Name: actin co-sedimentation assay; for the analysis of protein binding to f-actin
Uploaded: 2008-03-28T01:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Actin Co-Sedimentation Assay; for the Analysis of Protein Binding to F-Actin at JoVE.com

Wir danken Ihnen, Dr. Praveen Kumar in der Wittman Labor am UCSF für den Film von Aktin in HaCaT-Zellen.

1. Vorbereitung von Aktin Die Quelle von Aktin in diesem Test verwendet wurde non-muscle menschlichen Blutplättchen (β-Aktin) von Zytoskelett Inc. Stock Aliquots bei 10 mg / ml in der -70 ° C Gefrierschrank aufbewahrt erhalten. Für den Test wird die Aktin bis 0,4 mg / ml in einem Puffer, enthaltend 5 mM Tris pH 8, 0,2 mM CaCl 2, 0,2 mM ATP und 0,5 mM DTT, bei 20.000 g für 10 Minuten zentrifugiert bei 4 º C verdünnt Der Überstand, der monomeren Aktin ist bereit, polymerisiert ...

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	<li>Senetar, M. A., Foster, S. J., McCann, R. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intrasteric+inhibition+mediates+the+interaction+of+the+I/LWEQ+module+proteins+Talin1,+Talin2,+Hip1,+and+Hip12+with+actin.">Intrasteric inhibition mediates the interaction of the I/LWEQ module proteins Talin1, Talin2, Hip1, and Hip12 with actin.</a> Biochemistry. 14, 15418-15428 (2004).</li><li>Goldmann, W. H., Hess, D., Isenberg, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effect+of+intact+talin+and+talin+tail+fragment+on+actin+filament+dynamics+and+structure+depends+on+pH+and+ionic+strength.">The effect of intact talin and talin tail fragment on actin filament dynamics and structure depends on pH and ionic strength.</a> Eur J Biochem. 260, 439-445 (1999).</li><li>Lee, H., Bellin, R. M., Walker, D. L., Patel, B., Powers, P., Liu, H., Garcia-Alvarez, B., de Pereda, J., Liddington, R. C., Volkmann, N., Hanein, D., Critchley, D. R., Robson, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+an+Actin-binding+Site+within+the+Talin+FERM+Domain.">Characterization of an Actin-binding Site within the Talin FERM Domain.</a> J Mol Biol. 22, 771-784 (2004).</li></ol>

Aktin co-Sedimentation ist ein einfaches in vitro-Assay zur specfic Proteine ​​die Bindung an F-Aktin zu analysieren. In diesem Video zeigen wir ein Beispiel, wie eine einfache Aktin co-Sedimentation durchgeführt werden kann. Wir zeigen, wie F-Aktin vorbereiten, bereiten das Protein getestet werden und das Verfahren von Aktin co-Sedimentation. Eine Reihe von Punkten zu beachten bei der Durchführung von Aktin-Co-Sedimentation Assays werden. Zum Beispiel kann der Puffer-Komponenten für die Inkubation je nach Protein getestet und pH-Wer...

actin co-sedimentation assay; for the analysis of protein binding to f-actin

Das Aktin-Zytoskelett in der Zelle ist ein Netzwerk von Aktin-Filamenten, die die Bewegung von Zellen und zelluläre Prozesse ermöglicht, und das erzeugt Spannung und hilft unterhält zelluläre Form. Obwohl das Aktin-Zytoskelett ist eine starre Struktur, es ist eine dynamische Struktur, die ständig Umbau ist. Eine Reihe von Proteinen, um das Aktin-Zytoskelett zu binden. Die Bindung eines bestimmten Proteins zu F-Aktin ist oft erwünscht, zellbiologische Beobachtungen stützen oder besser zu verstehen dynamische Prozesse wegen Umbau des Aktin-Zytoskeletts. Die Aktin-Co-Sedimentation Assay ist ein in-vitro-Test routinemäßig verwendet, um die Bindung spezifischer Proteine ​​oder Proteindomänen mit F-Aktin zu analysieren. Die grundlegenden Prinzipien des Tests beinhalten eine Inkubation des Proteins von Interesse (in voller Länge oder Domäne) mit F-Aktin, Ultrazentrifugationsschritt zu Pellets F-Aktin und Analyse des Proteins co-sedimentiert mit F-Aktin. Aktin co-Sedimentation Assays können entsprechend ausgelegt sein, um Aktin Bindungsaffinitäten und im Wettbewerb Assays messen.

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Actin Co-Sedimentation Assay; for the Analysis of Protein Binding to F-Actin

Proteine ​​binden an filamentösen Aktin (F-Aktin) durch verschiedene Aktin-bindende Module. In diesem Video zeigen wir das Verfahren von Aktin co-Sedimentation, die eine in vitro-Assay routinemäßig verwendet, um Proteine ​​oder bestimmte Domänen, die F-Aktin binden zu analysieren.

Aktin Co-Sedimentation Assay; für die Analyse von Protein-Bindung an F-Aktin

The actin cytoskeleton within the cell is a network of actin filaments that allows the movement of cells and cellular processes, and that generates ...

Research

JoVE Journal

Biology

A Neuronal and Astrocyte Co-Culture Assay for High Content Analysis of Neurotoxicity

Eine Neuronale und Astrocyte Co-Kultur-Assay für High Content Analyse der Neurotoxizität

High Content Analysis (HCA) assays combine cells and detection reagents with automated imaging and powerful image analysis algorithms, allowing ...

Forschung

Biologie

Detection of Protein Ubiquitination

Detektion von Protein Ubiquitination

Ubiquitination, the covalent attachment of the polypeptide ubiquitin to target proteins, is a key posttranslational modification carried out by a set of ...

Live Cell Imaging of F-actin Dynamics via Fluorescent Speckle Microscopy (FSM)

Live Cell Imaging of F-actin Dynamics via Fluorescent Speckle Microscopy FSM

Live Cell Imaging von F-Aktin Dynamics über Fluorescent Speckle Microscopy (FSM)

In this protocol we describe the use of Fluorescent Speckle Microscopy (FSM) to capture high-resolution images of actin dynamics in PtK1 cells. A unique ...

Using the GELFREE 8100 Fractionation System for Molecular Weight-Based Fractionation with Liquid Phase Recovery

Mit dem GELFREE 8100 Fraktionierung System für Molecular Weight-Based Fraktionierung mit Liquid Phase Wiederherstellung

The GELFREE 8100 Fractionation System is a novel protein fractionation system designed to maximize protein recovery during molecular weight based ...

Linearization of the Bradford Protein Assay

Linearisierung der Bradford Protein Assay

Determination of microgram quantities of protein in the Bradford Coomassie brilliant blue assay is accomplished by measurement of absorbance at 590 nm. ...

PAR-CliP - A Method to Identify Transcriptome-wide the Binding Sites of RNA Binding Proteins

PAR-Clip - Ein Verfahren zur Transkriptom-weiten die Bindungsstellen des RNA-bindende Proteine ​​Identifizieren

RNA transcripts are subjected to post-transcriptional gene regulation by interacting with hundreds of RNA-binding proteins (RBPs) and microRNA-containing ...

Study of the Actin Cytoskeleton in Live Endothelial Cells Expressing GFP-Actin

Studie des Aktin-Zytoskeletts in Live Endothelial Cells, die GFP-Aktin

The microvascular endothelium plays an important role as a selectively permeable barrier to fluids and solutes. The adhesive junctions between endothelial ...

A Liquid Phase Affinity Capture Assay Using Magnetic Beads to Study Protein-Protein Interaction: The Poliovirus-Nanobody Example

Eine flüssige Phase Affinity Capture Assay Verwendung von magnetischen Kügelchen, um Protein-Protein Interaktion Studie: Das Poliovirus-Nanobody Beispiel

In this article, a simple, quantitative, liquid phase affinity capture assay is presented. Provided that one protein can be tagged and another protein ...

A High Throughput MHC II Binding Assay for Quantitative Analysis of Peptide Epitopes

Ein hoher Durchsatz MHC II-Bindungsassay für die quantitative Analyse von Peptid-Epitope

Biochemical assays with recombinant human MHC II molecules can provide rapid, quantitative insights into immunogenic epitope identification, deletion, or ...

Reporter-based Growth Assay for Systematic Analysis of Protein Degradation

Reporter-basierten Wachstumstest für die systematische Analyse von Proteinabbau

Protein degradation by the ubiquitin-proteasome system (UPS) is a major regulatory mechanism for protein homeostasis in all eukaryotes. The standard ...