестных помех микроглия и нейронов в других контекстах, таких как вирусные инфекции38 или повреждение и восстановление нейронов39. В целом, системы сокультуры микроглии и нейронов in vitro позволяют исследователям изучать микроглии-нейрональные взаимодействия в управляемой и контролируемой среде, которая дополняет модели in vivo.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>10 cm Petri dish&#160;</td>
			<td>Fisher&#160;</td>
			<td>07-202-011</td>
			<td>Sterile</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1x Versene</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15040-066</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B-27 Plus Neuronal Culture System&#160;</td>
			<td>Gibco&#160;</td>
			<td>A3653401</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissection microscope</td>
			<td>VWR</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNase I</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11284932001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#8217;s Modified Eagle Medium (DMEM)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11960-044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum&#160;</td>
			<td>ThermoFisher Sci</td>
			<td>12483-020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HBSS (10x)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14065-056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hemacytometer</td>
			<td>Hausser Scientific</td>
			<td>1475</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES&#160;</td>
			<td>ThermoFisher Sci</td>
			<td>15630080</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leibovitz&#8217;s L-15 Medium (1x)</td>
			<td>Fisher Scientific&#160;</td>
			<td>21083027</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Macrophage colony stimulating factor&#160;</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>315-02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro-Forceps</td>
			<td>RWD</td>
			<td>F11020-11</td>
			<td>Autoclaved/Sterile</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Non-essential amino acids</td>
			<td>Cytiva</td>
			<td>SH3023801</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS (10x)</td>
			<td>ThermoFisher Sci</td>
			<td>AM9625</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin Streptomycin Glutamine (100x)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>103780-16</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-L-ornithine hydrobromide&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P3655-100MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium pyruvate (100 mM)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11360-070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spring scissors</td>
			<td>RWD</td>
			<td>S11008-42</td>
			<td>Autoclaved/Sterile</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical blade</td>
			<td>Feather</td>
			<td>08-916-5D</td>
			<td>Sterile</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T-25 flasks</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>10-126-9</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T-75 flasks&#160;</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>13-680-65</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue forceps</td>
			<td>Codman</td>
			<td>30-4218</td>
			<td>Autoclaved/Sterile</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue scissors</td>
			<td>RWD</td>
			<td>S12052-10</td>
			<td>Autoclaved/Sterile</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan Blue&#160;</td>
			<td>Thermofisher Sci&#160;</td>
			<td>15250-061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin (2.5%)</td>
			<td>ThermoFisher Sci</td>
			<td>15090046</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Widefield Immunofluorescence Microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

generating and co-culturing murine primary microglia and cortical neurons

Микроглия — это тканевые резидентные макрофаги центральной нервной системы (ЦНС), выполняющие многочисленные функции, поддерживающие здоровье нейронов и гомеостаз ЦНС. Они представляют собой основную популяцию иммунных клеток, связанных с активностью заболевания ЦНС, принимая реактивные фенотипы, которые потенциально способствуют повреждению нейронов во время хронических нейродегенеративных заболеваний, таких как рассеянный склероз (РС). Различные механизмы, с помощью которых микроглия регулируют функцию нейронов и выживаемость во время здоровья и болезни, остаются ограниченными из-за проблем в разрешении сложных взаимодействий in vivo между микроглией, нейронами и другими факторами окружающей среды ЦНС. Таким образом, подход in vitro к совместному культивированию микроглии и нейронов остается ценным инструментом для изучения микроглии и нейронных взаимодействий. В этой статье мы представляем протокол генерации и совместного культивирования первичной микроглии и нейронов у мышей. В частности, микроглия была выделена через 9-10 дней in vitro из смешанной культуры глии, полученной из гомогенатов мозга, полученных от неонатальных мышей между 0-2 днями после рождения. Нейрональные клетки были выделены из коры головного мозга эмбрионов мышей между 16-18 днями эмбрионального периода. После 4-5 дней in vitro нейрональные клетки засеивали в 96-луночные планшеты с последующим добавлением микроглии для формирования кокультуры. Тщательное определение времени имеет решающее значение для этого протокола, поскольку оба типа клеток должны достичь экспериментальной зрелости для создания совместной культуры. В целом, эта кокультура может быть полезна для изучения взаимодействий микроглии и нейронов и может обеспечить многократное считывание, включая иммунофлуоресцентную микроскопию, живую визуализацию, а также анализы РНК и белков.

Microglia are tissue-resident macrophages that facilitate immunosurveillance and homeostasis in the central nervous system (CNS)1,2,3. They originate from yolk sac erythromyeloid progenitor cells that colonize the brain during embryonic development4,5,6&#160;and are maintained throughout the organism&#39;s life span through self-renewal, which involves proliferation and apoptosis7. At steady-state, resting microglia have ramified morphology and engage in tissue surveillance8,9,10.
Microglia express numerous cell-surface receptors, which enables them to rapidly respond to changes in the CNS11,12 and to promote inflammatory responses in the event of infections or tissue injury12,13,14, as well as during neurodegenerative diseases9,15, such as&#160;multiple sclerosis (MS)16,17. Microglia also express receptors to various neurotransmitters and neuropeptides18,19,20, which suggests they may also respond to and regulate neuronal activity21,22. Indeed, microglia and neurons interact in various forms of bidirectional communication8,23 such as direct interactions mediated by membrane proteins or indirect interactions through soluble factors or intermediate cells23,24.
For instance, various neurotransmitters secreted by neurons can modulate the neuroprotective or inflammatory activity of microglia25,26,27. Additionally, direct interactions between neurons and microglia help to maintain microglia in a homeostatic state28. Conversely, direct interactions of microglia with neurons can shape neuronal circuitry29 and influence neuronal signaling30,31,32. As disruptions of these interactions induce hyperexcitability of neurons30 and&#160;microglia reactivity33,34, dysregulated microglia-neuronal interactions&#160;are implicated&#160;as a contributing factor to&#160;neurological diseases33,35. Indeed, psychotic23,26 and neurodegenerative diseases have been described to exhibit dysfunctional microglia-neuronal interactions33. While these observations highlight the importance of microglia-neuronal communication in the CNS, specific mechanisms of how these interactions regulate microglial and neuronal functions in health and disease are relatively unknown.
Within a complex milieu such as the CNS, multiple environmental factors can influence microglia-neuronal interactions, which limits the ability to study transient cellular interactions in vivo. Here, we present an in vitro microglia-neuronal co-culture system that can be used to study direct cellular interactions between microglia and neurons. This protocol describes the generation of primary microglia and neurons from the cortices of neonatal mice between post-natal days 0-2 and embryonic mice days 16-18, respectively. Neurons and microglia are then co-cultured in 96-well plates for downstream high-throughput experiments. We previously used this approach to demonstrate that microglia phagocytosis protects neurons from oxidized phosphatidylcholine mediated cell death37, suggesting that this method can help to understand the roles of microglia in the context of neurodegeneration and MS. Similarly, microglia-neuronal co-cultures may also be useful for investigating the impact of microglia-neuronal crosstalk in other contexts such as viral infections38 or neuronal injury and repair39. Overall, in vitro microglia-neuronal co-culture systems&#160;enable researchers to study microglia-neuronal interactions in a manipulatable and controlled environment, which complements in vivo models.

В центре внимания автора: Модель ко-культуры in vitro для изучения взаимодействия микроглии и нейронов в условиях заболевания

Генерация и совместное культивирование первичной микроглии и корковых нейронов мышей

Our research aims to investigate the interactions between neurons and microglia during disease conditions such as multiple sclerosis. We aim to recapitulate microglia neuronal interactions in vitro to better understand their functional importance in the CNS. We previously demonstrated that microglia phagocytosis protects neurons from oxidized phosphatidylcholine-mediated cell death with this co-culture.While other co-culture systems are also employed, this mixed culture system enables direct and close contact between microglia and neurons. In addition, it can remain healthy from 12 days to potentially three weeks, allowing for long-term studies of neuronal microglia interactions. Our protocol offers a simple and accessible method to co-culture microglia neurons that are easily manipulatable and can be further used in downstream assays to determine cellular functional changes.

Блок-схема, показывающая основные этапы формирования смешанной культуры глии для микроглии, показана на рисунке 1A. В целом, в 1-й день ожидается разреженность клеток и чрезмерное количество клеточного мусора (рисунок 1B). К 4-му дню следует наблюдать увелич...

Этот протокол описывает кокультуру микроглии и нейронов, созданную из первичных нейрональных клеток, выделенных из эмбрионов мышей на 15-16 день эмбрионального периода, и первичной микроглии, полученной из мозга неонатальных мышей на 1-2 день после рождения.

Microglia are tissue-resident macrophages of the central nervous system (CNS), performing numerous functions that support neuronal health and CNS ...

generating-co-culturing-murine-primary-microglia-cortical

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Generating and Co-culturing Murine Primary Microglia and Cortical Neurons

523 Views.  University of Saskatchewan. Our research aims to investigate the interactions between neurons and microglia during disease conditions such as multiple sclerosis. We aim to recapitulate microglia neuronal interactions in vitro to better understand their functional importance in the CNS. We previously demonstrated that microglia phagocytosis protects neurons from oxidized phosphatidylcholine-mediated cell death with this co-culture.While other co-culture systems are also employed, this mixed culture system enables ...