JP erkänner finansieringsstöd från Natural Sciences and Engineering Research Council of Canada och University of Saskatchewan College of Medicine. YD erkänner finansieringsstöd från University of Saskatchewan College of Medicine Startup Fund, Natural Sciences and Engineering Research Council of Canada Discovery Grant (RGPIN-2023-03659), MS Canada Catalyst Grant (1019973), Saskatchewan Health Research Foundation Establishment Grant (6368) och Brain Canada Foundation Future Leaders in Canadian Brain Research Grant. Figur 1A, Figur 2A och Figur 3A skapades med BioRender.com.

Alla djur som användes i denna studie inhystes och hanterades med godkännande från University Animal Care Committee (UACC) vid University of Saskatchewan och Canadian Council on Animal Care (CCAC). Efter förlossningen dag 0-2 CD1 han- och honmöss och embryonala dag 16-18 (E16-18) embryon från dräktiga CD1-möss användes för denna studie. Detaljerna för reagenserna och den utrustning som används listas i materialtabellen.
1. Primär odling av mikroglia...

 Primärt protokoll för samodling av mikroglia och neuron för studier av CNS-interaktion

Författarna deklarerar att det inte föreligger några intressekonflikter.

Den här artikeln beskriver ett protokoll för att isolera och odla primära nervceller och primära mikroglia hos möss, som sedan används för att etablera en samkultur mellan mikroglia och neuron som kan användas för att studera hur interaktioner mellan mikroglia och neuroner reglerar deras cellulära hälsa och funktion. Detta relativt enkla och tillgängliga tillvägagångssätt kan ge viktiga insikter om mekanismerna och de funktionella resultaten av mikroglianeuroninteraktioner i CNS.
<p class="jove_content...

Mikroglia är vävnadsresidenta makrofager som underlättar immunövervakning och homeostas i centrala nervsystemet (CNS)1,2,3. De härstammar från gulesäckar erytromyeloida stamceller som koloniserar hjärnan under embryonal utveckling 4,5,6 och bibehålls under hela organismens livscykel genom självförnyelse, vilket innebär proliferation och apoptos7. Vid steady-state har vilande mikroglia förgrenat morfologin och ägnar sig åt vävnadsövervakning 8,9,10.
Mikroglia uttrycker ett stort antal receptorer på cellytan, vilket gör det möjligt för dem att snabbt reagera på förändringar i CNS11,12 och att främja inflammatoriska reaktioner vid infektioner eller vävnadsskada 12,13,14, liksom vid neurodegenerativa sjukdomar 9,15, såsom multipel skleros (MS)16,17. Mikroglia uttrycker också receptorer till olika neurotransmittorer och neuropeptider 18,19,20, vilket tyder på att de också kan reagera på och reglera neuronal aktivitet21,22. Faktum är att mikroglia och neuroner interagerar i olika former av dubbelriktad kommunikation 8,23 såsom direkta interaktioner medierade av membranproteiner eller indirekta interaktioner genom lösliga faktorer eller intermediära celler23,24.
Till exempel kan olika neurotransmittorer som utsöndras av neuroner modulera den neuroprotektiva eller inflammatoriska aktiviteten hos mikroglia 25,26,27. Dessutom bidrar direkta interaktioner mellan neuroner och mikroglia till att upprätthålla mikroglia i ett homeostatiskt tillstånd28. Omvänt kan direkta interaktioner mellan mikroglia och neuroner forma neuronala kretsar29 och påverka neuronal signalering 30,31,32. Eftersom störningar i dessa interaktioner inducerar hyperexcitabilitet hos neuroner30 och mikrogliareaktivitet 33,34, är dysreglerade mikroglia-neuronala interaktioner inblandade som en bidragande faktor till neurologiska sjukdomar33,35. Faktum är att psykotiska23,26 och neurodegenerativa sjukdomar har beskrivits uppvisa dysfunktionella mikroglia-neuronala interaktioner33. Även om dessa observationer belyser vikten av mikroglia-neuronal kommunikation i CNS, är specifika mekanismer för hur dessa interaktioner reglerar mikroglia- och neuronala funktioner i hälsa och sjukdom relativt okända.
I en komplex miljö som CNS kan flera miljöfaktorer påverka interaktioner mellan mikroglia och neurona, vilket begränsar möjligheten att studera transienta cellulära interaktioner in vivo. Här presenterar vi ett in vitro mikroglia-neuronalt co-kultursystem som kan användas för att studera direkta cellulära interaktioner mellan mikroglia och neuroner. Detta protokoll beskriver genereringen av primära mikroglia och neuroner från hjärnbarken hos neonatala möss mellan postnatala dagar 0-2 respektive embryonala möss dag 16-18. Neuroner och mikroglia odlas sedan tillsammans i 96-brunnars plattor för nedströms experiment med hög genomströmning. Vi har tidigare använt detta tillvägagångssätt för att visa att mikroglia fagocytos skyddar nervceller från oxiderad fosfatidylkolinmedierad celldöd37, vilket tyder på att denna metod kan hjälpa till att förstå mikroglias roll i samband med neurodegeneration och MS. På samma sätt kan mikroglia-neuronala samkulturer också vara användbara för att undersöka effekten av mikroglia-neuronal överhörning i andra sammanhang, såsom virusinfektioner38 eller neuronal skada och reparation39. Sammantaget gör in vitro mikroglia-neuronala samkultursystem det möjligt för forskare att studera mikroglia-neuronala interaktioner i en manipulerbar och kontrollerad miljö, vilket kompletterar in vivo-modeller.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>10 cm Petri dish&#160;</td>
			<td>Fisher&#160;</td>
			<td>07-202-011</td>
			<td>Sterile</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1x Versene</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15040-066</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B-27 Plus Neuronal Culture System&#160;</td>
			<td>Gibco&#160;</td>
			<td>A3653401</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissection microscope</td>
			<td>VWR</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNase I</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11284932001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#8217;s Modified Eagle Medium (DMEM)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11960-044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum&#160;</td>
			<td>ThermoFisher Sci</td>
			<td>12483-020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HBSS (10x)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14065-056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hemacytometer</td>
			<td>Hausser Scientific</td>
			<td>1475</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES&#160;</td>
			<td>ThermoFisher Sci</td>
			<td>15630080</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leibovitz&#8217;s L-15 Medium (1x)</td>
			<td>Fisher Scientific&#160;</td>
			<td>21083027</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Macrophage colony stimulating factor&#160;</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>315-02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro-Forceps</td>
			<td>RWD</td>
			<td>F11020-11</td>
			<td>Autoclaved/Sterile</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Non-essential amino acids</td>
			<td>Cytiva</td>
			<td>SH3023801</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS (10x)</td>
			<td>ThermoFisher Sci</td>
			<td>AM9625</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin Streptomycin Glutamine (100x)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>103780-16</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-L-ornithine hydrobromide&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P3655-100MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium pyruvate (100 mM)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11360-070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spring scissors</td>
			<td>RWD</td>
			<td>S11008-42</td>
			<td>Autoclaved/Sterile</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical blade</td>
			<td>Feather</td>
			<td>08-916-5D</td>
			<td>Sterile</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T-25 flasks</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>10-126-9</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T-75 flasks&#160;</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>13-680-65</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue forceps</td>
			<td>Codman</td>
			<td>30-4218</td>
			<td>Autoclaved/Sterile</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue scissors</td>
			<td>RWD</td>
			<td>S12052-10</td>
			<td>Autoclaved/Sterile</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan Blue&#160;</td>
			<td>Thermofisher Sci&#160;</td>
			<td>15250-061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin (2.5%)</td>
			<td>ThermoFisher Sci</td>
			<td>15090046</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Widefield Immunofluorescence Microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

generating and co-culturing murine primary microglia and cortical neurons

Mikroglia är vävnadsresidenta makrofager i centrala nervsystemet (CNS), som utför många funktioner som stöder neuronal hälsa och CNS-homeostas. De är en stor population av immunceller associerade med CNS-sjukdomsaktivitet, och antar reaktiva fenotyper som potentiellt bidrar till neuronal skada under kroniska neurodegenerativa sjukdomar som multipel skleros (MS). De distinkta mekanismerna genom vilka mikroglia reglerar neuronal funktion och överlevnad under hälsa och sjukdom förblir begränsade på grund av utmaningar med att lösa de komplexa in vivo-interaktionerna mellan mikroglia, neuroner och andra CNS-miljöfaktorer. Således är in vitro-metoden att samodla mikroglia och neuroner fortfarande ett värdefullt verktyg för att studera mikroglia-neuronala interaktioner. Här presenterar vi ett protokoll för att generera och samodla primära mikroglia och neuroner från möss. Specifikt isolerades mikroglia efter 9-10 dagar in vitro från en blandad gliakultur etablerad från hjärnhomogenat från neonatala möss mellan postnatal dag 0-2. Neuronala celler isolerades från hjärnbarken hos musembryon mellan embryonal dag 16-18. Efter 4-5 dagar in vitro såddes neuronala celler i 96-brunnars plattor, följt av tillsats av mikroglia för att bilda samkulturen. Noggrann timing är avgörande för detta protokoll eftersom båda celltyperna måste nå experimentell mognad för att etablera samkulturen. Sammantaget kan denna samkultur vara användbar för att studera interaktioner mellan mikroglia och neuron och kan ge flera avläsningar, inklusive immunofluorescensmikroskopi, live-avbildning, samt RNA- och proteinanalyser.

Microglia are tissue-resident macrophages that facilitate immunosurveillance and homeostasis in the central nervous system (CNS)1,2,3. They originate from yolk sac erythromyeloid progenitor cells that colonize the brain during embryonic development4,5,6&#160;and are maintained throughout the organism&#39;s life span through self-renewal, which involves proliferation and apoptosis7. At steady-state, resting microglia have ramified morphology and engage in tissue surveillance8,9,10.
Microglia express numerous cell-surface receptors, which enables them to rapidly respond to changes in the CNS11,12 and to promote inflammatory responses in the event of infections or tissue injury12,13,14, as well as during neurodegenerative diseases9,15, such as&#160;multiple sclerosis (MS)16,17. Microglia also express receptors to various neurotransmitters and neuropeptides18,19,20, which suggests they may also respond to and regulate neuronal activity21,22. Indeed, microglia and neurons interact in various forms of bidirectional communication8,23 such as direct interactions mediated by membrane proteins or indirect interactions through soluble factors or intermediate cells23,24.
For instance, various neurotransmitters secreted by neurons can modulate the neuroprotective or inflammatory activity of microglia25,26,27. Additionally, direct interactions between neurons and microglia help to maintain microglia in a homeostatic state28. Conversely, direct interactions of microglia with neurons can shape neuronal circuitry29 and influence neuronal signaling30,31,32. As disruptions of these interactions induce hyperexcitability of neurons30 and&#160;microglia reactivity33,34, dysregulated microglia-neuronal interactions&#160;are implicated&#160;as a contributing factor to&#160;neurological diseases33,35. Indeed, psychotic23,26 and neurodegenerative diseases have been described to exhibit dysfunctional microglia-neuronal interactions33. While these observations highlight the importance of microglia-neuronal communication in the CNS, specific mechanisms of how these interactions regulate microglial and neuronal functions in health and disease are relatively unknown.
Within a complex milieu such as the CNS, multiple environmental factors can influence microglia-neuronal interactions, which limits the ability to study transient cellular interactions in vivo. Here, we present an in vitro microglia-neuronal co-culture system that can be used to study direct cellular interactions between microglia and neurons. This protocol describes the generation of primary microglia and neurons from the cortices of neonatal mice between post-natal days 0-2 and embryonic mice days 16-18, respectively. Neurons and microglia are then co-cultured in 96-well plates for downstream high-throughput experiments. We previously used this approach to demonstrate that microglia phagocytosis protects neurons from oxidized phosphatidylcholine mediated cell death37, suggesting that this method can help to understand the roles of microglia in the context of neurodegeneration and MS. Similarly, microglia-neuronal co-cultures may also be useful for investigating the impact of microglia-neuronal crosstalk in other contexts such as viral infections38 or neuronal injury and repair39. Overall, in vitro microglia-neuronal co-culture systems&#160;enable researchers to study microglia-neuronal interactions in a manipulatable and controlled environment, which complements in vivo models.

Författare i fokus: In vitro co-kulturmodell för att studera mikroglia-neuronala interaktioner vid sjukdomstillstånd

Generering och samodling av murina primära mikroglia och kortikala neuroner

Our research aims to investigate the interactions between neurons and microglia during disease conditions such as multiple sclerosis. We aim to recapitulate microglia neuronal interactions in vitro to better understand their functional importance in the CNS. We previously demonstrated that microglia phagocytosis protects neurons from oxidized phosphatidylcholine-mediated cell death with this co-culture.While other co-culture systems are also employed, this mixed culture system enables direct and close contact between microglia and neurons. In addition, it can remain healthy from 12 days to potentially three weeks, allowing for long-term studies of neuronal microglia interactions. Our protocol offers a simple and accessible method to co-culture microglia neurons that are easily manipulatable and can be further used in downstream assays to determine cellular functional changes.

Ett flödesschema som visar de viktigaste stegen i den blandade gliakulturen för mikroglia visas i figur 1A. Sammantaget förväntas glesa celler och mycket cellulärt skräp på dag 1 (Figur 1B). Vid dag 4 bör ett ökat cellantal observeras, särskilt vid generering av vidhäftande astrocyter, vilket indikeras av deras långsträckta morfologi (Figur 1C). Ett fåtal mikroglia kan observeras ovanpå astrocyterna eller som små run...

Detta protokoll beskriver en mikroglia-neuronal samkultur etablerad från primära neuronala celler isolerade från musembryon vid embryonal dag 15-16 och primära mikroglia genererad från hjärnan hos neonatala möss vid postnatal dag 1-2.

Microglia are tissue-resident macrophages of the central nervous system (CNS), performing numerous functions that support neuronal health and CNS ...

generating-co-culturing-murine-primary-microglia-cortical

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Generating and Co-culturing Murine Primary Microglia and Cortical Neurons

523 Views.  University of Saskatchewan. Our research aims to investigate the interactions between neurons and microglia during disease conditions such as multiple sclerosis. We aim to recapitulate microglia neuronal interactions in vitro to better understand their functional importance in the CNS. We previously demonstrated that microglia phagocytosis protects neurons from oxidized phosphatidylcholine-mediated cell death with this co-culture.While other co-culture systems are also employed, this mixed culture system enables ...