Name: application of a c. elegans dopamine neuron degeneration assay for the validation of potential parkinson's disease genes
Uploaded: 2008-07-18T23:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Application of a C. elegans Dopamine Neuron Degeneration Assay for the Validation of Potential Parkinson's Disease Genes at JoVE.com

Wij willen de coöperatieve geest van alle Caldwell Lab-leden erkennen. Bewegingsstoornissen onderzoek in het lab is ondersteund door de Bachmann-Strauss Dystonie &amp; Parkinson Foundation, Verenigde Parkinson Foundation, American Ziekte van Parkinson Vereniging, de ziekte van Parkinson Vereniging van Alabama, de Michael J. Fox Foundation voor onderzoek van Parkinson, en een Undergraduate Research

A. expressieplasmide Bouw Twee plasmiden zijn nodig: een voor weefsel-specifieke expressie van het gen van interesse en een tweede als selecteerbare marker transformatie (hoewel de marker plasmide meestal beschikbaar is vanuit de onderzoekswereld). Experimentele Plasmide <ol><li> Selecteer een promotor die wordt uitgedrukt in de weefsels / cellen type van belang, in dit geval, de DA transporter (Pdat-1) promotor wordt gebruikt. Deze uitdrukking plasmide werd opger...

<ol>
	<li>Cao, S., Gelwix, C. C., Caldwell, K. A., Caldwell, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Torsin-mediated+neuroprotection+from+cellular+stresses+to+dopaminergic+neurons+of+C.+elegans.">Torsin-mediated neuroprotection from cellular stresses to dopaminergic neurons of C. elegans.</a> J Neurosci. 25, 3801-3812 (2005).</li><li>Hamamichi, S., Rivas, R. N., Knight, A. L., Cao, S., Caldwell, K. A., Caldwell, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hypothesis-based+RNAi+screening+identifies+neuroprotective+genes+in+a+Parkinson&#x2019;s+disease+model.">Hypothesis-based RNAi screening identifies neuroprotective genes in a Parkinson&#x2019;s disease model.</a> PNAS. 105, 728-733 (2008).</li><li>Cooper, A. A., Gitler, A. D., Cashikar, A., Haynes, C. M., Hill, K. J., Bhullar, B., Liu, K., Xu, K., Strathearn, K. E., Liu, F., Cao, S., Caldwell, K. A., Caldwell, G. A., Marsischky, G., Kolodner, R. D., Labaer, J., Rochet, J. C., Bonini, N. M., Lindquist, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=alpha-synuclein+blocks+ER-golgi+traffic+and+Rab1+rescues+neuron+loss+in+Parkinson's+models.">alpha-synuclein blocks ER-golgi traffic and Rab1 rescues neuron loss in Parkinson's models.</a> Science. 313, 324-328 (2006).</li><li>Gitler, A. D., Bevis, B. J., Shorter, J., Strathearn, K. E., Hamamichi, S., Su, L. J., Caldwell, K. A., Caldwell, G. A., Rochet, J. -. C., McCaffery, J. M., Barlowe, C., Lindquist, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Parkinson's+disease+protein+alpha-synuclein+disrupts+cellular+Rab+homeostasis.">The Parkinson's disease protein alpha-synuclein disrupts cellular Rab homeostasis.</a> PNAS. 105, 145-150 (2008).</li><li>Caldwell, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integrated+Genomics:+A+Discovery-Based+Laboratory+Course.">Integrated Genomics: A Discovery-Based Laboratory Course.</a> , (2006).</li><li>Brenner, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+genetics+of+Caenorhabditis+elegans.">The genetics of Caenorhabditis elegans.</a> Genetics. 77, 71-94 (1974).</li><li>Gandhi, S., Santelli, J., Mitchell, J. D. H., Stiles, J. W., Sanadi, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+method+for+maintaining+large,+aging+populations+of+Caenorhabditis+elegans.">A simple method for maintaining large, aging populations of Caenorhabditis elegans.</a> Mechanisms of Ageing and Development. 12, 137-150 (1980).</li></ol>

De leeftijd-afhankelijke verlies van dopamine neuronen is een klinisch kenmerk van de ziekte van Parkinson en is in verband gebracht met de accumulatie of misfolding van een eiwit genaamd alfa-synucleïne. Hier laten we zien hoe een label, via een fluorescerende transgen, de dopaminerge neuronen van C. elegans en bootsen de neurodegeneratie gezien bij de ziekte van Parkinson door coexpressing menselijk alfa-synucleïne in deze cellen. Deze video toont de methodologie voor de groei, de genetische kruising, montage, en scoren...

<!DOCTYPE html PUBLIC "-//W3C//DTD XHTML 1.0 Transitional//EN" "http://www.w3.org/TR/xhtml1/DTD/xhtml1-transitional.dtd">
<html xmlns="http://www.w3.org/1999/xhtml" xml:lang="en" lang="en">	
		
		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>Agarose</td>
<td>Ultrapure</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>15510-027</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Coverglass 20x30 mm</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fisher</td>
<td>12-548-5A</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Microscope Slides</td>
<td>Plain, 3x1"</td>
<td>Fisher</td>
<td>12-549</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Dissecting with Fluorescence</td>
<td>Microscope</td>
<td>Nikon</td>
<td>SMZ800</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Dissecting</td>
<td>Microscope</td>
<td>Nikon</td>
<td>SMZ645</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Epifluorescent</td>
<td>Microscope</td>
<td>Nikon</td>
<td>Model E-800</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Filter Cube, GFP HYQ</td>
<td>Endow Bandpass</td>
<td>Chroma Technology</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

application of a c. elegans dopamine neuron degeneration assay for the validation of potential parkinson's disease genes

Verbeteringen aan de diagnose en behandeling van de ziekte van Parkinson (PD) zijn afhankelijk van de kennis over de gevoeligheid factoren die de bevolking maakt in gevaar. In het proces van een poging om nieuwe genetische factoren die samenhangen met ziekte van Parkinson te identificeren, hebben wetenschappers gegenereerd vele lijsten van kandidaat-genen, polymorfismen, en eiwitten die belangrijke vorderingen te vertegenwoordigen, maar deze leidt blijven mechanistisch undefined. Ons werk is erop gericht in de richting van aanzienlijk vernauwing deze lijsten door gebruik te maken van de voordelen van een eenvoudig dier modelsysteem. Terwijl de mensen hebben miljarden neuronen, de microscopische rondworm Caenorhabditis elegans is precies 302, waarvan er slechts acht produceren dopamine (DA) in hemaphrodites. Expressie van een menselijk gen dat codeert voor het PD-geassocieerd eiwit, alfa-synucleïne, in C. elegans DA neuronen resulteert in een dosering en leeftijdsafhankelijke neurodegeneratie. Wormen die humaan alfa-synucleïne in DA neuronen isogene en express zowel GFP en het menselijk alfa-synucleïne onder de DA-transporter promotor (Pdat-1). De aanwezigheid van GFP dient als een gemakkelijk gevisualiseerd marker voor de volgende DA neurodegeneratie bij deze dieren. We in eerste instantie aangetoond dat alfa-synucleïne-geïnduceerde DA neurodegeneratie zouden kunnen worden gered bij deze dieren door torsinA, een eiwit met moleculaire chaperone activiteit 1. Verder, de kandidaat-PD-gerelateerde genen geïdentificeerd in ons lab via grote schaal RNAi screening inspanningen met behulp van een alfa-synucleïne misfolding test werden vervolgens over-uitgedrukt in C. elegans DA neuronen. We hebben vastgesteld dat vijf van de zeven genen vertegenwoordigd belangrijke kandidaat-modulatoren van PD getest als ze gered alfa-synucleïne-geïnduceerde DA neurodegeneratie 2. Daarnaast heeft de Lindquist Lab (dit nummer van Jove) uitgevoerd gist schermen, waarbij alfa-synucleïne-afhankelijke toxiciteit wordt gebruikt als een uitlezing voor de genen die kunnen versterken of onderdrukken cytotoxiciteit. We vervolgens de gist kandidaat genen onderzocht in onze C. elegans alfa-synucleïne-geïnduceerde neurodegeneratie assay en met succes gevalideerd veel van deze doelstellingen 3, 4. Onze methodologie bestaat genereren van een C. elegans DA neuron-specifieke expressie vector met behulp van recombinationele klonen van kandidaat-gen cDNA onder controle van de Pdat-1 promotor. Deze plasmiden worden dan gemicroinjecteerd in wild-type (N2) wormen, samen met een selecteerbare merker voor succesvolle transformatie. Meerdere stabiele transgene lijnen de productie van de kandidaat-eiwit in DA neuronen worden verkregen en vervolgens onafhankelijk van elkaar gekruist in de alfa-synucleïne degeneratieve stam en beoordeeld voor neurodegeneratie, zowel op het dier en de individuele neuron-niveau, in de loop van het ouder worden.

Watch this Scientific Journal Video about Application of a C. elegans Dopamine Neuron Degeneration Assay for the Validation of Potential Parkinson's Disease Genes at JoVE.com

Application of a C. elegans Dopamine Neuron Degeneration Assay for the Validation of Potential Parkinson's Disease Genes

Deze video laat zien hoe C. elegans te gebruiken om dopaminerge neuron neurodegeneratie te beoordelen als een model voor de ziekte van Parkinson. Verder worden genetische screens gebruikt om de factoren die een verbetering van degeneratie of neuroprotectieve identificeren.

Toepassing van een C. elegans Dopamine neuron degeneratie Assay voor de validatie van Potentieel de ziekte van Parkinson Genen

Improvements to the diagnosis and treatment of Parkinson's disease (PD) are dependent upon knowledge about susceptibility factors that render populations ...

Research

JoVE Journal

Biology

Ole Isacson: Development of New Therapies for Parkinson's Disease

Ole Isacson: ontwikkeling van nieuwe therapieën voor de ziekte van Parkinson

Generation of Stable Transgenic C. elegans Using Microinjection

Generatie van Stable transgene C. elegans Met behulp van micro-injectie

Transgenic Caenorhabditis elegans can be readily created via microinjection of a DNA plasmid solution into the gonad 1.  The plasmid DNA rearranges to ...

Murine Model for Parkinson's Disease: from 6-OH Dopamine Lesion to Behavioral Test

Muismodel voor de ziekte van Parkinson: van 6-OH Dopamine Laesie naar Behavioral Test

Parkinson's disease (PD) affects at least 6.5 million people worldwide, irrespective of gender, social, ethnic, economic, or geographic boundaries. Key ...

Generation of Transgenic C. elegans by Biolistic Transformation

Generation of Transgenic C. elegans by Biolistic Transformation

Generatie van transgene C. elegans Door biolistische Transformatie

The number of laboratories using the free living nematode C. elegans is rapidly growing. The popularity of this biological model is attributed to a rapid ...

The Production of C. elegans Transgenes via Recombineering with the galK Selectable Marker

The Production of C. elegans Transgenes via Recombineering with the galK Selectable Marker

De productie van C. elegans Transgenen via Recombineering met de GalK Selecteerbare marker

The creation of transgenic animals is widely utilized in C. elegans research including the use of GFP fusion proteins to study the regulation and ...

Chromosomics: Detection of Numerical and Structural Alterations in All 24 Human Chromosomes Simultaneously Using a Novel OctoChrome FISH Assay

Chromosomics: Detectie van numerieke en structurele veranderingen in alle 24 menselijke chromosomen tegelijk met behulp van een roman OctoChrome FISH-test

Fluorescence in situ hybridization (FISH) is a technique that allows specific DNA sequences to be detected on metaphase or interphase chromosomes in cell ...

Using RNA-mediated Interference Feeding Strategy to Screen for Genes Involved in Body Size Regulation in the Nematode C. elegans

Using RNA-mediated Interference Feeding Strategy to Screen for Genes Involved in Body Size Regulation in the Nematode C. elegans

Met behulp van RNA-gemedieerde interferentie voerstrategie om te screenen op genen die betrokken zijn Lichaam Grootte verordening in de nematode<em&gt; C. elegans</em

Double-strand RNA-mediated interference (RNAi) is an effective strategy to knock down target gene expression1-3. It has been applied to many model systems ...

C. elegans Chemotaxis Assay

C. elegans Chemotaxis Assay

Many organisms use chemotaxis to seek out food sources, avoid noxious substances, and find mates.  Caenorhabditis elegans has impressive chemotaxis ...

A Method for Culturing Embryonic C. elegans Cells

A Method for Culturing Embryonic C. elegans Cells

Een methode voor het kweken van embryonale<em&gt; C. elegans</em&gt; Cellen

C. elegans is a powerful model system, in which genetic and molecular techniques are easily applicable. Until recently though, techniques that require ...

Measuring the Effects of Bacteria on C. Elegans Behavior Using an Egg Retention Assay

Measuring the Effects of Bacteria on C. Elegans Behavior Using an Egg Retention Assay

Het meten van de effecten van bacteriën op<em&gt; C. Elegans</em&gt; Gedrag Met behulp van een Ei Retention Assay

C. elegans egg-laying behavior is  affected by environmental cues such as osmolarity1 and  vibration2. In the total absence of food C. elegans also cease ...