A New Screening Method for the Directed Evolution of Thermostable Bacteriolytic Enzymes

Directed evolution is defined as a method to harness natural selection in order to engineer proteins to acquire particular properties that are not ...

University of Maryland 

Bacteriophages deploy lysins that degrade the bacterial cell wall and facilitate virus egress from the host. When applied exogenously, these enzymes destroy susceptible microbes and, accordingly, have potential as therapeutic agents. The most potent lysin identified to date is PlyC, an enzyme assembled from two components (PlyCA and PlyCB) that is specific for streptococcal species. Here the structure of the PlyC holoenzyme reveals that a single PlyCA moiety is tethered to a ring-shaped assembly of eight PlyCB molecules. Structure-guided mutagenesis reveals that the bacterial cell wall binding is achieved through a cleft on PlyCB. Unexpectedly, our structural data reveal that PlyCA contains a glycoside hydrolase domain in addition to the previously recognized cysteine, histidine-dependent amidohydrolases/peptidases catalytic domain. The presence of eight cell wall-binding domains together with two catalytic domains may explain the extraordinary potency of the PlyC holoenyzme toward target bacteria.

X-ray crystal structure of the streptococcal specific phage lysin PlyC.

&#x566C;&#x83CC;&#x4F53;&#x90E8;&#x7F72;&#xFF0C;&#x964D;&#x4F4E;&#x7EC6;&#x83CC;&#x7684;&#x7EC6;&#x80DE;&#x58C1;&#xFF0C;&#x5E76;&#x4FC3;&#x8FDB;&#x4ECE;&#x4E3B;&#x673A;&#x75C5;&#x6BD2;&#x51FA;&#x53E3;&#x88C2;&#x89E3;&#x9176;&#x7814;&#x7A76;&#x3002;&#x5F53;&#x5916;&#x90E8;&#x5E94;&#x7528;&#xFF0C;&#x8FD9;&#x4E9B;&#x9176;&#x7834;&#x574F;&#x5BB9;&#x6613;&#x5FAE;&#x751F;&#x7269;&#xFF0C;&#xFF0C;&#x56E0;&#x6B64;&#xFF0C;&#x4F5C;&#x4E3A;&#x6CBB;&#x7597;&#x5242;&#x5177;&#x6709;&#x6F5C;&#x529B;&#x3002;&#x5230;&#x76EE;&#x524D;&#x4E3A;&#x6B62;&#x53D1;&#x73B0;&#x7684;&#x6700;&#x5F3A;&#x6548;&#x6EB6;&#x662F; PlyC&#xFF0C;&#x662F;&#x7279;&#x5B9A;&#x4E8E;&#x94FE;&#x7403;&#x83CC;&#x7269;&#x79CD;&#x7684;&#x9176;&#x7EC4;&#x88C5;&#x4ECE;&#x4E24;&#x4E2A;&#x7EC4;&#x4EF6; &#xFF08;PlyCA &#x548C; PlyCB&#xFF09;&#x3002;&#x8FD9;&#x91CC;&#x7684; PlyC &#x5168;&#x9176;&#x8FD8;&#x80FD;&#x7ED3;&#x6784;&#x63ED;&#x793A;&#x4E86;&#x5355;&#x4E00;&#x7684; PlyCA &#x7ED3;&#x6784;&#x62F4;&#x73AF;&#x578B;&#x516B; PlyCB &#x5206;&#x5B50;&#x7684;&#x5927;&#x4F1A;&#x3002;&#x7ED3;&#x6784;&#x5BFC;&#x5411;&#x7684;&#x8BF1;&#x53D8;&#x63ED;&#x793A;&#x7EC6;&#x83CC;&#x7EC6;&#x80DE;&#x58C1;&#x7684;&#x7ED1;&#x5B9A;&#x901A;&#x8FC7;&#x5728; PlyCB &#x4E0A;&#x7684;&#x4E00;&#x4E2A;&#x88C2;&#x53E3;&#x3002;&#x610F;&#x5916;&#x7684;&#x662F;&#xFF0C;&#x6211;&#x4EEC;&#x7684;&#x7ED3;&#x6784;&#x6570;&#x636E;&#x63ED;&#x793A; PlyCA &#x5305;&#x542B;&#x9664;&#x4E86;&#x4EE5;&#x524D;&#x516C;&#x8BA4;&#x7684;&#x534A;&#x80F1;&#x6C28;&#x9178;&#x3001; &#x7EC4;&#x6C28;&#x9178;&#x4F9D;&#x8D56; amidohydrolases/peptidases &#x50AC;&#x5316;&#x57DF;&#x82F7;&#x6C34;&#x89E3;&#x9176;&#x57DF;&#x3002;&#x516B;&#x7EC6;&#x80DE;&#x58C1;&#x7ED1;&#x5B9A;&#x57DF;&#x4E0E;&#x50AC;&#x5316;&#x7684;&#x4E24;&#x4E2A;&#x57DF;&#x7684;&#x5B58;&#x5728;&#x53EF;&#x80FD;&#x89E3;&#x91CA;&#x975E;&#x51E1;&#x6548;&#x4EF7; PlyC holoenyzme &#x5BF9;&#x7EC6;&#x83CC;&#x7684;&#x76EE;&#x6807;&#x3002;

&#x94FE;&#x7403;&#x83CC;&#x566C;&#x83CC;&#x4F53;&#x6EB6; PlyC x &#x5C04;&#x7EBF;&#x6676;&#x4F53;&#x7ED3;&#x6784;&#x3002;

Bact&eacute;riophages d&eacute;ploient les bact&eacute;riophages qui d&eacute;gradent la paroi cellulaire bact&eacute;rienne et de facilitent l&#39;&eacute;vacuation du virus de l&#39;h&ocirc;te. Lorsqu&#39;elle est appliqu&eacute;e de fa&ccedil;on exog&egrave;ne, ces enzymes d&eacute;truisent les microbes sensibles et donc potentiel comme agents th&eacute;rapeutiques. La lysine plus puissante identifi&eacute;e &agrave; ce jour est PlyC, une enzyme Assembl&eacute;e &agrave; partir de deux &eacute;l&eacute;ments (PlyCA et PlyCB) qui est sp&eacute;cifique pour les esp&egrave;ces de streptocoques. Ici, la structure de l&#39;holoenzyme PlyC r&eacute;v&egrave;le qu&#39;une seule portion de PlyCA est attach&eacute;e &agrave; une Assembl&eacute;e en forme d&#39;anneau de huit mol&eacute;cules PlyCB. Mutagen&egrave;se guid&eacute;e par structure r&eacute;v&egrave;le que la fixation de la paroi cellulaire bact&eacute;rienne est assur&eacute;e par une fente sur PlyCB. Contre toute attente, nos donn&eacute;es structurales r&eacute;v&egrave;lent que PlyCA contient un domaine de glycoside hydrolase outre la cyst&eacute;ine pr&eacute;alablement reconnu, domaine catalytique histidine-d&eacute;pendante amidohydrolases/peptidases. La pr&eacute;sence de huit domaines de liaison pari&eacute;taux ainsi que deux domaines catalytiques peut-&ecirc;tre expliquer l&#39;extraordinaire puissance de la holoenyzme de PlyC vers les bact&eacute;ries cibl&eacute;es.

Structure cristalline de la lysine de streptocoque bact&eacute;riophage sp&eacute;cifique PlyC.

Bakteriophagen bereitstellen lysine, die die bakterielle Zellwand abgebaut und erleichtern Virus Ausstieg vom Host. Wenn exogen angewendet, diese Enzyme zerst&ouml;ren empf&auml;nglicher Mikroben und dementsprechend haben Potential als Therapeutika. Die potentesten Lysin bisher identifiziert ist PlyC, ein Enzym aus zwei Komponenten (PlyCA und PlyCB) zusammengesetzt, die spezifisch f&uuml;r Streptokokken-Arten. Hier zeigt die Struktur der PlyC Erfahrung, dass eine einzelne PlyCA-Gruppe zu einer ringf&ouml;rmigen Assembly acht PlyCB Molek&uuml;le angebunden ist. Struktur-gef&uuml;hrte Mutagenese zeigt, dass die bakterielle Zellwand-Bindung durch einen Spalt am PlyCB erreicht wird. Unerwartet, zeigen unsere Strukturdaten, dass PlyCA ein Glykosid Hydrolase-Bereich neben der zuvor erkannten Cystein, Histidin-abh&auml;ngige Amidohydrolases/Peptidasen katalytische Dom&auml;ne enth&auml;lt. Das Vorhandensein von acht Zellwand-Bindung-Dom&auml;nen mit zwei katalytische Dom&auml;nen mag erkl&auml;ren, die au&szlig;ergew&ouml;hnliche Wirksamkeit von der PlyC-Holoenyzme in Richtung Ziel Bakterien.

R&ouml;ntgen-Kristallstruktur von den Streptokokken spezifische Phage Lysin PlyC.

Batteriofagi distribuire lysins che degradano la parete cellulare batterica e facilitare l&#39;uscita del virus dall&#39;host. Quando viene applicato in maniera esogena, questi enzimi distruggono i microbi sensibili e, di conseguenza, hanno un potenziale come agenti terapeutici. Il pi&ugrave; potente lisina identificata fino ad oggi &egrave; PlyC, un enzima assemblato da due componenti (PlyCA e PlyCB) che &egrave; specifico per la specie da streptococco. Qui la struttura dell&#39;esonucleasica PlyC rivela che un singolo gruppo di PlyCA &egrave; legato a un assembly a forma di anello di otto molecole di PlyCB. Mutagenesi guidata struttura rivela che l&#39;associazione della parete cellulare batterica &egrave; raggiunto attraverso una fenditura su PlyCB. Inaspettatamente, i nostri dati strutturali rivelano che PlyCA contiene un dominio di idrolasi del glicoside oltre la cisteina in precedenza riconosciuto, dominio catalitico istidina-dipendente amidohydrolases/peptidasi. La presenza di otto domini parete cellulare-associazione insieme a due domini catalitici pu&ograve; spiegare la straordinaria potenza dell&#39;holoenyzme PlyC verso batteri bersaglio.

Struttura di cristallo dei raggi x della lisina da streptococco fago specifico PlyC.

&#x30D0;&#x30AF;&#x30C6;&#x30EA;&#x30AA;&#x30D5;&#x30A1;&#x30FC;&#x30B8; &#x30A2;&#x30AF;&#x30ED;&#x30B7;&#x30F3;&#x7D30;&#x83CC;&#x306E;&#x7D30;&#x80DE;&#x58C1;&#x304C;&#x4F4E;&#x4E0B;&#x3057;&#x3001;&#x30DB;&#x30B9;&#x30C8;&#x304B;&#x3089;&#x306E;&#x30A6;&#x30A4;&#x30EB;&#x30B9;&#x306E;&#x51FA;&#x53E3;&#x3092;&#x5BB9;&#x6613;&#x306B;&#x5C55;&#x958B;&#x3057;&#x307E;&#x3059;&#x3002;&#x5EA6;&#x5916;&#x9069;&#x7528;&#x3059;&#x308B;&#x3068;&#x3001;&#x3053;&#x308C;&#x3089;&#x306E;&#x9175;&#x7D20;&#x306F;&#x5F71;&#x97FF;&#x3092;&#x53D7;&#x3051;&#x3084;&#x3059;&#x3044;&#x5FAE;&#x751F;&#x7269;&#x3092;&#x7834;&#x58CA;&#x3057;&#x3001;&#x305D;&#x308C;&#x306B;&#x5FDC;&#x3058;&#x3066;&#x3001;&#x6CBB;&#x7642;&#x4E0A;&#x306E;&#x30A8;&#x30FC;&#x30B8;&#x30A7;&#x30F3;&#x30C8;&#x3068;&#x3057;&#x3066;&#x53EF;&#x80FD;&#x6027;&#x306E;&#x3042;&#x308A;&#x307E;&#x3059;&#x3002;&#x7279;&#x5B9A;&#x306E;&#x65E5;&#x4ED8;&#x306B;&#x6700;&#x3082;&#x5F37;&#x529B;&#x306A;&#x30E9;&#x30A4;&#x30B7;&#x30F3; PlyC&#x3001;&#x30EC;&#x30F3;&#x30B5;&#x7403;&#x83CC;&#x6027;&#x306E;&#x7A2E;&#x306B;&#x56FA;&#x6709;&#x306E;&#x3082;&#x306E; (PlyCA &#x304A;&#x3088;&#x3073; PlyCB) &#x306E; 2 &#x3064;&#x306E;&#x30B3;&#x30F3;&#x30DD;&#x30FC;&#x30CD;&#x30F3;&#x30C8;&#x304B;&#x3089;&#x30A2;&#x30BB;&#x30F3;&#x30D6;&#x30EB;&#x3059;&#x308B;&#x9175;&#x7D20;&#x3067;&#x3059;&#x3002;&#x3053;&#x3053; PlyC &#x306E;&#x30DB;&#x30ED;&#x9175;&#x7D20;&#x306E;&#x69CB;&#x9020;&#x5358;&#x4E00; PlyCA &#x90E8;&#x4F4D; 8 PlyCB &#x5206;&#x5B50;&#x306E;&#x74B0;&#x72B6;&#x30A2;&#x30BB;&#x30F3;&#x30D6;&#x30EA;&#x306B;&#x3064;&#x306A;&#x304B;&#x3066;&#x3044;&#x308B;&#x3053;&#x3068;&#x3092;&#x660E;&#x3089;&#x304B;&#x306B;&#x3057;&#x307E;&#x3059;&#x3002;&#x69CB;&#x9020;&#x306B;&#x57FA;&#x3065;&#x3044;&#x305F;&#x5909;&#x7570;&#x7D30;&#x83CC;&#x306E;&#x7D30;&#x80DE;&#x58C1;&#x7D50;&#x5408; PlyCB &#x4E0A;&#x88C2;&#x3092;&#x901A;&#x3057;&#x3066;&#x9054;&#x6210;&#x3055;&#x308C;&#x308B;&#x3053;&#x3068;&#x3092;&#x660E;&#x3089;&#x304B;&#x306B;&#x3057;&#x307E;&#x3059;&#x3002;&#x4E88;&#x671F;&#x305B;&#x305A;&#x3001;&#x79C1;&#x9054;&#x306E;&#x69CB;&#x9020;&#x30C7;&#x30FC;&#x30BF; PlyCA &#x4EE5;&#x524D;&#x306B;&#x8A8D;&#x8B58;&#x3057;&#x305F;&#x30B7;&#x30B9;&#x30C6;&#x30A4;&#x30F3;, &#x30D2;&#x30B9;&#x30C1;&#x30B8;&#x30F3;&#x4F9D;&#x5B58;&#x578B; amidohydrolases/&#x30DA;&#x30D7;&#x30C1;&#x30C0;&#x30FC;&#x30BC;&#x89E6;&#x5A92;&#x30C9;&#x30E1;&#x30A4;&#x30F3;&#x306B;&#x52A0;&#x3048;&#x3066;&#x7CD6;&#x8CEA;&#x52A0;&#x6C34;&#x5206;&#x89E3;&#x9175;&#x7D20;&#x30C9;&#x30E1;&#x30A4;&#x30F3;&#x304C;&#x542B;&#x307E;&#x308C;&#x3066;&#x3044;&#x308B;&#x3053;&#x3068;&#x3092;&#x660E;&#x3089;&#x304B;&#x306B;&#x3057;&#x307E;&#x3059;&#x3002;8 &#x500B;&#x306E;&#x7D30;&#x80DE;&#x58C1;&#x7D50;&#x5408;&#x30C9;&#x30E1;&#x30A4;&#x30F3;&#x3068;&#x5171;&#x306B; 2 &#x3064;&#x306E;&#x89E6;&#x5A92;&#x30C9;&#x30E1;&#x30A4;&#x30F3;&#x306E;&#x5B58;&#x5728;&#x306B;&#x5411;&#x304B;&#x3063;&#x3066;&#x30BF;&#x30FC;&#x30B2;&#x30C3;&#x30C8;&#x7D30;&#x83CC; PlyC holoenyzme &#x306E;&#x81E8;&#x6642;&#x306E;&#x52B9;&#x529B;&#x3092;&#x8AAC;&#x660E;&#x3059;&#x308B;&#x304B;&#x3082;&#x3057;&#x308C;&#x306A;&#x3044;&#x3002;

&#x30EC;&#x30F3;&#x30B5;&#x7403;&#x83CC;&#x7279;&#x5B9A;&#x30D0;&#x30AF;&#x30C6;&#x30EA;&#x30AA;&#x30D5;&#x30A1;&#x30FC;&#x30B8; &#x30E9;&#x30A4;&#x30B7;&#x30F3; PlyC &#x306E; x &#x7DDA;&#x7D50;&#x6676;&#x69CB;&#x9020;&#x3002;

Bacteriophages lysins&#xB294; &#xC138;&#xADE0; &#xC138;&#xD3EC; &#xBCBD;&#xC744; &#xC800;&#xD558; &#xD558; &#xACE0; &#xD638;&#xC2A4;&#xD2B8;&#xC5D0;&#xC11C; &#xBC14;&#xC774;&#xB7EC;&#xC2A4; &#xD0C8;&#xCD9C;&#xAD6C;&#xB97C; &#xC6A9;&#xC774; &#xD558; &#xAC8C; &#xBC30;&#xD3EC; &#xD569;&#xB2C8;&#xB2E4;. Exogenously &#xC801;&#xC6A9; &#xD558;&#xB294; &#xACBD;&#xC6B0; &#xC774;&#xB7EC;&#xD55C; &#xD6A8;&#xC18C; &#xCDE8;&#xC57D; &#xBBF8;&#xC0DD;&#xBB3C;&#xC744; &#xD30C;&#xAD34; &#xACE0;, &#xADF8;&#xC5D0; &#xB530;&#xB77C;, &#xCE58;&#xB8CC;&#xC81C;&#xB85C; &#xC11C; &#xC7A0;&#xC7AC;&#xB825;&#xC744;&#xAC00;&#xC9C0;&#xACE0;. &#xB0A0;&#xC9DC;&#xB97C; &#xD655;&#xC778; &#xD558;&#xB294; &#xAC00;&#xC7A5; &#xAC15;&#xB825;&#xD55C; lysin PlyC, &#xC5F0;&#xC1C4; &#xAD6C; &#xADE0; &#xC885;&#xC5D0; &#xB300; &#xD55C; &#xD2B9;&#xC815; &#xD6A8;&#xC18C; (PlyCA &#xBC0F; PlyCB)&#xC758; &#xB450; &#xAC00;&#xC9C0; &#xAD6C;&#xC131; &#xC694;&#xC18C;&#xC5D0;&#xC11C; &#xC870;&#xB9BD; &#xB429;&#xB2C8;&#xB2E4;. &#xC5EC;&#xAE30; PlyC holoenzyme &#xAD6C;&#xC870; &#xB2E8;&#xC77C; PlyCA moiety 8 PlyCB &#xBD84;&#xC790;&#xC758; &#xACE0;&#xB9AC; &#xBAA8;&#xC591;&#xC758; &#xC5B4;&#xC148;&#xBE14;&#xB9AC;&#xC5D0; &#xB2FF;&#xB294; &#xBCF4;&#xC5EC;&#xC900;&#xB2E4;. &#xAD6C;&#xC870; &#xAE30;&#xBC18; mutagenesis &#xBC1D;&#xD600; &#xC138;&#xADE0; &#xC138;&#xD3EC; &#xBCBD; &#xBC14;&#xC778;&#xB529; Plycb&#xC5D0; &#xBD84;&#xC5F4;&#xC744; &#xD1B5;&#xD574; &#xC774;&#xB8E8;&#xC5B4;&#xC9D1;&#xB2C8;&#xB2E4;. &#xC608;&#xAE30;&#xCE58; &#xC54A;&#xAC8C;, &#xC6B0;&#xB9AC;&#xC758; &#xAD6C;&#xC870; &#xB370;&#xC774;&#xD130; &#xACF5;&#xAC1C; PlyCA glycoside &#xAC00;&#xC218;&#xBD84;&#xD574; &#xD6A8;&#xC18C; &#xB3C4;&#xBA54;&#xC778; &#xC774;&#xC804;&#xC5D0; &#xC778;&#xC2DD; &#xB41C; &#xC2DC;&#xC2A4;&#xD14C;&#xC778;, &#xD788;&#xC2A4;&#xD2F0;&#xB518; &#xC885;&#xC18D; amidohydrolases/&#xC120;&#xD0DD;&#xC131; &#xCD09;&#xB9E4; &#xB3C4;&#xBA54;&#xC778; &#xC774;&#xC678;&#xC5D0; &#xD3EC;&#xD568; &#xB418;&#xC5B4; &#xC788;&#xC2B5;&#xB2C8;&#xB2E4;. 8 &#xC138;&#xD3EC; &#xBCBD; &#xBC14;&#xC778;&#xB529; &#xB3C4;&#xBA54;&#xC778; &#xB450; &#xCD09;&#xB9E4; &#xB3C4;&#xBA54;&#xC778; &#xD568;&#xAED8; &#xC874;&#xC7AC; &#xB300;&#xC0C1; &#xBC15;&#xD14C;&#xB9AC;&#xC544;&#xB97C; &#xD5A5;&#xD574; PlyC holoenyzme&#xC758; &#xD2B9;&#xBCC4; &#xD55C; &#xD6A8;&#xB2A5;&#xC744; &#xC124;&#xBA85;&#xD560; &#xC218; &#xC788;&#xC2B5;&#xB2C8;&#xB2E4;.

&#xC5F0;&#xC1C4; &#xAD6C; &#xADE0; &#xD2B9;&#xC815; &#xC0B4; &#xADE0; &#xC18C; lysin Plyc&#xC758; x-&#xC120; &#xACB0;&#xC815; &#xAD6C;&#xC870;.

Bacteri&oacute;fagos implementaci&oacute;n lysins que degradan la pared celular bacteriana y facilitan la salida del virus desde el host. Cuando se aplica de forma ex&oacute;gena, estas enzimas destruyen microbios susceptibles y, por consiguiente, tienen potencial como agentes terap&eacute;uticos. El m&aacute;s potente lysin identificado hasta la fecha es PlyC, una enzima montada a partir de dos componentes (PlyCA y PlyCB) que es espec&iacute;fica para especies de estreptococos. Aqu&iacute; la estructura de la PlyC holoenzyme revela que una sola mol&eacute;cula de PlyCA es atada a una Asamblea en forma de anillo de ocho mol&eacute;culas de PlyCB. Mutag&eacute;nesis guiada por estructura revela que la Uni&oacute;n de la pared celular bacteriana se logra a trav&eacute;s de una hendidura en PlyCB. Inesperadamente, nuestros datos estructurales revelan que PlyCA contiene un dominio de la hidrolasa de gluc&oacute;sido adem&aacute;s la ciste&iacute;na previamente reconocido, dominio catal&iacute;tico de histidina-dependiente amidohydrolases/peptidasas. La presencia de ocho dominios de uni&oacute;n a pared celular junto con dos dominios catal&iacute;ticos puede explicar la extraordinaria potencia de la holoenyzme de PlyC hacia las bacterias de destino.

Ryan D. Heselpoth

Institute for Bioscience and Biotechnology Research

University of Maryland

A New Screening Method for the Directed Evolution of Thermostable Bacteriolytic Enzymes

Ryan D. Heselpoth

.css-o250i3{font-size:18px;font-family:Open Sans,sans-serif;line-height:21.6px;}Institute for Bioscience and Biotechnology Research

University of Maryland

A New Screening Method for the Directed Evolution of Thermostable Bacteriolytic Enzymes

Institute for Bioscience and Biotechnology Research