Name: Yazar Spotlight: Hastalık Koşullarında Mikroglia-Nöronal Etkileşimleri İncelemek için İn Vitro Ko-Kültür Modeli
Uploaded: 2024-07-26T15:00:00
Description: Microglia are tissue-resident macrophages of the central nervous system (CNS), performing numerous functions that support neuronal health and CNS ...

JP, Kanada Doğa Bilimleri ve Mühendislik Araştırma Konseyi ve Saskatchewan Üniversitesi Tıp Fakültesi'nden fon desteğini kabul eder. YD, Saskatchewan Üniversitesi Tıp Fakültesi Başlangıç Fonu, Kanada Doğa Bilimleri ve Mühendislik Araştırma Konseyi Keşif Hibesi (RGPIN-2023-03659), MS Kanada Katalizör Hibesi (1019973), Saskatchewan Sağlık Araştırma Vakfı Kuruluş Hibesi (6368) ve Brain Canada Vakfı Kanada Beyin Araştırmalarında Geleceğin Liderleri Hibesi. Şekil 1A, Şekil 2A ve Şekil 3A BioRender.com ile oluşturulmuştur.

Bu çalışmada kullanılan tüm hayvanlar, Saskatchewan Üniversitesi Üniversite Hayvan Bakım Komitesi (UACC) ve Kanada Hayvan Bakımı Konseyi'nin (CCAC) onayı ile barındırıldı ve ele alındı. Bu çalışma için doğum sonrası 0-2 CD1 erkek ve dişi fareler ve gebe CD1 farelerinden alınan embriyonik günler 16-18 (E16-18) embriyoları kullanıldı. Reaktiflerin ve kullanılan ekipmanın ayrıntıları Malzeme Tablosunda listelenmiştir.
1. Birincil mikroglia...

 CNS Etkileşim Çalışmaları için Primer Mikroglia ve Nöron Ko-Kültür Protokolü

Bu makale, daha sonra mikroglia ve nöron etkileşimlerinin hücresel sağlıklarını ve işlevlerini nasıl düzenlediğini incelemek için kullanılabilecek bir mikroglia-nöronal ko-kültür oluşturmak için kullanılan fare birincil nöronlarını ve birincil mikroglialarını izole etmek ve kültürlemek için bir protokolü açıklamaktadır. Bu nispeten basit ve erişilebilir yaklaşım, CNS'deki mikroglia nöron etkileşimlerinin mekanizmaları ve işlevsel sonuçları hakkında kritik bilgiler sağlayabilir.</...

Mikroglia, merkezi sinir sisteminde (CNS) immünosürveyans ve homeostazı kolaylaştıran dokuda yerleşik makrofajlardır1,2,3. Embriyonik gelişim 4,5,6 sırasında beyni kolonize eden yolk kesesi eritromiyeloid progenitör hücrelerden kaynaklanırlar ve proliferasyon ve apoptozuiçeren kendi kendini yenileme yoluyla organizmanın yaşam süresi boyunca korunurlar 7. Kararlı durumda, dinlenme mikrogliaları dallanmış morfolojiye sahiptir ve doku sürveyansına girer 8,9,10.
Mikroglia, CNS'deki değişikliklere hızlı bir şekilde yanıt vermelerini sağlayan çok sayıda hücre yüzeyi reseptörünü eksprese eder11,12 ve enfeksiyonlar veya doku hasarı 12,13,14 ve ayrıca multipl skleroz(MS) gibi nörodejeneratif hastalıklar 9,15 sırasında inflamatuar yanıtları teşvik etmelerini sağlar16,17. Mikroglia ayrıca çeşitli nörotransmiterlere ve nöropeptitlere 18,19,20 reseptörleri eksprese eder, bu da nöronal aktiviteye21,22 yanıt verebileceklerini ve düzenleyebileceklerini düşündürür. Gerçekten de, mikroglia ve nöronlar, zar proteinlerinin aracılık ettiği doğrudan etkileşimler veya çözünür faktörlerveya ara hücreler23,24 aracılığıyla dolaylı etkileşimler gibi çeşitli çift yönlü iletişim biçimlerinde8,23 etkileşime girer.
Örneğin, nöronlar tarafından salgılanan çeşitli nörotransmiterler, mikroglia25,26,27'nin nöroprotektif veya inflamatuar aktivitesini modüle edebilir. Ek olarak, nöronlar ve mikroglia arasındaki doğrudan etkileşimler, mikroglia'nın homeostatik bir durumda tutulmasına yardımcı olur28. Tersine, mikroglia'nın nöronlarla doğrudan etkileşimleri, nöronal devreyi29 şekillendirebilir ve nöronal sinyalleşmeyi 30,31,32 etkileyebilir. Bu etkileşimlerin bozulması nöronların30 hipereksitabilitesini ve mikroglia reaktivitesini33,34 indüklediğinden, düzensiz mikroglia-nöronal etkileşimler nörolojik hastalıklara katkıda bulunan bir faktör olarak rol oynar33,35. Gerçekten de, psikotik23,26 ve nörodejeneratif hastalıkların işlevsiz mikroglia-nöronal etkileşimler sergilediği tanımlanmıştır33. Bu gözlemler CNS'de mikroglia-nöronal iletişimin önemini vurgularken, bu etkileşimlerin sağlık ve hastalıkta mikroglial ve nöronal fonksiyonları nasıl düzenlediğine dair spesifik mekanizmalar nispeten bilinmemektedir.
CNS gibi karmaşık bir ortamda, çoklu çevresel faktörler mikroglia-nöronal etkileşimleri etkileyebilir ve bu da geçici hücresel etkileşimleri in vivo olarak inceleme yeteneğini sınırlar. Burada, mikroglia ve nöronlar arasındaki doğrudan hücresel etkileşimleri incelemek için kullanılabilecek bir in vitro mikroglia-nöronal ko-kültür sistemi sunuyoruz. Bu protokol, doğum sonrası 0-2. günler ve embriyonik farelerin 16-18. günleri arasında yenidoğan farelerin kortekslerinden birincil mikroglia ve nöronların oluşumunu tanımlar. Nöronlar ve mikroglia daha sonra aşağı akış yüksek verimli deneyler için 96 oyuklu plakalarda birlikte kültürlenir. Daha önce bu yaklaşımı, mikroglia fagositozunun nöronları oksitlenmiş fosfatidilkolin aracılı hücre ölümünden37 koruduğunu göstermek için kullandık, bu da bu yöntemin nörodejenerasyon ve MS bağlamında mikroglia'nın rollerini anlamaya yardımcı olabileceğini düşündürdü. Benzer şekilde, mikroglia-nöronal ko-kültürler, viral enfeksiyonlar38 veya nöronal yaralanma ve onarım39 gibi diğer bağlamlarda mikroglia-nöronal karışmanın etkisini araştırmak için de yararlı olabilir. Genel olarak, in vitro mikroglia-nöronal ko-kültür sistemleri, araştırmacıların in vivo modelleri tamamlayan manipüle edilebilir ve kontrollü bir ortamda mikroglia-nöronal etkileşimleri incelemelerini sağlar.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>10 cm Petri dish&#160;</td>
			<td>Fisher&#160;</td>
			<td>07-202-011</td>
			<td>Sterile</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1x Versene</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15040-066</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B-27 Plus Neuronal Culture System&#160;</td>
			<td>Gibco&#160;</td>
			<td>A3653401</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissection microscope</td>
			<td>VWR</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNase I</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11284932001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#8217;s Modified Eagle Medium (DMEM)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11960-044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum&#160;</td>
			<td>ThermoFisher Sci</td>
			<td>12483-020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HBSS (10x)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14065-056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hemacytometer</td>
			<td>Hausser Scientific</td>
			<td>1475</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES&#160;</td>
			<td>ThermoFisher Sci</td>
			<td>15630080</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leibovitz&#8217;s L-15 Medium (1x)</td>
			<td>Fisher Scientific&#160;</td>
			<td>21083027</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Macrophage colony stimulating factor&#160;</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>315-02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro-Forceps</td>
			<td>RWD</td>
			<td>F11020-11</td>
			<td>Autoclaved/Sterile</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Non-essential amino acids</td>
			<td>Cytiva</td>
			<td>SH3023801</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS (10x)</td>
			<td>ThermoFisher Sci</td>
			<td>AM9625</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin Streptomycin Glutamine (100x)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>103780-16</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-L-ornithine hydrobromide&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P3655-100MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium pyruvate (100 mM)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11360-070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spring scissors</td>
			<td>RWD</td>
			<td>S11008-42</td>
			<td>Autoclaved/Sterile</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical blade</td>
			<td>Feather</td>
			<td>08-916-5D</td>
			<td>Sterile</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T-25 flasks</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>10-126-9</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T-75 flasks&#160;</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>13-680-65</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue forceps</td>
			<td>Codman</td>
			<td>30-4218</td>
			<td>Autoclaved/Sterile</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue scissors</td>
			<td>RWD</td>
			<td>S12052-10</td>
			<td>Autoclaved/Sterile</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan Blue&#160;</td>
			<td>Thermofisher Sci&#160;</td>
			<td>15250-061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin (2.5%)</td>
			<td>ThermoFisher Sci</td>
			<td>15090046</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Widefield Immunofluorescence Microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

generating and co-culturing murine primary microglia and cortical neurons

Mikroglia, merkezi sinir sisteminin (CNS) dokuda yerleşik makrofajlarıdır ve nöronal sağlığı ve CNS homeostazını destekleyen çok sayıda işlevi yerine getirir. Multipl skleroz (MS) gibi kronik nörodejeneratif hastalıklar sırasında nöronal hasara potansiyel olarak katkıda bulunan reaktif fenotipleri benimseyen, CNS hastalığı aktivitesi ile ilişkili önemli bir bağışıklık hücresi popülasyonudur. Mikroglia'nın sağlık ve hastalık sırasında nöronal fonksiyonu ve sağkalımı düzenlediği farklı mekanizmalar, mikroglia, nöronlar ve diğer CNS çevresel faktörleri arasındaki karmaşık in vivo etkileşimlerin çözülmesindeki zorluklar nedeniyle sınırlı kalmaktadır. Bu nedenle, mikroglia ve nöronların birlikte kültürlenmesine yönelik in vitro yaklaşım, mikroglia-nöronal etkileşimleri incelemek için değerli bir araç olmaya devam etmektedir. Burada, farelerden birincil mikroglia ve nöronlar üretmek ve birlikte kültürlemek için bir protokol sunuyoruz. Spesifik olarak, mikroglia, doğum sonrası 0-2 günleri arasında yenidoğan farelerden türetilen beyin homojenatlarından oluşturulan karışık bir glia kültüründen in vitro 9-10 gün sonra izole edildi. Nöronal hücreler, embriyonik 16-18. günler arasında fare embriyolarının beyin kortekslerinden izole edildi. 4-5 gün sonra in vitro olarak, nöronal hücreler 96 oyuklu plakalara ekildi, ardından ko-kültürü oluşturmak için mikroglia ilavesi yapıldı. Bu protokol için dikkatli zamanlama çok önemlidir, çünkü her iki hücre tipinin de ko-kültürü oluşturmak için deneysel olgunluğa ulaşması gerekir. Genel olarak, bu ko-kültür, mikroglia-nöron etkileşimlerini incelemek için yararlı olabilir ve immünofloresan mikroskobu, canlı görüntüleme, RNA ve protein tahlilleri dahil olmak üzere çoklu okumalar sağlayabilir.

Microglia are tissue-resident macrophages that facilitate immunosurveillance and homeostasis in the central nervous system (CNS)1,2,3. They originate from yolk sac erythromyeloid progenitor cells that colonize the brain during embryonic development4,5,6&#160;and are maintained throughout the organism&#39;s life span through self-renewal, which involves proliferation and apoptosis7. At steady-state, resting microglia have ramified morphology and engage in tissue surveillance8,9,10.
Microglia express numerous cell-surface receptors, which enables them to rapidly respond to changes in the CNS11,12 and to promote inflammatory responses in the event of infections or tissue injury12,13,14, as well as during neurodegenerative diseases9,15, such as&#160;multiple sclerosis (MS)16,17. Microglia also express receptors to various neurotransmitters and neuropeptides18,19,20, which suggests they may also respond to and regulate neuronal activity21,22. Indeed, microglia and neurons interact in various forms of bidirectional communication8,23 such as direct interactions mediated by membrane proteins or indirect interactions through soluble factors or intermediate cells23,24.
For instance, various neurotransmitters secreted by neurons can modulate the neuroprotective or inflammatory activity of microglia25,26,27. Additionally, direct interactions between neurons and microglia help to maintain microglia in a homeostatic state28. Conversely, direct interactions of microglia with neurons can shape neuronal circuitry29 and influence neuronal signaling30,31,32. As disruptions of these interactions induce hyperexcitability of neurons30 and&#160;microglia reactivity33,34, dysregulated microglia-neuronal interactions&#160;are implicated&#160;as a contributing factor to&#160;neurological diseases33,35. Indeed, psychotic23,26 and neurodegenerative diseases have been described to exhibit dysfunctional microglia-neuronal interactions33. While these observations highlight the importance of microglia-neuronal communication in the CNS, specific mechanisms of how these interactions regulate microglial and neuronal functions in health and disease are relatively unknown.
Within a complex milieu such as the CNS, multiple environmental factors can influence microglia-neuronal interactions, which limits the ability to study transient cellular interactions in vivo. Here, we present an in vitro microglia-neuronal co-culture system that can be used to study direct cellular interactions between microglia and neurons. This protocol describes the generation of primary microglia and neurons from the cortices of neonatal mice between post-natal days 0-2 and embryonic mice days 16-18, respectively. Neurons and microglia are then co-cultured in 96-well plates for downstream high-throughput experiments. We previously used this approach to demonstrate that microglia phagocytosis protects neurons from oxidized phosphatidylcholine mediated cell death37, suggesting that this method can help to understand the roles of microglia in the context of neurodegeneration and MS. Similarly, microglia-neuronal co-cultures may also be useful for investigating the impact of microglia-neuronal crosstalk in other contexts such as viral infections38 or neuronal injury and repair39. Overall, in vitro microglia-neuronal co-culture systems&#160;enable researchers to study microglia-neuronal interactions in a manipulatable and controlled environment, which complements in vivo models.

Yazar Spotlight: Hastalık Koşullarında Mikroglia-Nöronal Etkileşimleri İncelemek için İn Vitro Ko-Kültür Modeli

Murin Primer Mikroglia ve Kortikal Nöronların Üretilmesi ve Birlikte Kültürlenmesi

Our research aims to investigate the interactions between neurons and microglia during disease conditions such as multiple sclerosis. We aim to recapitulate microglia neuronal interactions in vitro to better understand their functional importance in the CNS. We previously demonstrated that microglia phagocytosis protects neurons from oxidized phosphatidylcholine-mediated cell death with this co-culture.While other co-culture systems are also employed, this mixed culture system enables direct and close contact between microglia and neurons. In addition, it can remain healthy from 12 days to potentially three weeks, allowing for long-term studies of neuronal microglia interactions. Our protocol offers a simple and accessible method to co-culture microglia neurons that are easily manipulatable and can be further used in downstream assays to determine cellular functional changes.

Mikroglia için karışık glia kültürünün temel adımlarını gösteren bir akış şeması Şekil 1A'da gösterilmiştir. Genel olarak, 1. günde seyrek hücreler ve aşırı hücresel kalıntı beklenir (Şekil 1B). 4. günde, özellikle uzun morfolojileri ile gösterildiği gibi, yapışık astrositlerin oluşumuyla birlikte artan hücre sayısı gözlenmelidir (Şekil 1C). Astrositlerin üzerinde veya ortamda yüzen küçü...

Bu protokol, embriyonik 15-16. günlerde fare embriyolarından izole edilen primer nöronal hücrelerden ve doğum sonrası 1-2. günlerde yenidoğan farelerinin beyinlerinden üretilen primer mikrogliadan kurulan bir mikroglia-nöronal ko-kültürü tanımlar.

Microglia are tissue-resident macrophages of the central nervous system (CNS), performing numerous functions that support neuronal health and CNS ...

generating-co-culturing-murine-primary-microglia-cortical

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Generating and Co-culturing Murine Primary Microglia and Cortical Neurons

Microglia are tissue-resident macrophages of the central nervous system (CNS), performing numerous functions that support neuronal health and CNS homeostasis. They are a major population of immune cells associated with CNS disease activity, adopting&#160;reactive phenotypes that potentially contribute to neuronal injury during chronic neurodegenerative diseases such as multiple sclerosis (MS). The distinct mechanisms by which microglia regulate neuronal function and survival during health and disease remain limited due to challenges in resolving the complex in vivo interactions between microglia, neurons, and other CNS environmental factors. Thus, the in vitro approach of co-culturing microglia and neurons remains a valuable tool for studying microglia-neuronal interactions. Here, we present a protocol to generate and co-culture primary microglia and neurons from mice. Specifically, microglia were isolated after 9-10 days in vitro from a mixed glia culture established from brain homogenates derived from neonatal mice between post-natal days 0-2. Neuronal cells were isolated from brain cortices of mouse embryos between embryonic days 16-18. After 4-5 days in vitro, neuronal cells were seeded in 96-well plates, followed by the addition of microglia to form the co-culture. Careful timing is critical for this protocol as both cell types need to reach experimental maturity to establish the co-culture. Overall, this co-culture can be useful for studying microglia-neuron interactions and can provide multiple readouts, including immunofluorescence microscopy, live imaging, as well as RNA and protein assays.

This protocol describes a microglia-neuronal co-culture established from primary neuronal cells isolated from mouse embryos at embryonic days 15-16 and primary microglia generated from the brains of neonatal mice at post-natal days 1-2.

Nörobilim

Brain Isolation from Neonatal Mice for Primary Microglia Culture

To begin, add 5 milliliters of 10 micrograms per milliliter Poly-L-ornithine hydrobromide to each T75 flask. Incubate at 37 degrees Celsius in a 5%carbon dioxide incubator for at least one hour. After decapitating the mouse, gently hold the head and create a midline incision in the cranium, starting from the neck to the nose.Peel the skull back with tissue forceps to reveal the brain. To scoop the brain out, insert the tissue forceps under the brain, and lift the brain out from the head. After placing the brain into a Petri dish containing 20 milliliters of Leibovitz's L-15 media under a dissection microscope, using a pair of micro-forceps, carefully remove the brainstem and the meninges.Collect the brains in a 50-milliliter conical tube containing 5 milliliters of Leibovitz's L15 media.

Primer Mikroglia Kültürü için Yenidoğan Farelerden Beyin İzolasyonu

Preparing and Maintaining Mixed Glia Culture Derived from Neonatal Mice Brains

To begin, mince the isolated brains into approximately one-square-millimeter pieces with a sterile disposable scalpel blade. Carefully transfer the minced brains into a new sterile 50 milliliter tube. Add a final concentration of 0.25%trypsin to the minced brains.Incubate the tissue in a 37-degrees-Celsius water bath for 20 minutes. Add five milliliters of complete glia culture media to neutralize the trypsin and gently mix the tissue suspension using a 10 milliliter pipette. Carefully decant the cell suspension through the cell strainer.Then remove the plunger from a sterile one-milliliter syringe and grind the tissue into the mesh using the plunger. Add equal volumes of cell suspension containing one to two brains with glia culture media to each flask resulting in a final volume of 15 milliliters. Sparse cells and excessive cellular debris were observed on day one.By day four, adherent astrocytes were generated. Confluent cells with typical astrocyte morphology were observed by day eight of culture.

Yenidoğan Fare Beyinlerinden Türetilen Karışık Glia Kültürünün Hazırlanması ve Sürdürülmesi

Isolating Brains from E16-E18 Mouse Embryos for Primary Neuron Culture

Begin by coating T25 flasks with five milliliters of 10 micrograms per milliliter poly-L-ornithine, and incubate them. To isolate the brain from mouse embryos, lift the skin of the euthanized pregnant mouse's lower abdomen with tissue forceps. Using dissection scissors, perform a V-shaped incision from this point to the lower rib cage.Grab the uterine horns containing the embryos with tissue forceps, and gently remove the embryos from the abdominal cavity. Using spring scissors, create a midline incision at the top of the skull, starting from the back of the neck to the nose. Lift the skull away from the incision site to reveal the brain.Gently scoop out the brain with tissue forceps and transfer the brain to a 10 centimeter Petri dish containing 15 milliliters of Hanks'balanced salt solution. Under a dissection microscope, carefully remove the brainstem and the meninges on both sides of the brain cortices with a pair of micro forceps.

Primer Nöron Kültürü için E16-E18 Fare Embriyolarından Beyinlerin İzole Edilmesi

Brain Dissociation and Seeding of Cortical Neurons in Cell Culture 

To begin, mince the isolated brains into pieces in the 50-milliliter conical tube with a sterile disposable scalpel blade. Add trypsin to the tube at a final concentration of 0.25%Immerse the tube in a 35 to 38 degrees Celsius hot water bath for 15 minutes. Gently pipette the tissue suspension up and down to dissociate cells.Then add 0.5 milliliters of fetal bovine serum to the homogenized suspension to neutralize trypsin activity. Filter the cell suspension through the 70-micrometer nylon mesh cell strainer. Using a one-milliliter syringe plunger, gently grind the tissue into the cell strainer.Then centrifuge the conical tube at 300 g for five minutes at four degrees Celsius. Discard the Poly-L-Ornithine in the T25 flasks and rinse the flasks three times with five milliliters of PBS. Carefully decant the tube to remove the supernatant and resuspend the cell pellet by gently pipetting with two to three milliliters of complete neurobasal media.Plate the cells in the Poly-L-Ornithine-coated T25 flasks with approximately 20 million cells per flask in five milliliters of complete neurobasal media. Incubate the cell culture at 37 degrees Celsius in a 5%carbon dioxide incubator. Neurons in T25 flasks and 96-well plates adhered and formed neurite processes by day three.Suboptimal neuron cultures contained cell clumps and debris.

Beyin Ayrışması ve Hücre Kültüründe Kortikal Nöronların Tohumlanması 

Co-Culture of Primary Neurons and Microglia for Studying Microglia-Neuron Interactions

To begin, take neurons grown in T25 flasks for co-culture. Replace the media with five milliliters of versene solution containing trypsin and Dnase I.Add 0.5 milliliters of fetal bovine serum to neutralize the trypsin and Dnase I.Transfer cells to a 15 milliliter conical tube. Wash the flask with five milliliters of complete neurobasal media once to maximize the collected neurons.Then, centrifuge the cell suspension at 300 G for five minutes at four degrees celsius. After discarding the supernatant, gently resuspend the cell pellet in two to three milliliters of complete neurobasal media. Seed 100 microliters of the cell suspension to each well to obtain 75, 000 neurons per well, between eight to 10 days of mixed glia cultivation.Using a 10 milliliter pipette, gently wash the T75 flasks with glia culture media to collect microglia and transfer the cells and media into a sterile 50 milliliter conical tube. Centrifuge the cell collection at 300 G for five minutes at four degrees celsius. Once the supernatant is removed, gently resuspend the pellet in two milliliters of complete neurobasal media.From the 96-well neuronal culture plate, remove 100 microliters of neurobasal media and add 100 microliters of 250, 000 cells per milliliter cell suspension. In co-culture round and large microglia were observed on top or between neurons and neurite processes.