Name: actin co-sedimentation assay; for the analysis of protein binding to f-actin
Uploaded: 2008-03-28T01:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Actin Co-Sedimentation Assay; for the Analysis of Protein Binding to F-Actin at JoVE.com

Tack till Dr Praveen Kumar i Wittman labbet vid UCSF för filmen av aktin i HaCAT celler.

1. Beredning av aktin Källan till aktin som används i denna analys var icke-muskel humana trombocyter (β-aktin) som erhållits från cytoskelettet Inc. Stock alikvoter vid 10 mg / ml förvaras i -70 º C frys. För analysen är aktin utspädd till 0,4 mg / ml i en buffert innehållande 5 mM Tris pH 8, 0,2 mM CaCl 2, 0,2 mM ATP och 0,5 mM DTT, centrifugeras vid 20 tusen g under 10 minuter vid 4 ° C. Supernatanten, som är monomera aktin är redo att polymeriserat. Actin polymerisa...

<ol>
	<li>Senetar, M. A., Foster, S. J., McCann, R. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intrasteric+inhibition+mediates+the+interaction+of+the+I/LWEQ+module+proteins+Talin1,+Talin2,+Hip1,+and+Hip12+with+actin.">Intrasteric inhibition mediates the interaction of the I/LWEQ module proteins Talin1, Talin2, Hip1, and Hip12 with actin.</a> Biochemistry. 14, 15418-15428 (2004).</li><li>Goldmann, W. H., Hess, D., Isenberg, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effect+of+intact+talin+and+talin+tail+fragment+on+actin+filament+dynamics+and+structure+depends+on+pH+and+ionic+strength.">The effect of intact talin and talin tail fragment on actin filament dynamics and structure depends on pH and ionic strength.</a> Eur J Biochem. 260, 439-445 (1999).</li><li>Lee, H., Bellin, R. M., Walker, D. L., Patel, B., Powers, P., Liu, H., Garcia-Alvarez, B., de Pereda, J., Liddington, R. C., Volkmann, N., Hanein, D., Critchley, D. R., Robson, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+an+Actin-binding+Site+within+the+Talin+FERM+Domain.">Characterization of an Actin-binding Site within the Talin FERM Domain.</a> J Mol Biol. 22, 771-784 (2004).</li></ol>

Aktin samarbete sedimentering är ett enkelt in vitro-analys för att analysera specfic proteiner binder till F-aktin. I denna video visar vi ett exempel på hur en enkel aktin samarbete sedimentering kan ske. Vi visar hur man förbereder F-aktin, förbereda det protein som ska testas och det förfarande av aktin co-sedimentering. Ett antal punkter bör beaktas vid utförandet av aktin samarbete sedimentering analyser. Till exempel kan bufferten komponenter för odling varierar beroende på det protein som ska testas och pH, ​​temperatu...

actin co-sedimentation assay; for the analysis of protein binding to f-actin

Den aktin cytoskelettet i cellen är ett nätverk av aktin filament som tillåter förflyttning av celler och cellulära processer, och som genererar spänningar och hjälper upprätthåller cellulära form. Även aktin cytoskelettet är en styv konstruktion, det är en dynamisk struktur som ständigt remodeling. Ett antal proteiner kan binda till aktin cytoskelettet. Bindningen av ett visst protein till F-aktin är ofta önskat att stödja cellbiologiska observationer eller att ytterligare förstå dynamiska processer på grund av ombyggnad av aktin cytoskelettet. Actin co-sedimentering analysen är ett in vitro-test rutinmässigt används för att analysera bindning av specifika proteiner eller domäner protein med F-aktin. De grundläggande principerna för analysen innebär en inkubationstid av proteinet av intresse (full längd eller domän) med F-aktin, ultracentrifugering steg till pellets F-aktin och analys av proteinet tillsammans sedimenterande med F-aktin. Aktin samarbete sedimentering analyser kan utformas därför för att mäta aktin bindande tillhörighet och i analyser konkurrens.

Watch this Scientific Journal Video about Actin Co-Sedimentation Assay; for the Analysis of Protein Binding to F-Actin at JoVE.com

Actin Co-Sedimentation Assay; for the Analysis of Protein Binding to F-Actin

Proteiner som binder till fintrådiga aktin (F-aktin) genom distinkta aktin bindande moduler. I denna video visar vi förfarandet med aktin samarbete sedimentering, vilket är ett in vitro-test rutinmässigt används för att analysera proteiner eller specifika områden som binder F-aktin.

Aktin Co-Sedimentering-analys, för analys av proteinbindning till F-Actin

The actin cytoskeleton within the cell is a network of actin filaments that allows the movement of cells and cellular processes, and that generates ...

Research

JoVE Journal

Biology

A Neuronal and Astrocyte Co-Culture Assay for High Content Analysis of Neurotoxicity

En Neuronal och astrocyternas Co-Kultur-analys för High innehållsanalys av Neurotoxicitet

High Content Analysis (HCA) assays combine cells and detection reagents with automated imaging and powerful image analysis algorithms, allowing ...

Detection of Protein Ubiquitination

Detektion av protein Ubiquitination

Ubiquitination, the covalent attachment of the polypeptide ubiquitin to target proteins, is a key posttranslational modification carried out by a set of ...

Live Cell Imaging of F-actin Dynamics via Fluorescent Speckle Microscopy (FSM)

Live Cell Imaging of F-actin Dynamics via Fluorescent Speckle Microscopy FSM

Levande cell imaging av F-aktin Dynamics via Fluorescent Speckle Mikroskopi (FSM)

In this protocol we describe the use of Fluorescent Speckle Microscopy (FSM) to capture high-resolution images of actin dynamics in PtK1 cells. A unique ...

Using the GELFREE 8100 Fractionation System for Molecular Weight-Based Fractionation with Liquid Phase Recovery

Använda GELFREE 8100 Fraktionering System för Molekylär viktbaserad fraktionering med vätskefasen Recovery

The GELFREE 8100 Fractionation System is a novel protein fractionation system designed to maximize protein recovery during molecular weight based ...

Linearization of the Bradford Protein Assay

Linjärisering av Bradford Protein-analys

Determination of microgram quantities of protein in the Bradford Coomassie brilliant blue assay is accomplished by measurement of absorbance at 590 nm. ...

PAR-CliP - A Method to Identify Transcriptome-wide the Binding Sites of RNA Binding Proteins

PAR-Clip - En metod för att identifiera transkriptom hela bindningar på RNA-proteiner

RNA transcripts are subjected to post-transcriptional gene regulation by interacting with hundreds of RNA-binding proteins (RBPs) and microRNA-containing ...

Study of the Actin Cytoskeleton in Live Endothelial Cells Expressing GFP-Actin

Studie av Actin cytoskelettet i Live endotelceller uttrycka GFP-Actin

The microvascular endothelium plays an important role as a selectively permeable barrier to fluids and solutes. The adhesive junctions between endothelial ...

A Liquid Phase Affinity Capture Assay Using Magnetic Beads to Study Protein-Protein Interaction: The Poliovirus-Nanobody Example

En vätskefas affinitetsinfångning Analys med användning av magnetiska pärlor för att studera protein-proteininteraktion: polioviruset-Nanobody Exempel

In this article, a simple, quantitative, liquid phase affinity capture assay is presented. Provided that one protein can be tagged and another protein ...

A High Throughput MHC II Binding Assay for Quantitative Analysis of Peptide Epitopes

En hög genomströmning MHC II-bindningsanalys för kvantitativ analys av peptidepitoper

Biochemical assays with recombinant human MHC II molecules can provide rapid, quantitative insights into immunogenic epitope identification, deletion, or ...

Reporter-based Growth Assay for Systematic Analysis of Protein Degradation

Reporter baserade tillväxtanalys för systematisk analys av proteinnedbrytning

Protein degradation by the ubiquitin-proteasome system (UPS) is a major regulatory mechanism for protein homeostasis in all eukaryotes. The standard ...