Name: in vitro and in vivo bioluminescence reporter gene imaging of human embryonic stem cells
Uploaded: 2008-05-02T17:59:00
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Graças a Tim Doyle, PhD e do Centro de Stanford para In Vivo Imaging para assistência com a imagem de bioluminescência. Também graças à Ngan Huang, PhD para compartilhar sua técnica sobre células-tronco co-injeção com uma solução matriz. Por último, graças a Steve Felt, Ph.D. de assistência com cuidados animais veterinária.

<ol><li> Construção de Gene Double Fusion Reporter <ol><li> A fim de realizar imagem de bioluminescência de células estaminais embrionárias humanas, é preciso primeiro obter células que expressam de forma estável um gene repórter luciferase, como vaga-lume luciferase dirigido por um promotor constitutivo como Ubiquitina ou EF1a. </li><li> O foco deste protocolo é em aplicações gene repórter, então os procedimentos detalhados não são fornecidos aqui. No entanto, a estratégia geral do nosso laboratório é usar u...

<ol>
	<li>Passier, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Increased+cardiomyocyte+differentiation+from+human+embryonic+stem+cells+in+serum-free+cultures.">Increased cardiomyocyte differentiation from human embryonic stem cells in serum-free cultures.</a> Stem Cells. 23, 772-780 (2003).</li><li>Laflamme, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiomyocytes+derived+from+human+embryonic+stem+cells+in+pro-survival+factors+enhance+function+of+infarcted+rat+hearts.">Cardiomyocytes derived from human embryonic stem cells in pro-survival factors enhance function of infarcted rat hearts.</a> Nature biotechnology. 25, 1015-1024 (2007).</li><li>Baharvand, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neural+differentiation+from+human+embryonic+stem+cells+in+a+defined+adherent+culture+conditi.">Neural differentiation from human embryonic stem cells in a defined adherent culture conditi.</a> Int J Dev Biol. 51, 371-378 (2007).</li><li>Schulz, T. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Directed+neuronal+differentiation+of+human+embryonic+stem+cells.">Directed neuronal differentiation of human embryonic stem cells.</a> BMC Neurosci. 4, (2007).</li><li>Jiang, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+Insulin-producing+Islet-like+Clusters+from+Human+Embryonic+Stem+Cells.">Generation of Insulin-producing Islet-like Clusters from Human Embryonic Stem Cells.</a> Stem Cells. 17, 17 (2007).</li><li>Swijnenburg, R. J., van der Bogt, K. E. A., Sheikh, A. Y., Cao, F., Wu, J. 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S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Construction+and+validation+of+improved+triple+fusion+reporter+gene+vectors+for+molecular+imaging+of+living+subjects.">Construction and validation of improved triple fusion reporter gene vectors for molecular imaging of living subjects.</a> Cancer Res. 67, 3085-3093 (2007).</li><li>Cao, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+visualization+of+embryonic+stem+cell+survival,+proliferation,+and+migration+after+cardiac+delivery.">In vivo visualization of embryonic stem cell survival, proliferation, and migration after cardiac delivery.</a> . Circulation. 113, 1005-1014 (2006).</li><li>Cao, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+Imaging+of+Embryonic+Stem+Cell+Misbehavior+and+Suicide+Gene+Ablation.">Molecular Imaging of Embryonic Stem Cell Misbehavior and Suicide Gene Ablation.</a> Cloning and Stem Cells. 9, 107-117 (2007).</li><li>Ray, P., De, A., Min, J. J., Tsien, R. Y., Gambhir, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+tri-fusion+multimodality+reporter+gene+expression+in+living+subjects.">Imaging tri-fusion multimodality reporter gene expression in living subjects.</a> Cancer Res. 64, 1323-1330 (2004).</li><li>Wu, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteomic+analysis+of+reporter+genes+for+molecular+imaging+of+transplanted+embryonic+stem+cells.">Proteomic analysis of reporter genes for molecular imaging of transplanted embryonic stem cells.</a> Proteomics. 6, 6234-6249 (2006).</li><li>Eiges, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishment+of+human+embryonic+stem+cell-transfected+clones+carrying+a+marker+for+undifferentiated+cells.">Establishment of human embryonic stem cell-transfected clones carrying a marker for undifferentiated cells.</a> Curr Biol. 11, 514-518 (2001).</li><li>Mohr, J. C., de Pablo, J. J., Palecek, S. 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G., Draper, J. S., Walsh, J., Moore, H., Andrews, P. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Transient and Stable Transgene Expression in Human Embryonic Stem Cell. , .</li></ol>

Em comparação com outras modalidades, tais como PET e RM, a bioluminescência tem resolução espacial limitada penetração nos tecidos e reduzido devido à energia relativamente fraca de fótons emitidos (2-3 eV); por estas razões que até agora não foi aplicável em animais de grande porte. No entanto, a bioluminescência tem a vantagem de ser de baixo custo, alto rendimento, e não-invasivo, tornando-se altamente desejável para in vivo com células-tronco de rastreamento em pequenos animais. Genes não bioluminescência-repórter, ...

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		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>HyClone</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>BD Matrigel&#x2122; Basement Membrane Matrix</td>
<td>Growth factor reduced (optional: phenol-red free)</td>
<td>BD Biosciences</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>mTeSR1 Maintenance Medium for Human Embryonic Stem Cells</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>StemCell Technologies</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Phosphate Buffered Saline (PBS)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>D-Luciferin Firefly, potassium salt</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Biosynth AG</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Collagenase IV solution</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Dissolve 30 mg Collagenase Type IV in 30 mL DMEM-F12 media. Sterile filter and store at 4 degrees (Celsius).</td>
</tr>
<tr>
<td>Baked Pasteur pipets</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>6-well tissue culture-treated plates</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>TPP</td>
<td>92006</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

in vitro and in vivo bioluminescence reporter gene imaging of human embryonic stem cells

A descoberta de células estaminais embrionárias humanas (hESCs) aumentou drasticamente as ferramentas disponíveis para cientistas médicos interessados ​​em medicina regenerativa. No entanto, a injeção direta de hESCs e células diferenciadas de hESCs, em organismos vivos até agora tem sido dificultada pela morte celular significativa, a formação de teratoma, e rejeição imune do hospedeiro. Compreensão do comportamento em CTEh vivo após o transplante exige técnicas de imagem inovadora para monitorar longitudinalmente localização CTEh, proliferação e viabilidade. A imagem molecular tem dado investigadores um meio de alto rendimento, baixo custo, e sensível para o rastreamento na proliferação celular vivo ao longo de dias, semanas e até meses. Este avanço tem aumentado significativamente a compreensão da cinética espaço-temporal de enxerto CTEh, proliferação e formação de teratoma, nos indivíduos que vivem. Um grande avanço em imagem molecular tem sido a extensão dos ensaios não-invasivo gene repórter da biologia molecular e celular em plataformas in vivo modalidade multi-imagem. Estes genes repórter, sob controle de promotores e potenciadores de engenharia que se aproveitam da maquinaria transcricional da célula hospedeira s, são introduzidas nas células usando uma variedade de métodos de vetor e vetor não. Uma vez na célula, genes repórter pode ser transcrita ou constitutivamente ou apenas sob determinadas condições biológicas ou celular, dependendo do tipo de promotor usado. Transcrição e tradução de genes repórter em proteínas bioativas é detectada com instrumentação, sensível não-invasiva (por exemplo, câmeras CCD) usando o sinal de geração de sondas, tais como D-luciferina. Para evitar a necessidade de luz de excitação para rastrear as células-tronco in vivo como é necessário para imagens de fluorescência, bioluminescência repórter sistemas de imagem gene exigem apenas uma sonda exogenamente administrada para induzir a emissão de luz. Firefly luciferase, derivado do Photinus firefly pyralis, codifica uma enzima que catalisa D-luciferina ao opticamente metabólito ativo, oxiluciferina. Atividade óptica pode ser monitorada com uma câmera CCD externa. Estavelmente transduzidas células que carregam o repórter construir dentro de seu DNA cromossômico vai passar o repórter construção de DNA para as células filhas, que permitam um acompanhamento longitudinal de sobrevivência e proliferação CTEh in vivo. Além disso, como expressão do produto do gene repórter é necessário para a geração do sinal, apenas as células viáveis ​​pai e filha vai criar sinal de bioluminescência; células apoptóticas ou morto, não. Neste vídeo, os materiais e métodos específicos necessários para a proliferação de rastreamento de células-tronco e formação de teratoma com a imagem de bioluminescência será descrito.

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In vitro and in vivo Bioluminescence Reporter Gene Imaging of Human Embryonic Stem Cells

Com o crescente interesse em terapias com células-tronco, técnicas de imagem molecular são ideais para monitorar o comportamento de células-tronco após o transplante. Genes repórter luciferase permitiram não-invasivo de avaliação, repetitiva de sobrevivência da célula, localização e proliferação in vivo. Este vídeo vai demonstrar como controlar a proliferação CTEh em um rato vivo.

In vitro e in vivo de imagens Gene Reporter bioluminescência de células estaminais embrionárias humanas

The discovery of human embryonic stem cells (hESCs) has dramatically increased the tools available to medical scientists interested in regenerative ...

Research

JoVE Journal

Biology

Derivation of Human Embryonic Stem Cells by Immunosurgery

Derivação de células estaminais embrionárias humanas por Immunosurgery

The ability of human embryonic stem cells to self-renew and differentiate into all cell types of 
the body suggests that they hold great promise for both ...

Biologia

Probing for Mitochondrial Complex Activity in Human Embryonic Stem Cells

Sondagem para a Atividade Complexo mitocondrial em células estaminais embrionárias humanas

Mitochondria are cytoplasmic organelles that have a primary role in cellular metabolism and homeostasis, regulation of the cell signaling network, and ...

In vitro Labeling of Human Embryonic Stem Cells for Magnetic Resonance Imaging

Na rotulagem in vitro de células estaminais embrionárias humanas para Ressonância Magnética

Human embryonic stem cells (hESC) have demonstrated the ability to restore the injured myocardium. Magnetic resonance imaging (MRI) has emerged as one of ...

Culture and Maintenance of Human Embryonic Stem Cells  

Cultura e Manutenção de células estaminais embrionárias humanas

Human embryonic stem (hES) cells must be monitored and cared for in order to maintain healthy, undifferentiated cultures. At minimum, the cultures must be ...

Freezing and Thawing Human Embryonic Stem Cells

Congelamento e descongelamento, células estaminais embrionárias humanas

Since James Thomson et al developed a technique in 1998 to isolate and grow hES in culture, freezing cells for later use and thawing and expanding cells ...

Implantation of Ferumoxides Labeled Human Mesenchymal Stem Cells in Cartilage Defects

Implantação de Ferumoxides identificadas células-tronco mesenquimais em defeitos da cartilagem

The field of tissue engineering integrates the principles of engineering, cell biology and medicine towards the regeneration of specific cells and ...

Video Bioinformatics Analysis of Human Embryonic Stem Cell Colony Growth

Vídeo Bioinformática Análise de Crescimento Humano embrionárias Colony Stem Cell

Because video data are complex and are comprised of many images, mining information from video material is difficult to do without the aid of computer ...

Differentiation of Embryonic Stem Cells into Oligodendrocyte Precursors

Diferenciação de células-tronco embrionárias em precursores oligodendroglial

Oligodendrocytes are the myelinating cells of the central nervous system. For regenerative cell therapy in demyelinating diseases, there is significant ...

Efficient Derivation of Human Cardiac Precursors and Cardiomyocytes from Pluripotent Human Embryonic Stem Cells with Small Molecule Induction

Derivação eficiente dos recursos humanos Precursores cardíaca e Cardiomyocytes pluripotentes a partir de células estaminais embrionárias humanas com a indução de moléculas pequenas

To date, the lack of a suitable human cardiac cell source has been the major setback in regenerating the human myocardium, either by cell-based ...

Reprogramming Human Somatic Cells into Induced Pluripotent Stem Cells (iPSCs) Using Retroviral Vector with GFP

Reprogramming Human Somatic Cells into Induced Pluripotent Stem Cells iPSCs Using Retroviral Vector with GFP

Reprogramação de células somáticas humanas em células tronco pluripotentes induzidas (iPSCs) usando vetor retroviral com GFP

Human embryonic stem cells (hESCs) are pluripotent and an invaluable cellular sources for in vitro disease modeling and regenerative medicine1. It has ...