monitoring-reductive-oxidative-half-reactions-flavin-dependent

Monitoring the Reductive and Oxidative Half-Reactions of a Flavin-Dependent Monooxygenase using Stopped-Flow Spectrophotometry

Aspergillus fumigatus siderophore A (SidA) is an FAD-containing monooxygenase that catalyzes the hydroxylation of ornithine in the biosynthesis of ...

Virginia Polytechnic Institute and State University

&#x803B;&#x57A2;&#x5206;&#x679D;&#x6746;&#x83CC; G (MbsG) &#x662F;&#x50AC;&#x5316; NAD (P) H &#x548C;&#x6C27;&#x4F9D;&#x8D56;&#x7F9F;&#x57FA;&#x5316;&#x7EC8;&#x7AEF;&#x6C28;&#x57FA;&#x4FA7;&#x94FE;&#x4E0A;&#x7684; l-&#x8D56;&#x6C28;&#x9178;&#x7684;&#x751F;&#x7269;&#x5408;&#x6210;&#x9014;&#x5F84;&#x7684;&#x55DC;&#x94C1;&#x7D20; mycobactin &#x7684;&#x9EC4;&#x7D20;&#x4F9D;&#x8D56;&#x5355;&#x3002;Mycobactins &#x662F;&#x5FC5;&#x8981;&#x6761;&#x4EF6;&#x4E0B;&#x94C1;&#x9650;&#x5236;&#x7684;&#x7ED3;&#x6838;&#x5206;&#x679D;&#x6746;&#x83CC;&#x751F;&#x957F;&#x5728;&#x54FA;&#x4E73;&#x52A8;&#x7269;&#x4E2D;&#x7684;&#x611F;&#x67D3;&#x8FC7;&#x7A0B;&#x4E2D;&#x9047;&#x5230;&#x7684;&#x6761;&#x4EF6;&#x3002;&#x56E0;&#x6B64;&#xFF0C;&#x53C2;&#x4E0E;&#x751F;&#x7269;&#x5408;&#x6210;&#x7684; mycobactin &#x9176;&#x4EE3;&#x8868;&#x6F5C;&#x5728;&#x836F;&#x7269;&#x9776;&#x70B9;&#x3002;MbsG &#x5728;&#x5927;&#x80A0;&#x6746;&#x83CC;&#x4E2D;&#x8868;&#x8FBE;&#x548C;&#x7EAF;&#x5316;&#x4F7F;&#x7528;&#x91D1;&#x5C5E;&#x4EB2;&#x548C;&#x548C;&#x79BB;&#x5B50;&#x4EA4;&#x6362;&#x7684;&#x4EA7;&#x7269;&#x3002;&#x91CD;&#x7EC4; MbsG &#x8868;&#x793A;&#x6B64;&#x7C7B;&#x7684;&#x6D3B;&#x52A8;&#x5F62;&#x5F0F;&#xFF0C;&#x7D27;&#x5BC6;&#x7ED1;&#x5B9A;&#x5728;&#x4E00;&#x8D77;&#x7684;&#x65F6;&#x5C1A;&#x8F85;&#x9176;&#x4E0E;&#x9176;&#x6CD5;&#x7684;&#x7B2C;&#x4E00;&#x4E2A;&#x6210;&#x5458;&#x3002;&#x7F9F;&#x57FA;&#x5316; l-&#x8D56;&#x6C28;&#x9178;&#x5728;&#x7A33;&#x6001;&#x6761;&#x4EF6;&#x4E0B;&#x5F62;&#x6210;&#x7684; k(cat) &#x503C;&#x662F; 5.0 &#x7248;&#x7684; min(-1)&#xFF0C;&#x548C; 0.21 &#x6BEB;&#x7C73;&#x7684; l-&#x8D56;&#x6C28;&#x9178;&#xFF0C;NADH&#xFF0C;&#x4E3A; 1.1 m m &#x548C; NADPH &#x4E3A; 2.4 &#x6BEB;&#x7C73;&#x7684; K(m) &#x503C;&#x8BA1;&#x7B97;&#x3002;&#x8FD9;&#x79CD;&#x9176;&#x5145;&#x5F53;&#x6C27;&#x5316;&#x9176;&#x6D3B;&#x6027;&#x7684; MbsG &#x901A;&#x8FC7;&#x76D1;&#x6D4B;&#x6CA1;&#x6709;&#x6C27;&#x5316; NADH &#x548C; NADPH &#x5206;&#x522B;&#x4E0E; 59 &#x548C; 49 min(-1) &#x7684; k(cat) &#x503C;&#xFF0C;l-&#x8D56;&#x6C28;&#x9178;&#x7684;&#x8017;&#x6C27;&#x91CF;&#x6D4B;&#x91CF;&#x65F6;&#x3002;&#x5728;&#x8FD9;&#x4E9B;&#x60C5;&#x51B5;&#x4E0B;&#xFF0C;MbsG &#x4EA7;&#x751F;&#x8FC7;&#x6C27;&#x5316;&#x6C22;&#x548C;&#x8D85;&#x6C27;&#x3002;&#x76F8;&#x6BD4;&#x4E4B;&#x4E0B;&#xFF0C;&#x672C; l-&#x8D56;&#x6C28;&#x9178;&#x65F6;&#xFF0C;&#x53CD;&#x5E94;&#x53D8;&#x5F97;&#x66F4;&#x8026;&#x5408;&#xFF0C;&#x751F;&#x4EA7; l-&#x8D56;&#x6C28;&#x9178;&#x7F9F;&#x57FA;&#x5316;&#x548C;&#x964D;&#x4F4E;&#x6C27;&#x5316;&#x9176;&#x6D3B;&#x6027;&#x3002;&#x8FD9;&#x4E9B;&#x7ED3;&#x679C;&#x8868;&#x660E;&#x57FA;&#x6750;&#x7684;&#x7C98;&#x5408;&#x8C03;&#x8282; MbsG &#x4ECE;&#x6C27;&#x5316;&#x9176;&#x5BF9;&#x5355;&#x52A0;&#x6C27;&#x9176;&#x7684;&#x4F5C;&#x7528;&#x3002;

&#x57FA;&#x677F;&#x7ED1;&#x5B9A;&#x8C03;&#x8282;&#x7684;&#x803B;&#x57A2;&#x5206;&#x679D;&#x6746;&#x83CC; G&#x3001; &#x9EC4;&#x7D20;&#x4F9D;&#x8D56;&#x5355;&#x6240;&#x6D89;&#x53CA;&#x7684;&#x751F;&#x7269;&#x5408;&#x6210;&#x809F;&#x542B;&#x94C1;&#x8F7D;&#x4F53;&#x7684;&#x6D3B;&#x52A8;&#x3002;

Mycobacterium smegmatis G (MbsG) is a flavin-dependent monooxygenase that catalyzes the NAD(P)H- and oxygen-dependent hydroxylation of the terminal amino group on the side chain of l-lysine in the biosynthetic pathway of the siderophore mycobactin. Mycobactins are essential for mycobacterium growth under iron-limiting conditions encountered during infection in mammals. Thus, enzymes involved in the biosynthesis of mycobactin represent potential drug targets. MbsG was expressed in Escherichia coli and purified using metal affinity and ionic exchange chromatographies. Recombinant MbsG represents the first member of this class of enzymes isolated in the active form, with a tightly bound FAD cofactor. The k(cat) value for formation of hydroxylated l-lysine under steady-state conditions was 5.0 min(-1), and K(m) values of 0.21 mM for l-lysine, 1.1 mM for NADH, and 2.4 mM for NADPH were calculated. The enzyme functioned as an oxidase when the activity of MbsG was measured by monitoring oxygen consumption in the absence of l-lysine, oxidizing NADH and NADPH with k(cat) values of 59 and 49 min(-1), respectively. Under these conditions, MbsG produced both hydrogen peroxide and superoxide. In contrast, when l-lysine was present, the reaction became more coupled, producing hydroxylated l-lysine and decreasing the oxidase activity. These results suggest that substrate binding modulates the function of MbsG from an oxidase to a monooxygenase.

Substrate binding modulates the activity of Mycobacterium smegmatis G, a flavin-dependent monooxygenase involved in the biosynthesis of hydroxamate-containing siderophores.

Mycobacterium smegmatis U (MbsG) est une monooxyg&#xE9;nase flavine-d&#xE9;pendante qui catalyse la NAD (P) H-d&#xE9;pendante et de l&#x26;#39;oxyg&#xE8;ne-hydroxylation du groupe amino terminal sur la cha&#xEE;ne lat&#xE9;rale de l-lysine dans la voie de biosynth&#xE8;se de l&#x26;#39;mycobactine sid&#xE9;rophore. Mycobactins sont essentiels pour la croissance mycobact&#xE9;rie sous fer de limitation de conditions rencontr&#xE9;es lors de l&#x26;#39;infection chez les mammif&#xE8;res. Ainsi, les enzymes impliqu&#xE9;es dans la biosynth&#xE8;se de la mycobactine repr&#xE9;sentent des cibles potentielles de m&#xE9;dicaments. MbsG a &#xE9;t&#xE9; exprim&#xE9; dans Escherichia coli et purifi&#xE9;e en utilisant affinit&#xE9; des m&#xE9;taux et chromatographies &#xE9;changeuses d&#x26;#39;ions. Recombinant MbsG repr&#xE9;sente le premier membre de cette classe d&#x26;#39;enzymes isol&#xE9;es dans la forme active, avec un cofacteur FAD &#xE9;troitement li&#xE9;s. La k (cat) la valeur de la formation de hydroxyl&#xE9; L-lysine dans l&#x26;#39;&#xE9;tat d&#x26;#39;&#xE9;quilibre &#xE9;tait de 5,0 min (-1), et K (m) des valeurs de 0,21 mM pour la L-lysine, 1,1 mM pour le NADH et 2,4 mM pour le NADPH ont &#xE9;t&#xE9; calcul&#xE9;s. L&#x26;#39;enzyme fonctionne comme une oxydase lorsque l&#x26;#39;activit&#xE9; du MbsG a &#xE9;t&#xE9; mesur&#xE9;e par la consommation d&#x26;#39;oxyg&#xE8;ne de surveillance en l&#x26;#39;absence de L-lysine, l&#x26;#39;oxydation du NADH et de NADPH avec k (cat) des valeurs de 59 et 49 min (-1), respectivement. Dans ces conditions, MbsG produit du peroxyde d&#x26;#39;hydrog&#xE8;ne &#xE0; la fois et de superoxyde. En revanche, lorsque la L-lysine &#xE9;tait pr&#xE9;sent, la r&#xE9;action devient plus coupl&#xE9;e, la production hydroxyl&#xE9; L-lysine et en diminuant l&#x26;#39;activit&#xE9; oxydase. Ces r&#xE9;sultats sugg&#xE8;rent que la liaison au substrat module la fonction d&#x26;#39;MbsG d&#x26;#39;une oxydase &#xE0; une monooxyg&#xE9;nase.

La liaison du substrat module l&#x26;#39;activit&#xE9; de Mycobacterium smegmatis G, une monooxyg&#xE9;nase flavine-d&#xE9;pendante impliqu&#xE9;e dans la biosynth&#xE8;se de sid&#xE9;rophores hydroxamate contenant

Mycobacterium Smegmatis G (MbsG) ist eine Flavin-abh&auml;ngige Monooxygenase, das die NAD (P) H - und Sauerstoff-abh&auml;ngige Hydroxylierung der terminal amino-Gruppe auf die Seitenkette von l-Lysin in der biosynthetischen Weg der Siderophore Mycobactin katalysiert. Mycobactins sind wesentlich f&uuml;r Mycobacterium Wachstum unter Eisen-Begrenzung Bedingungen w&auml;hrend der Infektion bei S&auml;ugetieren. Daher stellen Enzyme beteiligt bei der Biosynthese der Mycobactin m&ouml;gliche Droge-Ziele dar. MbsG fand ihren Niederschlag in Escherichia coli und gereinigt, mit Metall-Affinit&auml;t und Ionenaustausch Chromatograph. Rekombinante MbsG stellt das erste Mitglied dieser Klasse von Enzymen, die in die aktive Form mit Kofaktor FAD eng gebundenen isoliert. Der k(cat)-Wert f&uuml;r die Bildung von l-Lysin unter station&auml;ren Bedingungen Methioninhydroxyanalogs war 5.0 min(-1) und K(m) Werte 0,21 mm f&uuml;r l-Lysin, 1,1 mM f&uuml;r NADH und 2,4 mM f&uuml;r NADPH berechnet wurden. Das Enzym fungierte als eine Oxydase, wenn die T&auml;tigkeit der MbsG gemessen wurde, durch die &Uuml;berwachung der Sauerstoffverbrauch in Ermangelung von l-Lysin, oxidieren NADH und NADPH mit k(cat) Werten von 59 und 49 min(-1). Unter diesen Bedingungen produziert MbsG Wasserstoffperoxid und Superoxid. Im Gegensatz dazu als l-Lysin vorhanden war, wurde die Reaktion mehr gekoppelt produziert Methioninhydroxyanalogs l-Lysin und verringern die Oxydase-Aktivit&auml;t. Diese Ergebnisse legen nahe, dass Substrat Bindung die Funktion des MbsG aus einer Oxydase eine Monooxygenase moduliert.

Substrat Bindung moduliert die Aktivit&auml;t von Mycobacterium Smegmatis G, einem Flavin-abh&auml;ngige Monooxygenase die Biosynthese von Hydroxamate-haltigen SIDEROPHORE beteiligt.

Mycobacterium smegmatis G (MbsG) &egrave; un dipendente dalla flavina monoossigenasi che catalizza la seguente l&#39;idrossilazione di H - e ossigeno-dipendente di NAD (P) del gruppo amminico terminale sulla catena laterale di l-lisina nel pathway biosintetico del mycobactin di sideroforo. Mycobactins sono essenziali per la crescita di mycobacterium sotto ferro-limitando le condizioni incontrate durante l&#39;infezione nei mammiferi. Cos&igrave;, gli enzimi coinvolti nella biosintesi di mycobactin rappresentano potenziali bersagli di droga. MbsG &egrave; stato espresso in Escherichia coli e purificato utilizzando metallo affinit&agrave; e cromatografie di scambio ionico. MbsG ricombinante rappresenta il primo membro di questa classe di enzimi isolato in forma attiva, con un cofattore FAD strettamente legato. Il valore di k(cat) per la formazione di l-lisina idrossilato in condizioni di steady-state era min(-1) 5.0, e sono stati calcolati i valori di K(m) di 0,21 mM per l-lisina, 1,1 mM per NADH e 2,4 mM per NADPH. L&#39;enzima ha funzionato come un&#39;ossidasi quando l&#39;attivit&agrave; di MbsG &egrave; stata misurata mediante monitoraggio consumo di ossigeno in assenza di l-lisina, ossidanti NADH e NADPH con valori di k(cat) di min(-1) 59 e 49, rispettivamente. In queste condizioni, MbsG prodotto sia idrogeno perossido e superossido. Al contrario, quando l-lisina &egrave; stato presente, la reazione &egrave; diventato pi&ugrave; accoppiata, producendo idrossilato l-lisina e diminuendo l&#39;attivit&agrave; ossidasi. Questi risultati suggeriscono che associazione substrato modula la funzione di MbsG da un&#39;ossidasi a un monoossigenasi.

Associazione substrato modula l&#39;attivit&agrave; del Mycobacterium smegmatis G, un monoossigenasi flavina-dipendenti coinvolti nella biosintesi di siderofori hydroxamate-contenenti.

&#x30DE;&#x30A4;&#x30B3;&#x30D0;&#x30AF;&#x30C6;&#x30EA;&#x30A6;&#x30E0;&#x30B9;&#x30E1;&#x30B0;&#x30DE;&#x30C1;&#x30B9;G&#xFF08;MbsG&#xFF09;&#x306F;&#x30B7;&#x30C7;&#x30ED;&#x30D5;&#x30A9;&#x30A2;mycobactin&#x306E;&#x751F;&#x5408;&#x6210;&#x7D4C;&#x8DEF;&#x306E;L-&#x30EA;&#x30B8;&#x30F3;&#x306E;&#x5074;&#x9396;&#x4E0A;&#x306E;&#x672B;&#x7AEF;&#x30A2;&#x30DF;&#x30CE;&#x57FA;&#x306E;NAD&#xFF08;P&#xFF09;H&#x3068;&#x9178;&#x7D20;&#x4F9D;&#x5B58;&#x6027;&#x30D2;&#x30C9;&#x30ED;&#x30AD;&#x30B7;&#x30EB;&#x5316;&#x3092;&#x89E6;&#x5A92;&#x3059;&#x308B;&#x30D5;&#x30E9;&#x30D3;&#x30F3;&#x4F9D;&#x5B58;&#x6027;&#x30E2;&#x30CE;&#x30AA;&#x30AD;&#x30B7;&#x30B2;&#x30CA;&#x30FC;&#x30BC;&#x3067;&#x3042;&#x308B;&#x3002; Mycobactins&#x306F;&#x3001;&#x54FA;&#x4E73;&#x985E;&#x306E;&#x611F;&#x67D3;&#x6642;&#x306B;&#x767A;&#x751F;&#x3057;&#x305F;&#x9244;&#x5236;&#x9650;&#x6761;&#x4EF6;&#x4E0B;&#x3067;&#x3001;&#x30DE;&#x30A4;&#x30B3;&#x30D0;&#x30AF;&#x30C6;&#x30EA;&#x30A6;&#x30E0;&#x306E;&#x6210;&#x9577;&#x306B;&#x4E0D;&#x53EF;&#x6B20;&#x3067;&#x3042;&#x308B;&#x3002;&#x3057;&#x305F;&#x304C;&#x3063;&#x3066;&#x3001;mycobactin&#x306E;&#x751F;&#x5408;&#x6210;&#x306B;&#x95A2;&#x4E0E;&#x3059;&#x308B;&#x9175;&#x7D20;&#x306F;&#x3001;&#x6F5C;&#x5728;&#x7684;&#x306A;&#x5275;&#x85AC;&#x30BF;&#x30FC;&#x30B2;&#x30C3;&#x30C8;&#x3092;&#x8868;&#x3057;&#x3066;&#x3044;&#x307E;&#x3059;&#x3002; MbsG&#x306F;&#x3001;&#x5927;&#x8178;&#x83CC;&#x3067;&#x767A;&#x73FE;&#x3055;&#x305B;&#x3001;&#x91D1;&#x5C5E;&#x30A2;&#x30D5;&#x30A3;&#x30CB;&#x30C6;&#x30A3;&#x30FC;&#x304A;&#x3088;&#x3073;&#x30A4;&#x30AA;&#x30F3;&#x4EA4;&#x63DB;&#x30AF;&#x30ED;&#x30DE;&#x30C8;&#x30B0;&#x30E9;&#x30D5;&#x30A3;&#x30FC;&#x3092;&#x7528;&#x3044;&#x3066;&#x7CBE;&#x88FD;&#x3057;&#x305F;&#x3002;&#x7D44;&#x63DB;&#x3048;MbsG&#x306F;&#x5F37;&#x56FA;&#x306B;&#x7D50;&#x5408;&#x3057;&#x305F;FAD&#x3092;&#x88DC;&#x9175;&#x7D20;&#x3068;&#x3001;&#x30A2;&#x30AF;&#x30C6;&#x30A3;&#x30D6;&#x306A;&#x5F62;&#x3067;&#x5358;&#x96E2;&#x3055;&#x308C;&#x305F;&#x9175;&#x7D20;&#x306E;&#x3053;&#x306E;&#x30AF;&#x30E9;&#x30B9;&#x306E;&#x6700;&#x521D;&#x306E;&#x30E1;&#x30F3;&#x30D0;&#x3092;&#x8868;&#x3057;&#x307E;&#x3059;&#x3002;&#x5B9A;&#x5E38;&#x72B6;&#x614B;&#x306E;&#x6761;&#x4EF6;&#x4E0B;&#x3067;&#x30D2;&#x30C9;&#x30ED;&#x30AD;&#x30B7;&#x30EB;&#x5316;&#x3055;&#x308C;&#x3001;L-&#x30EA;&#x30B8;&#x30F3;&#x306E;&#x5F62;&#x6210;&#x306E;&#x305F;&#x3081;&#x306E;K&#xFF08;&#x732B;&#xFF09;&#x306E;&#x5024;&#x306F;5.0&#x5206;&#xFF08;-1&#xFF09;&#x3001;&#x304A;&#x3088;&#x3073;L-&#x30EA;&#x30B8;&#x30F3;&#x306E;&#x305F;&#x3081;&#x306B;0.21 mM&#x306E;K&#xFF08;m&#xFF09;&#x306E;&#x5024;&#x306F;&#x3001;NADH 1.1 mM&#x3068;NADPH 2.4 mm&#x3067;&#x3042;&#x3063;&#x305F;&#x7B97;&#x51FA;&#x3057;&#x305F;&#x3002;&#x9175;&#x7D20;&#x306F;MbsG&#x306E;&#x6D3B;&#x6027;&#x304C;&#x305D;&#x308C;&#x305E;&#x308C;&#x3001;59&#x304A;&#x3088;&#x3073;49&#x5206;&#xFF08;-1&#xFF09;&#x306E;k&#xFF08;&#x732B;&#xFF09;&#x306E;&#x5024;&#x3067;NADH&#x3068;NADPH&#x3092;&#x9178;&#x5316;&#x3055;&#x305B;&#x3001;L-&#x30EA;&#x30B8;&#x30F3;&#x306E;&#x5B58;&#x5728;&#x4E0B;&#x3067;&#x306E;&#x30E2;&#x30CB;&#x30BF;&#x30EA;&#x30F3;&#x30B0;&#x9178;&#x7D20;&#x6D88;&#x8CBB;&#x91CF;&#x3092;&#x6E2C;&#x5B9A;&#x3057;&#x305F;&#x9178;&#x5316;&#x9175;&#x7D20;&#x3068;&#x3057;&#x3066;&#x6A5F;&#x80FD;&#x3057;&#x305F;&#x3002;&#x3053;&#x308C;&#x3089;&#x306E;&#x6761;&#x4EF6;&#x4E0B;&#x3067;&#x3001;MbsG&#x306F;&#x3001;&#x904E;&#x9178;&#x5316;&#x6C34;&#x7D20;&#x3068;&#x30B9;&#x30FC;&#x30D1;&#x30FC;&#x30AA;&#x30AD;&#x30B7;&#x30C9;&#x306E;&#x4E21;&#x65B9;&#x3092;&#x751F;&#x7523;&#x3057;&#x305F;&#x3002;&#x5BFE;&#x7167;&#x7684;&#x306B;&#x3001;L-&#x30EA;&#x30B8;&#x30F3;&#x304C;&#x5B58;&#x5728;&#x3057;&#x3066;&#x3044;&#x305F;&#x6642;&#x3001;&#x53CD;&#x5FDC;&#x306F;&#x6C34;&#x9178;&#x5316;L-&#x30EA;&#x30B8;&#x30F3;&#x3092;&#x751F;&#x7523;&#x3057;&#x3001;&#x30AA;&#x30AD;&#x30B7;&#x30C0;&#x30FC;&#x30BC;&#x6D3B;&#x6027;&#x3092;&#x6E1B;&#x5C11;&#x3001;&#x3088;&#x308A;&#x200B;&#x200B;&#x591A;&#x304F;&#x306E;&#x7D50;&#x5408;&#x306B;&#x306A;&#x308A;&#x307E;&#x3057;&#x305F;&#x3002;&#x3053;&#x308C;&#x3089;&#x306E;&#x7D50;&#x679C;&#x306F;&#x3001;&#x57FA;&#x8CEA;&#x7D50;&#x5408;&#x306B;&#x306F;&#x30E2;&#x30CE;&#x30AA;&#x30AD;&#x30B7;&#x30B2;&#x30CA;&#x30FC;&#x30BC;&#x306E;&#x9175;&#x7D20;&#x304B;&#x3089;MbsG&#x306E;&#x6A5F;&#x80FD;&#x3092;&#x8ABF;&#x7BC0;&#x3059;&#x308B;&#x3053;&#x3068;&#x3092;&#x304A;&#x52E7;&#x3081;&#x3057;&#x307E;&#x3059;&#x3002;

&#x57FA;&#x8CEA;&#x7D50;&#x5408;&#x306B;&#x306F;&#x3001;&#x30DE;&#x30A4;&#x30B3;&#x30D0;&#x30AF;&#x30C6;&#x30EA;&#x30A6;&#x30E0;&#x30B9;&#x30E1;&#x30B0;&#x30DE;&#x30C1;&#x30B9;G&#x3001;&#x30D2;&#x30C9;&#x30ED;&#x30AD;&#x542B;&#x6709;&#x30B7;&#x30C7;&#x30ED;&#x30D5;&#x30A9;&#x30A2;&#x306E;&#x751F;&#x5408;&#x6210;&#x306B;&#x95A2;&#x4E0E;&#x3059;&#x308B;&#x30D5;&#x30E9;&#x30D3;&#x30F3;&#x4F9D;&#x5B58;&#x6027;&#x30E2;&#x30CE;&#x30AA;&#x30AD;&#x30B7;&#x30B2;&#x30CA;&#x30FC;&#x30BC;&#x306E;&#x6D3B;&#x6027;&#x3092;&#x8ABF;&#x7BC0;&#x3059;&#x308B;

Mycobacterium smegmatis G (MbsG) l-&#xB9AC; &#xC2E0; siderophore mycobactin&#xC758; &#xC0DD; &#xD569;&#xC131; &#xD1B5;&#xB85C;&#xC5D0; &#xC0AC;&#xC774;&#xB4DC; &#xCCB4;&#xC778;&#xC5D0; &#xD130;&#xBBF8;&#xB110; &#xC544;&#xBBF8;&#xB178; &#xADF8;&#xB8F9;&#xC758; NAD (P) H-&#xC0B0;&#xC18C;-&#xC885;&#xC18D; hydroxylation catalyzes &#xD50C; &#xB77C;&#xBE48; &#xC885;&#xC18D; monooxygenase &#xC774;&#xB2E4;. Mycobactins &#xCCA0; &#xC81C;&#xD55C; &#xC544;&#xB798; &#xB2E8;&#xACC4;&#xC778; &#xC131;&#xC7A5;&#xC5D0; &#xD544;&#xC218;&#xC801;&#xC778; &#xD3EC;&#xC720;&#xB958;&#xC5D0; &#xAC10;&#xC5FC; &#xD558;&#xB294; &#xB3D9;&#xC548; &#xBC1C;&#xACAC; &#xB41C; &#xC0C1;&#xD0DC;. &#xB530;&#xB77C;&#xC11C;, &#xD6A8;&#xC18C; mycobactin&#xC758; &#xC0DD; &#xD569;&#xC131;&#xC5D0; &#xAD00;&#xB828; &#xB41C; &#xC7A0;&#xC7AC;&#xC801;&#xC778; &#xC57D;&#xBB3C; &#xD45C;&#xC801;&#xC744; &#xB098;&#xD0C0;&#xB0C5;&#xB2C8;&#xB2E4;. Mbsg&#xB294; &#xB300;&#xC7A5;&#xADE0;&#xC5D0; &#xD45C;&#xD604;&#xACFC; &#xAE08;&#xC18D; &#xCE5C; &#xD654;&#xB825;&#xACFC; &#xC774;&#xC628; &#xAD50;&#xD658; chromatographies&#xB97C; &#xC0AC;&#xC6A9; &#xD558; &#xC5EC; &#xC815;&#xD654;. &#xC7AC;&#xC870;&#xD569; MbsG &#xC5C4;&#xACA9; &#xD558; &#xAC8C; &#xBC14;&#xC778;&#xB529;&#xB41C; &#xC720;&#xD589; cofactor&#xB85C; &#xD65C;&#xC131; &#xD615;&#xD0DC;&#xB85C; &#xBD84;&#xB9AC; &#xB41C; &#xD6A8;&#xC18C;&#xC758;&#xC774; &#xD074;&#xB798;&#xC2A4;&#xC758; &#xCCAB; &#xBC88;&#xC9F8; &#xBA64;&#xBC84;&#xB97C; &#xB098;&#xD0C0;&#xB0C5;&#xB2C8;&#xB2E4;. Hydroxylated l-&#xB9AC; &#xC2E0; &#xC815;&#xC0C1; &#xC0C1;&#xD0DC; &#xC870;&#xAC74; &#xD558;&#xC5D0;&#xC11C; &#xD615;&#xC131;&#xC5D0; &#xB300; &#xD55C; k(cat) &#xAC12;&#xC740; 5.0 min(-1) &#xBC0F; l-&#xB9AC; &#xC2E0;, NADH, 1.1 m m &#xADF8;&#xB9AC;&#xACE0; 2.4 m m NADPH 0.21 m M&#xC758; K(m) &#xAC12;&#xC740; &#xACC4;&#xC0B0; &#xB41C;. MbsG &#xD65C;&#xB3D9; l-&#xB9AC; &#xC2E0;, NADH&#xC640; NADPH 59 &#xACE0; 49 min(-1)&#xC758; k(cat) &#xAC12;&#xC5D0; &#xAC01;&#xAC01; &#xC0B0;&#xD654;&#xC758; &#xBD80;&#xC7AC;&#xC5D0; &#xC0B0;&#xC18C; &#xC18C;&#xBE44;&#xB97C; &#xBAA8;&#xB2C8;&#xD130;&#xB9C1; &#xD558; &#xC5EC; &#xCE21;&#xC815; &#xD588;&#xB2E4; &#xB54C; &#xD6A8;&#xC18C;&#xB294; &#xC0B0;&#xD654; &#xD6A8;&#xC18C;&#xB85C; &#xC11C; &#xC791;&#xC6A9; &#xD588;&#xB2E4;. &#xC774;&#xB7EC;&#xD55C; &#xC870;&#xAC74; &#xD558;&#xC5D0;&#xC11C; MbsG &#xACFC;&#xC0B0;&#xD654; &#xC218;&#xC18C; &#xBC0F; &#xCD08;&#xACFC; &#xC0DD;&#xC0B0;. &#xB300;&#xC870;&#xC801;&#xC73C;&#xB85C;, hydroxylated l-&#xB77C;&#xC774; &#xC2E0;&#xC744; &#xC0DD;&#xC0B0; &#xD558; &#xACE0; &#xAC10;&#xC18C; &#xD558;&#xB294; &#xC0B0;&#xD654; &#xD6A8;&#xC18C; &#xD65C;&#xB3D9; l-&#xB9AC; &#xC2E0; &#xC874;&#xC7AC; &#xD55C; &#xACBD;&#xC6B0;, &#xBC18;&#xC751; &#xACB0;&#xD569; &#xB354; &#xB418;&#xC5C8;&#xB2E4;. &#xC774;&#xB7EC;&#xD55C; &#xACB0;&#xACFC; &#xAE30;&#xD310; &#xBC14;&#xC778;&#xB529; &#xBCC0;&#xC870;&#xB97C; monooxygenase &#xD558;&#xB294; &#xC0B0;&#xD654; &#xD6A8;&#xC18C;&#xC5D0;&#xC11C; Mbsg&#xC758; &#xAE30;&#xB2A5; &#xC88B;&#xC2B5;&#xB2C8;&#xB2E4;.

&#xAE30;&#xD310; &#xBC14;&#xC778;&#xB529; &#xBCC0;&#xC870; Mycobacterium smegmatis G, &#xD50C; &#xB77C;&#xBE48; &#xC885;&#xC18D; monooxygenase &#xD3EC;&#xD568; &#xD558;&#xB294; hydroxamate siderophores&#xC758; &#xC0DD; &#xD569;&#xC131;&#xC5D0; &#xAD00;&#xB828; &#xB41C; &#xD65C;&#xB3D9;.

Mycobacterium smegmatis G (MbsG) es una monooxigenasa flavina-dependiente que cataliza la NAD (P) H y ox&#xED;geno dependiente-hidroxilaci&#xF3;n del grupo amino terminal en la cadena lateral de L-lisina en la ruta biosint&#xE9;tica de la micobactina sider&#xF3;foro. Mycobactins son esenciales para el crecimiento micobacteria bajo de hierro limitativos condiciones encontradas durante la infecci&#xF3;n en los mam&#xED;feros. As&#xED;, las enzimas implicadas en la bios&#xED;ntesis de micobactina representan posibles objetivos farmacol&#xF3;gicos. MbsG se expres&#xF3; en E. coli y se purific&#xF3; mediante afinidad de metal y cromatograf&#xED;as de intercambio i&#xF3;nico. Recombinante MbsG representa el primer miembro de esta clase de enzimas aisladas en la forma activa, con un cofactor FAD fuertemente unido. La k (cat) valor para la formaci&#xF3;n de hidroxilado l-lisina bajo condiciones de estado estacionario fue de 5,0 min (-1), y K (m) valores de 0,21 mM de L-lisina, 1,1 mM de NADH y NADPH 2,4 mM para Se calcularon. La enzima funciona como una oxidasa cuando la actividad de MbsG se midi&#xF3; por el consumo de monitorizaci&#xF3;n de ox&#xED;geno en la ausencia de L-lisina, oxidando el NADH y NADPH con K (cat) valores de 59 y 49 min (-1), respectivamente. Bajo estas condiciones, MbsG producido tanto per&#xF3;xido de hidr&#xF3;geno y super&#xF3;xido. En contraste, cuando l-lisina estaba presente, la reacci&#xF3;n se hizo m&#xE1;s acoplado, produciendo hidroxilado l-lisina y la disminuci&#xF3;n de la actividad de oxidasa. Estos resultados sugieren que la uni&#xF3;n sustrato modula la funci&#xF3;n de MbsG de una oxidasa a una monooxigenasa.

La uni&#xF3;n del sustrato modula la actividad de Mycobacterium smegmatis G, una flavina monooxigenasa dependiente de implicados en la bios&#xED;ntesis de Hidroxamato contienen sider&#xF3;foros

N hydroxylating monooxygenases (NMOs) &#xACF0; &#xD321;&#xC774; &#xBC0F; mycobacteria pathogenesis &#xD544;&#xC218;&#xC801;&#xC785;&#xB2C8;&#xB2E4;. NMOs lysine&#xACFC; &#xD3EC;&#xD568; &#xD558;&#xB294; hydroxamate siderophores&#xC758; &#xC0DD; &#xD569;&#xC131;&#xC5D0;&#xB294; ornithine hydroxylation &#xCD09;&#xB9E4;. 3-Hydroxykynurenine L kynurenine &#xBCC0;&#xD658; catalyzes kynurenine monooxygenase (KMO)&#xC758; &#xC800;&#xD574; &#xD5CC;&#xD305;&#xD134;&#xC758; &#xAC19;&#xC740; &#xC2E0;&#xACBD; &#xD1F4;&#xD589; &#xC131; &#xC9C8;&#xD658; &#xBC0F; Alzheimer&#xC758; &#xC9C8;&#xBCD1; &#xBC0F; &#xAE30;&#xC0DD;&#xCDA9; Trypanosoma brucei&#xC5D0;&#xC758; &#xD55C; &#xB1CC; &#xAC10;&#xC5FC;&#xC744; &#xC644;&#xD654;. &#xC774; &#xD6A8;&#xC18C;&#xB294; &#xC720;&#xD6A8;&#xC131;&#xC774; &#xAC80;&#xC0AC; &#xB41C; &#xB9C8;&#xC57D; &#xB300;&#xC0C1; &#xD50C; &#xB77C;&#xBE48; &#xC885;&#xC18D; monooxygenases&#xC758; &#xC608;&#xC785;&#xB2C8;&#xB2E4;. &#xC5EC;&#xAE30;&#xC5D0;, &#xC6B0;&#xB9AC;&#xB294; &#xAC1C;&#xBC1C; &#xBC0F; &#xD50C; &#xB77C;&#xBE48; monooxygenases&#xC758; &#xC7A0;&#xC7AC;&#xC801;&#xC778; &#xC5B5;&#xC81C;&#xC81C;&#xB97C; &#xC2DD;&#xBCC4; &#xD558;&#xB294; &#xD615;&#xAD11; &#xD3B8;&#xAD11; &#xBD84;&#xC11D; &#xACB0;&#xACFC;&#xC758; &#xCD5C;&#xC801;&#xD654; &#xAE30;&#xC220;. &#xB193;&#xC5EC;&#xC788;&#xB294;&#xC9C0; &#xD45C;&#xC2DC; &#xB41C; ADP &#xBD84;&#xC790; &#xD569;&#xC131; &#xD558; &#xACE0; &#xD14C;&#xC2A4;&#xD2B8; &#xD588;&#xB2E4;. ADP TAMRA &#xB9C8;&#xC774;&#xD06C;&#xB860;&#xC5D0; &#xBC14;&#xC778;&#xB529;&#xB41C; KMO K(d) &#xAC12;&#xC774; 0.60 &plusmn; 0.05 &mu; M&#xC758; &#xACE0; NMOs &#xB204; fumigatus &#xBC0F; Mycobacterium smegmatis K(d) 2.1 &plusmn; 0.2 &mu; M&#xC640; 4.0 &plusmn; 0.2 &Mu;&#xB85C; &#xAC01;&#xAC01;. &#xBD84;&#xC11D; &#xACB0;&#xACFC; &#xACBD;&#xC7C1;&#xB825; &#xC788;&#xB294; &#xBC14;&#xC778;&#xB529; &#xC2E4;&#xD5D8; &#xAE30;&#xD310; &#xBC0F; KMO&#xB294; NMO&#xC758; &#xC81C;&#xD488; &#xD14C;&#xC2A4;&#xD2B8;&#xB97C; &#xD588;&#xB2E4;. &#xB610;&#xD55C;, &#xC6B0;&#xB9AC;&#xB294;&#xC774; &#xBD84;&#xC11D; &#xACB0;&#xACFC; Nmos&#xC758; &#xC5B5;&#xC81C;&#xC81C;&#xB97C; &#xC2DD;&#xBCC4; &#xD558;&#xAE30; &#xC704;&#xD574; &#xC0AC;&#xC6A9;&#xD560; &#xC218; &#xC788;&#xC2B5;&#xB2C8;&#xB2E4; &#xBCF4;&#xC600;&#xB2E4;. A Z&#39;-0.77&#xC758; &#xBE44;&#xC728;&#xC744; &#xACC4;&#xC0B0; &#xD558; &#xACE0; &#xC6B0;&#xB9AC; &#xBD84;&#xC11D; &#xACB0;&#xACFC; &#xC804;&#xC2DC; &#xC628;&#xB3C4; &#xBD80; &#xD654; &#xC2DC;&#xAC04;&#xACFC; DMSO &#xB18D;&#xB3C4;&#xC5D0; &#xC88B;&#xC740; &#xB0B4;&#xC131;&#xC744; &#xBCF4;&#xC5EC;.

&#xD50C; &#xB77C;&#xBE48; &#xC885;&#xC18D; monooxygenases&#xC758; &#xC5B5;&#xC81C;&#xC81C;&#xB97C; &#xC2DD;&#xBCC4; &#xD558;&#xAE30; &#xC704;&#xD574; &#xD615;&#xAD11; &#xD3B8;&#xAD11; &#xBC14;&#xC778;&#xB529; &#xC2DC;&#xD5D8;.

N hydroxylating monooxygenases (NMOs) &#x771F;&#x83CC;&#x548C;&#x5206;&#x652F;&#x6746;&#x83CC;&#x53D1;&#x75C5;&#x4E2D;&#x7684;&#x4F5C;&#x7528;&#x81F3;&#x5173;&#x91CD;&#x8981;&#x3002;NMOs &#x50AC;&#x5316;&#x7F9F;&#x57FA;&#x5316;&#x8D56;&#x6C28;&#x9178;&#x548C;&#x9E1F;&#x6C28;&#x9178;&#x809F;&#x542B;&#x94C1;&#x8F7D;&#x4F53;&#x7684;&#x751F;&#x7269;&#x5408;&#x6210;&#x3002;&#x72AC;&#x5C3F;&#x6C28;&#x9178;&#x5355; (KMO) &#x50AC;&#x5316; L-&#x72AC;&#x5C3F;&#x6C28;&#x9178;&#x8F6C;&#x4E3A; 3 hydroxykynurenine&#xFF0C;&#x6291;&#x5236;&#x7F13;&#x89E3;&#x8111;&#x611F;&#x67D3;&#x5BC4;&#x751F;&#x866B;&#x79CD;&#x9525;&#x4F53;&#x7684;&#x75BE;&#x75C5;&#x963F;&#x5C14;&#x8328;&#x6D77;&#x9ED8;&#x6C0F;&#x75C7;&#x548C;&#x4EA8;&#x5EF7;&#x987F;&#x7B49;&#x795E;&#x7ECF;&#x9000;&#x884C;&#x6027;&#x75BE;&#x75C5;&#x3002;&#x8FD9;&#x4E9B;&#x9176;&#x662F; monooxygenases &#x7684;&#x4F9D;&#x8D56;&#x9EC4;&#x7D20;&#xFF0C;&#x8FD9;&#x662F; monooxygenases &#x7684;&#x7ECF;&#x8FC7;&#x9A8C;&#x8BC1;&#x7684;&#x836F;&#x7269;&#x9776;&#x70B9;&#x7684;&#x4F8B;&#x5B50;&#x3002;&#x5728;&#x8FD9;&#x91CC;&#xFF0C;&#x6211;&#x4EEC;&#x63CF;&#x8FF0;&#x7684;&#x8367;&#x5149;&#x504F;&#x632F;&#x6D4B;&#x5B9A;&#xFF0C;&#x4EE5;&#x786E;&#x5B9A;&#x6F5C;&#x5728;&#x7684;&#x6291;&#x5236;&#x5242;&#x9EC4;&#x7D20; monooxygenases &#x4F18;&#x5316;&#x4E0E;&#x53D1;&#x5C55;&#x3002;&#x9057;&#x4F20;&#x7269;&#x8D28;&#x6807;&#x6709; ADP &#x5206;&#x5B50;&#x88AB;&#x5408;&#x6210;&#x5E76;&#x8FDB;&#x884C;&#x6D4B;&#x8BD5;&#x3002;ADP-&#x5854;&#x59C6;&#x62C9;&#x53D1;&#x8272;&#x56E2;&#x7ED1;&#x5B9A;&#x5230; KMO K(d) &#x503C;&#x4E3A; 0.60 &plusmn; 0.05 &mu; m &#x548C; NMOs &#x66F2;&#x9709;&#x548C;&#x803B;&#x57A2;&#x5206;&#x679D;&#x4EE5; K(d) &#x503C; 2.1 &plusmn; 0.2 &#x5FAE;&#x7C73;&#x548C; 4.0 &plusmn; 0.2 &#x5FAE;&#x7C73;&#xFF0C;&#x5206;&#x522B;&#x3002;&#x6D4B;&#x5B9A;&#x4E0E;&#x57FA;&#x677F;&#x548C; KMO &#x548C; NMO &#x4EA7;&#x54C1;&#x7ADE;&#x4E89;&#x7ED3;&#x5408;&#x5B9E;&#x9A8C;&#x4E2D;&#x8FDB;&#x884C;&#x4E86;&#x6D4B;&#x8BD5;&#x3002;&#x6B64;&#x5916;&#xFF0C;&#x6211;&#x4EEC;&#x8868;&#x660E;&#x8FD9;&#x79CD;&#x6D4B;&#x5B9A;&#x65B9;&#x6CD5;&#x53EF;&#x7528;&#x4E8E;&#x786E;&#x5B9A; NMOs &#x7684;&#x6291;&#x5236;&#x5242;&#x3002;A Z&#39;-0.77 &#x56E0;&#x5B50;&#x7684;&#x8BA1;&#x7B97;&#x548C;&#x6211;&#x4EEC;&#x663E;&#x793A;&#x6D4B;&#x5B9A;&#x5C55;&#x54C1;&#x5BF9;&#x6E29;&#x5EA6;&#x3001; &#x5B75;&#x5316;&#x65F6;&#x95F4;&#x548C;&#x4E8C;&#x7532;&#x57FA;&#x4E9A;&#x781C;&#x6D53;&#x5EA6;&#x8010;&#x53D7;&#x6027;&#x826F;&#x597D;&#x3002;

&#x8367;&#x5149;&#x504F;&#x632F;&#x7ED3;&#x5408;&#x5206;&#x6790;&#x6CD5;&#x6765;&#x6807;&#x8BC6;&#x7684;&#x9EC4;&#x7D20;&#x4F9D;&#x8D56; monooxygenases &#x6291;&#x5236;&#x5242;&#x3002;

N-hydroxylating monooxygenases (NMOs) are essential for pathogenesis in fungi and mycobacteria. NMOs catalyze the hydroxylation of lysine and ornithine in the biosynthesis of hydroxamate-containing siderophores. Inhibition of kynurenine monooxygenase (KMO), which catalyzes the conversion of L-kynurenine to 3-hydroxykynurenine, alleviates neurodegenerative disorders such as Huntington's and Alzheimer's diseases and brain infections caused by the parasite Trypanosoma brucei. These enzymes are examples of flavin-dependent monooxygenases, which are validated drug targets. Here, we describe the development and optimization of a fluorescence polarization assay to identify potential inhibitors of flavin monooxygenases. Fluorescently-labeled ADP molecules were synthesized and tested. An ADP-TAMRA chromophore bound to KMO with a K(d) value of 0.60 Â± 0.05 Î¼M and to the NMOs from Aspergillus fumigatus and Mycobacterium smegmatis with K(d) values of 2.1 Â± 0.2 Î¼M and 4.0 Â± 0.2 Î¼M, respectively. The assay was tested in competitive binding experiments with substrates and products of KMO and an NMO. Furthermore, we showed that this assay can be used to identify inhibitors of NMOs. A Z'-factor of 0.77 was calculated and we show that the assay exhibits good tolerance to temperature, incubation time, and DMSO concentration.

A fluorescence polarization binding assay to identify inhibitors of flavin-dependent monooxygenases.

N-hidroxilaci&#xF3;n monooxigenasas (ONM) son esenciales para la patog&#xE9;nesis de los hongos y micobacterias. NMO catalizar la hidroxilaci&#xF3;n de la lisina y la ornitina en la bios&#xED;ntesis de hidroxamato contienen sider&#xF3;foros. La inhibici&#xF3;n de la monooxigenasa quinurenina (KMO), que cataliza la conversi&#xF3;n de L-3-quinurenina de hydroxykynurenine, alivia los trastornos neurodegenerativos como la de Huntington y las enfermedades de Alzheimer y las infecciones cerebrales causadas por el par&#xE1;sito Trypanosoma brucei. Estas enzimas son ejemplos de la flavina-dependientes monooxigenasas, que se validan los objetivos de la droga. A continuaci&#xF3;n, describimos el desarrollo y optimizaci&#xF3;n de un ensayo de polarizaci&#xF3;n de la fluorescencia para identificar inhibidores potenciales de monooxigenasas Flavin. Marcadas con fluorescencia mol&#xE9;culas de ADP fueron sintetizados y ensayados. Un crom&#xF3;foro ADP-TAMRA obligado a KMO con una K (d) el valor de 0,60 &#xB1; 0,05 mM y el NMOS de Aspergillus fumigatus y Mycobacterium smegmatis con K (D) los valores de 2,1 &#xB1; 0,2 micras y 4,0 &#xB1; 0,2 micras, respectivamente. El ensayo fue probado en experimentos de inhibici&#xF3;n con sustratos y productos de KMO y un NMO. Adem&#xE1;s, se demostr&#xF3; que este ensayo puede ser utilizado para identificar inhibidores de NMOS. Un Z &#x26;#39;factor de 0,77 se calcul&#xF3; y se demuestra que el ensayo presenta una buena tolerancia a la temperatura, tiempo de incubaci&#xF3;n, y la concentraci&#xF3;n de DMSO.

Un ensayo de fluorescencia polarizada vinculante para identificar inhibidores de Flavin dependientes de monooxigenasas

N-hydroxylation monooxyg&#xE9;nases (NMOS) sont essentiels pour la pathogen&#xE8;se chez les champignons et les mycobact&#xE9;ries. ONM catalyser l&#x26;#39;hydroxylation de la lysine et l&#x26;#39;ornithine dans la biosynth&#xE8;se d&#x26;#39;hydroxamate contenant sid&#xE9;rophores. L&#x26;#39;inhibition de la kynur&#xE9;nine monooxyg&#xE9;nase (KMO), qui catalyse la conversion de la L-kynur&#xE9;nine en 3-hydroxykynur&#xE9;nine, soulage les troubles neurod&#xE9;g&#xE9;n&#xE9;ratifs tels que Huntington et les maladies d&#x26;#39;Alzheimer et les infections c&#xE9;r&#xE9;brales caus&#xE9;es par le parasite Trypanosoma brucei. Ces enzymes sont des exemples de flavine-d&#xE9;pendantes monooxyg&#xE9;nases, qui sont des cibles m&#xE9;dicamenteuses valid&#xE9;es. Ici, nous d&#xE9;crivons le d&#xE9;veloppement et l&#x26;#39;optimisation d&#x26;#39;un test de polarisation de fluorescence pour identifier des inhibiteurs potentiels de monooxyg&#xE9;nases flavine. Marquage fluorescent des mol&#xE9;cules d&#x26;#39;ADP ont &#xE9;t&#xE9; synth&#xE9;tis&#xE9;s et test&#xE9;s. Un chromophore ADP-TAMRA li&#xE9; &#xE0; KMO avec un K (d) la valeur de 0,60 &#xB1; 0,05 uM et aux ONM de Aspergillus fumigatus et Mycobacterium smegmatis avec K (d) des valeurs de 2,1 &#xB1; 0,2 uM et 4,0 &#xB1; 0,2 pM, respectivement. Le test a &#xE9;t&#xE9; test&#xE9; dans exp&#xE9;riences de liaison comp&#xE9;titive avec des substrats et des produits de KMO et une NMO. En outre, nous avons montr&#xE9; que ce test peut &#xEA;tre utilis&#xE9; pour identifier des inhibiteurs de ONM. Un Z&#x26;#39;-coefficient de 0,77 a &#xE9;t&#xE9; calcul&#xE9; et nous montrent que le dosage pr&#xE9;sente une bonne tol&#xE9;rance &#xE0; la temp&#xE9;rature, le temps d&#x26;#39;incubation, et la concentration de DMSO.

Une &#xE9;preuve de polarisation de fluorescence reliure pour identifier des inhibiteurs de Flavin monooxyg&#xE9;nases d&#xE9;pendantes

N-hydroxylating Monooxygenasen (NMOs) sind entscheidend f&uuml;r die Pathogenese in Pilze und Mykobakterien. NMOs katalysieren die Hydroxylierung von Lysin und Ornithin in die Biosynthese von Hydroxamate-haltigen SIDEROPHORE. Hemmung der Kynurenin-Monooxygenase (KMO), die die Umwandlung von L-Kynurenin zu 3-Hydroxykynurenine katalysiert, lindert Neurodegenerative Erkrankungen wie Chorea Huntington und Alzheimer Krankheiten und Infektionen durch den Parasiten Trypanosoma Brucei Gehirn. Diese Enzyme sind Beispiele f&uuml;r Flavin-abh&auml;ngige Monooxygenasen, die validierte Droge-Ziele sind. Hier beschreiben wir die Entwicklung und Optimierung ein Fluoreszenz-Polarisation-Assay potenzielle Inhibitoren der Flavin-Monooxygenasen zu identifizieren. Leuchtstoff-beschrifteten ADP Molek&uuml;le wurden synthetisiert und getestet. Ein ADP-TAMRA-Chromophor zwangsl&auml;ufig KMO mit einem K(d)-Wert von 0,60 &plusmn; 0,05 &mu;M und der NMOs von Aspergillus Fumigatus und Mycobacterium Smegmatis mit K(d) Werten von 2,1 &plusmn; 0,2 &mu;M und 4,0 &plusmn; 0,2 &mu;M, beziehungsweise. Die Probe wurde wettbewerbsf&auml;hige Bindung Experimente mit Substrate und Produkte der KMO und eine NMO getestet. Dar&uuml;ber hinaus zeigten wir dieser Probe kann verwendet werden, um NMOs-Inhibitoren zu identifizieren. A Z&#39;-Faktor 0.77 wurde berechnet und wir zeigen, dass die Probe gute Vertr&auml;glichkeit und Temperatur, Inkubationszeit und DMSO-Konzentration aufweist.

Ein Fluoreszenz-Polarisation Bindung Assay Inhibitoren der Flavin-abh&auml;ngige Monooxygenasen zu identifizieren.

N-hydroxylating ossigenasi (NMOs) sono essenziali per la patogenesi in funghi e micobatteri. NMOs catalizzano l&#39;idrossilazione di lisina e ornitina nella biosintesi di siderofori hydroxamate-contenenti. Inibizione di chinurenina monoossigenasi (KMO), che catalizza la conversione di L-chinurenina 3-idrossichinurenina, allevia i disturbi neurodegenerativi come la Corea di Huntington e morbo di Alzheimer malattie e infezioni cerebrali causate dal parassita Trypanosoma brucei. Questi enzimi sono esempi di ossigenasi flavina-dipendenti, che sono obiettivi farmacologici validati. Qui, descriviamo lo sviluppo e l&#39;ottimizzazione di un dosaggio di polarizzazione di fluorescenza per identificare potenziali inibitori di flavina ossigenasi. Molecole di ADP con etichetta fluorescente sono stati sintetizzati e testati. Un cromoforo ADP-TAMRA associato a KMO con un valore di K(d) di 0,60 &plusmn; 0,05 &mu;M e di NMOs da Aspergillus fumigatus e Mycobacterium smegmatis con valori K(d) di 2,1 &plusmn; 0,2 &mu;M e 4,0 &plusmn; 0,2 &mu;M, rispettivamente. Il dosaggio &egrave; stato testato in esperimenti di legame competitivo con substrati e prodotti KMO e un NMO. Inoltre, abbiamo dimostrato che questo test pu&ograve; essere utilizzato per identificare inibitori della NMOs. Un Z&#39;-&egrave; stato calcolato il fattore di 0.77 e ci mostrano che il saggio esibisce buona tolleranza a temperatura, tempo di incubazione e concentrazione di DMSO.

Un dosaggio di associazione polarizzazione di fluorescenza per identificare inibitori delle ossigenasi flavina-dipendenti.

N-&#x30D2;&#x30C9;&#x30ED;&#x30AD;&#x30B7;&#x30EB;&#x5316;&#x30E2;&#x30CE;&#x30AA;&#x30AD;&#x30B7;&#x30B2;&#x30CA;&#x30FC;&#x30BC;&#xFF08;NMOS&#xFF09;&#x306F;&#x83CC;&#x985E;&#x3068;&#x30DE;&#x30A4;&#x30B3;&#x30D0;&#x30AF;&#x30C6;&#x30EA;&#x30A2;&#x306E;&#x75C5;&#x56E0;&#x306E;&#x305F;&#x3081;&#x306B;&#x4E0D;&#x53EF;&#x6B20;&#x3067;&#x3059;&#x3002; NMOS&#x306F;&#x3001;&#x30D2;&#x30C9;&#x30ED;&#x30AD;&#x30B5;&#x30E1;&#x30FC;&#x30C8;&#x3092;&#x542B;&#x3080;&#x30B7;&#x30C7;&#x30ED;&#x30D5;&#x30A9;&#x30A2;&#x306E;&#x751F;&#x5408;&#x6210;&#x306B;&#x30EA;&#x30B8;&#x30F3;&#x3001;&#x30AA;&#x30EB;&#x30CB;&#x30C1;&#x30F3;&#x7B49;&#x306E;&#x30D2;&#x30C9;&#x30ED;&#x30AD;&#x30B7;&#x30EB;&#x5316;&#x3092;&#x89E6;&#x5A92;&#x3059;&#x308B;&#x3002; 3 hydroxykynurenine&#x306B;L-&#x30AD;&#x30CC;&#x30EC;&#x30CB;&#x30F3;&#x306E;&#x5909;&#x63DB;&#x3092;&#x89E6;&#x5A92;&#x3059;&#x308B;&#x30AD;&#x30CC;&#x30EC;&#x30CB;&#x30F3;&#x30E2;&#x30CE;&#x30AA;&#x30AD;&#x30B7;&#x30B2;&#x30CA;&#x30FC;&#x30BC;&#xFF08;KMO&#xFF09;&#x306E;&#x963B;&#x5BB3;&#x306F;&#x3001;&#x30CF;&#x30F3;&#x30C1;&#x30F3;&#x30C8;&#x30F3;&#x75C5;&#x3084;&#x30A2;&#x30EB;&#x30C4;&#x30CF;&#x30A4;&#x30DE;&#x30FC;&#x75C5;&#x3068;&#x5BC4;&#x751F;&#x866B;&#x30C8;&#x30EA;&#x30D1;&#x30CE;&#x30BD;&#x30FC;&#x30DE;&#x306B;&#x3088;&#x3063;&#x3066;&#x5F15;&#x304D;&#x8D77;&#x3053;&#x3055;&#x308C;&#x308B;&#x8133;&#x306E;&#x611F;&#x67D3;&#x75C7;&#x306A;&#x3069;&#x306E;&#x795E;&#x7D4C;&#x5909;&#x6027;&#x75BE;&#x60A3;&#x3092;&#x8EFD;&#x6E1B;&#x3057;&#x307E;&#x3059;&#x3002;&#x3053;&#x308C;&#x3089;&#x306E;&#x9175;&#x7D20;&#x306F;&#x3001;&#x5275;&#x85AC;&#x30BF;&#x30FC;&#x30B2;&#x30C3;&#x30C8;&#x3092;&#x691C;&#x8A3C;&#x3055;&#x308C;&#x305F;&#x30D5;&#x30E9;&#x30D3;&#x30F3;&#x4F9D;&#x5B58;&#x6027;&#x30E2;&#x30CE;&#x30AA;&#x30AD;&#x30B7;&#x30B2;&#x30CA;&#x30FC;&#x30BC;&#x306E;&#x4E00;&#x4F8B;&#x3067;&#x3042;&#x308B;&#x3002;&#x3053;&#x3053;&#x3067;&#x306F;&#x3001;&#x30D5;&#x30E9;&#x30D3;&#x30F3;&#x30E2;&#x30CE;&#x30AA;&#x30AD;&#x30B7;&#x30B2;&#x30CA;&#x30FC;&#x30BC;&#x306E;&#x6F5C;&#x5728;&#x7684;&#x306A;&#x963B;&#x5BB3;&#x5264;&#x3092;&#x8B58;&#x5225;&#x3059;&#x308B;&#x305F;&#x3081;&#x306B;&#x3001;&#x86CD;&#x5149;&#x504F;&#x5149;&#x30A2;&#x30C3;&#x30BB;&#x30A4;&#x306E;&#x958B;&#x767A;&#x3068;&#x6700;&#x9069;&#x5316;&#x306B;&#x3064;&#x3044;&#x3066;&#x8AAC;&#x660E;&#x3057;&#x307E;&#x3059;&#x3002;&#x86CD;&#x5149;&#x6A19;&#x8B58;ADP&#x5206;&#x5B50;&#x304C;&#x5408;&#x6210;&#x3055;&#x308C;&#x3001;&#x30C6;&#x30B9;&#x30C8;&#x3055;&#x308C;&#x307E;&#x3057;&#x305F;&#x3002; ADP-TAMRA&#x306E;0.60 K&#xFF08;d&#xFF09;&#x306E;&#x5024;&#x3067;KMO&#x306B;&#x30D0;&#x30A4;&#x30F3;&#x30C9;&#x3055;&#x308C;&#x305F;&#x767A;&#x8272;&#x56E3;&#xB1;0.05&#x3BC;M&#x304A;&#x3088;&#x3073;2.1&#x306E;K&#xFF08;d&#xFF09;&#x306E;&#x5024;&#x304C;&#xB1;0.2&#x3BC;M&#x53CA;&#x3073;4.0&#xB1;0.2&#x3BC;M&#x3001;&#x305D;&#x308C;&#x305E;&#x308C;&#x306E;&#x30A2;&#x30B9;&#x30DA;&#x30EB;&#x30AE;&#x30EB;&#x30B9;&#x3068;&#x30DE;&#x30A4;&#x30B3;&#x30D0;&#x30AF;&#x30C6;&#x30EA;&#x30A6;&#x30E0;&#x30B9;&#x30E1;&#x30B0;&#x30DE;&#x30C1;&#x30B9;&#x304B;&#x3089;NMOS&#x3078;&#x3002;&#x30A2;&#x30C3;&#x30BB;&#x30A4;&#x306F;&#x3001;KMO&#x3068;NMO&#x306E;&#x57FA;&#x8CEA;&#x3068;&#x88FD;&#x54C1;&#x3068;&#x306E;&#x7AF6;&#x5408;&#x7D50;&#x5408;&#x5B9F;&#x9A13;&#x3067;&#x30C6;&#x30B9;&#x30C8;&#x3055;&#x308C;&#x3066;&#x3044;&#x307E;&#x3059;&#x3002;&#x3055;&#x3089;&#x306B;&#x3001;&#x3053;&#x306E;&#x30A2;&#x30C3;&#x30BB;&#x30A4;&#x306F;&#x3001;NMOS&#x306E;&#x963B;&#x5BB3;&#x5264;&#x3092;&#x8B58;&#x5225;&#x3059;&#x308B;&#x305F;&#x3081;&#x306B;&#x4F7F;&#x7528;&#x3059;&#x308B;&#x3053;&#x3068;&#x304C;&#x3067;&#x304D;&#x308B;&#x3053;&#x3068;&#x3092;&#x793A;&#x3057;&#x305F;&#x3002; 0.77&#x306E;Z &#x26;#39;&#x56E0;&#x5B50;&#x3092;&#x8A08;&#x7B97;&#x3057;&#x3001;&#x6211;&#x3005;&#x306F;&#x3001;&#x30A2;&#x30C3;&#x30BB;&#x30A4;&#x306F;&#x826F;&#x597D;&#x306A;&#x6E29;&#x5EA6;&#x306B;&#x5BFE;&#x3059;&#x308B;&#x8010;&#x6027;&#x3001;&#x30A4;&#x30F3;&#x30AD;&#x30E5;&#x30D9;&#x30FC;&#x30B7;&#x30E7;&#x30F3;&#x6642;&#x9593;&#x3001;DMSO&#x6FC3;&#x5EA6;&#x3092;&#x793A;&#x3059;&#x3053;&#x3068;&#x304C;&#x660E;&#x3089;&#x304B;&#x3068;&#x306A;&#x3063;&#x305F;&#x3002;

&#x30D5;&#x30E9;&#x30D3;&#x30F3;&#x4F9D;&#x5B58;&#x6027;&#x30E2;&#x30CE;&#x30AA;&#x30AD;&#x30B7;&#x30B2;&#x30CA;&#x30FC;&#x30BC;&#x306E;&#x963B;&#x5BB3;&#x5264;&#x3092;&#x540C;&#x5B9A;&#x3059;&#x308B;&#x305F;&#x3081;&#x306E;&#x86CD;&#x5149;&#x504F;&#x5149;&#x7D50;&#x5408;&#x30A2;&#x30C3;&#x30BB;&#x30A4;

Reeder Robinson

Department of Biochemistry

Virginia Polytechnic Institute and State University

Monitoring the Reductive and Oxidative Half-Reactions of a Flavin-Dependent Monooxygenase using Stopped-Flow Spectrophotometry