Name: technical demonstration of whole genome array comparative genomic hybridization
Uploaded: 2008-08-05T18:06:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Technical Demonstration of Whole Genome Array Comparative Genomic Hybridization at JoVE.com

Desideriamo ringraziare i membri della Lam Array Wan Lab squadra BAC soprattutto Miwa Suzuki e Bryan Chi per la preparazione di questo articolo. Questo lavoro è stato sostenuto da fondi dal Canadian Institutes for Health Research, Genome Canada / Genome British Columbia, e NIH / NIDCR concedere RO1 DE15965-01.

SONDA ETICHETTATURA Nota: limite di esposizione di coloranti Cye alla luce in ogni momento (questo può essere realizzato lavorando in una zona buia o schermatura dei tubi con una copertura, come un foglio di alluminio) <ol><li> Combina: (Setup 1 tubo di reazione di rinvio e 1 tubo di reazione per il campione) <ul><li> DNA (25-400 ng) </li><li> 5 ml di tampone 5X random primer (concentrazione finale: 5X Promega Klenow tampone e 7 mg / mL octamers casuale) </li><li> ...

<ol>
	<li>Lockwood, W. W., Chari, R., Chi, B., Lam, W. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recent+advances+in+array+comparative+genomic+hybridization+technologies+and+their+applications+in+human+genetics.">Recent advances in array comparative genomic hybridization technologies and their applications in human genetics.</a> European Journal of Human Genetics. 14, 139-1x`48 (2006).</li><li>Ishkanian, A. S., Malloff, C. A., Watson, S. K., deLeeuw, R. J., Chi, B., Coe, B. P., Snijders, A., Albertson, D. G., Pinkel, D., Marra, M. A., Ling, V., MacAulay, C., Lam, W. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+tiling+resolution+DNA+microarray+with+complete+coverage+of+the+human+genome.">A tiling resolution DNA microarray with complete coverage of the human genome.</a> Nature Genetics. 36, 299-303 (2004).</li><li>Watson, S. K., DeLeeuw, R. J., Ishkanian, A. S., Malloff, C. A., Lam, W. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+for+high+throughput+validation+of+amplified+fragment+pools+of+BAC+DNA+for+constructing+high+resolution+CGH+arrays.">Methods for high throughput validation of amplified fragment pools of BAC DNA for constructing high resolution CGH arrays.</a> BMC Genomics. 5, 6 (2004).</li><li>Watson, S. K., DeLeeuw, R. J., Horsman, D. E., Squire, J. A., Lam, W. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytogenetically+balanced+translocations+are+associated+with+focal+copy+number+alterations.">Cytogenetically balanced translocations are associated with focal copy number alterations.</a> Human Genetics. 120, 795-805 (2007).</li><li>Chi, B., DeLeeuw, R. J., Coe, B. P., MacAulay, C., Lam, W. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SeeGH+--+a+software+tool+for+visualization+of+whole+genome+array+comparative+genomic+hybridization+data.">SeeGH -- a software tool for visualization of whole genome array comparative genomic hybridization data.</a> BMC Bioinformatics. 5, 13 (2004).</li><li>Chi, B., DeLeeuw, R. J., Coe, B. P., Ng, R. T., MacAulay, C., Lam, W. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MD-SeeGH:+a+platform+for+integrative+analysis+of+multi-dimensional+genomic+data.">MD-SeeGH: a platform for integrative analysis of multi-dimensional genomic data.</a> BMC Bioinformatics. 9, 243 (2008).</li><li>Coe, B. P., Ylstra, B., Carvalho, B., Meijer, G. A., Macaulay, C., Lam, W. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Resolving+the+resolution+of+array+CGH.">Resolving the resolution of array CGH.</a> Genomics. 89, 647-653 (2007).</li><li>Garnis, C., Coe, B. P., Lam, S. L., MacAulay, C., Lam, W. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-resolution+array+CGH+increases+heterogeneity+tolerance+in+the+analysis+of+clinical+samples.">High-resolution array CGH increases heterogeneity tolerance in the analysis of clinical samples.</a> Genomics. 85, 790-793 (2005).</li></ol>

DNA di scarsa qualità non fornirà un buon profilo di ibridazione. E &#39;essenziale assicurare che il DNA del campione e di riferimento sono esenti da contaminanti come il fenolo, RNA, sale, ecc che possono interferire con il passaggio casuale di etichettatura principale prima di iniziare un esperimento di ibridazione. Per esempio la risospensione del DNA in Tris - EDTA (TE) al posto dell&#39;acqua non è raccomandato in quanto la concentrazione di sali in grado di inibire la reazione di marcatura. Si consiglia di saggiare la qualità del...

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		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>5X Klenow Buffer</td>
<td>Reagent</td>
<td>Promega</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Random Octamers </td>
<td>Reagent</td>
<td>Alpha DNA</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>10X dNTP mix</td>
<td>Reagent</td>
<td>Promega</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>2mM dATP, dGTP, dTTP, 1.2mM dCTP</td>
</tr>
<tr>
<td>Cy-3 labeled dCTP</td>
<td>Reagent</td>
<td>GE Healthcare</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Cy-5 labeled dCTP</td>
<td>Reagent</td>
<td>GE Healthcare</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Human Genomic DNA Reference</td>
<td>Reagent</td>
<td>Novagen</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Example of a possible reference</td>
</tr>
<tr>
<td>Klenow</td>
<td>Reagent</td>
<td>Promega</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>YM-30 Column</td>
<td>Reagent</td>
<td>Millipore</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Cot-1 DNA</td>
<td>Reagent</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>DIG Easy</td>
<td>Reagent</td>
<td>Roche</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Sheared Herring Sperm DNA</td>
<td>Reagent</td>
<td>Promega</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Coverslip</td>
<td>Reagent</td>
<td>Fisher Scientific</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>22mm x 60mm</td>
</tr>
<tr>
<td>Hybridization Cassette</td>
<td>Tool</td>
<td>Telechem</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

technical demonstration of whole genome array comparative genomic hybridization

Ibridazione genomica comparativa Array (array CGH) è un metodo per rilevare gli utili e le perdite di segmenti di DNA o di dosaggio del gene nel genoma 1. I recenti progressi nella tecnologia hanno permesso questo confronto ad alta risoluzione di interi genomi per l&#39;identificazione di alterazioni genetiche nel cancro e altre malattie genetiche 2. Il Sub-Megabase risoluzione Tiling-set array (o SMRT) array è costituito da un insieme di circa 30.000 sovrapposizione cromosoma batterico artificiale (BAC) cloni che coprono il genoma umano in ~ 100 coppie kilobase (kb) segmenti 2. Questi obiettivi BAC sono individualmente sintetizzato e individuato in duplice copia su un vetrino solo 2-4. CGH Array si basa sul principio della ibridazione competitiva. Campione di DNA e di riferimento sono etichettati in modo differenziale con Cyanine-3 e coloranti fluorescenti Cyanine-5, e co-ibridato alla matrice. Dopo un periodo di incubazione i campioni non legato sono lavati dalla diapositiva e l&#39;array è ripreso. Un pacchetto disponibile gratuitamente il software personalizzato chiamato SeeGH (www.flintbox.ca) è usato per trattare i grandi volumi di dati raccolti - un singolo esperimento genera 53.892 punti dati. SeeGH visualizza il rapporto segnale log2 intensità tra i 2 campioni a ciascun target BAC che è allineata verticalmente con posizione cromosomica 5,6. L&#39;array SMRT in grado di rilevare alterazioni più piccolo di 50 kb di dimensione 7. L&#39;array SMRT in grado di rilevare una serie di eventi riarrangiamenti del DNA compresi gli utili del DNA, le perdite, amplificazioni e delezioni omozigoti. Un vantaggio unico del vettore SMRT è che si può utilizzare il DNA isolato da campioni di paraffina fissati in formalina embedded. Se combinato con i requisiti di ingresso bassa di DNA non amplificato (25-100 ng) questo permette il profiling di campioni preziosi come quelli prodotti da microdissezione 7,8. Questo è attribuito al grande formato di ciascun target ibridazione BAC, che permette il legame di sufficiente campioni etichettati in modo da produrre i segnali per il rilevamento. Un altro vantaggio di questa piattaforma è la tolleranza di eterogeneità del tessuto, riducendo la necessità di microdissezione del tessuto noioso 8. Questo protocollo video è uno step-by-step tutorial dall&#39;etichettatura il DNA di ingresso fino alla acquisizione del segnale per l&#39;intera gamma piastrelle SMRT genoma percorso.

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Technical Demonstration of Whole Genome Array Comparative Genomic Hybridization

Questo video è una dimostrazione tecnico del protocollo di ibridazione per intero genoma piastrelle CGH array di percorso, che analizza l&#39;intero genoma umano utilizzando solo 25-100 ng di DNA che può essere isolato da una varietà di fonti, tra cui materiale d&#39;archivio formalina fisso.

Dimostrazione tecnica di ibridazione Whole Genome Array Comparative Genomic

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