الوقس عدوى الفيروس والتحليل الزمني في التعبير الجيني الفيروسات : الجزء 2

Summary

بروتوكول للعدوى الوقس من خلايا هيلا وتحليل المضيف والفيروسية التعبير الجيني. الجزء 2 من 3.

Abstract

الأسرة

Protocol

الجزء 1 : [كدنا] تجميع من الحمض النووي الريبي

1. قبل استخدام Ambion الأمينية الآليل MessageAmp الثاني عدة ، إضافة الحجم الموصى بها من الإيثانول بنسبة 100 ٪ للمخازن الغسيل.
2. في أنبوب تفاعل PCR ، إضافة إلى 5μg بين 100ng من الحمض النووي الريبي و1μl من مجموع التمهيدي T7 (DT) بنسبة ضئيلة. جعل حجم ما يصل الى 12μl مع nuclease خالية من المياه.
3. احتضان العينات عند 70 درجة مئوية لمدة 10 دقيقة في thermocycler.
4. إزالة عينات الحمض النووي الريبي من 70 درجة مئوية ، وأجهزة الطرد المركزي لفترة وجيزة. مكان على الجليد.
5. يعد ^شارع ستراند 1 التجميعي الرئيسي مزيج والحفاظ على درجة حرارة الغرفة (مع 10 ٪ عن الفائض pipetting الخطأ) (الجدول 1)
6. بلطف ماصة ميكس ماجستير أو نفض الغبار إلى المزيج ، ثم الطرد المركزي لفترة وجيزة.
7. نقل 8μl من مزيج ماجستير في كل عينة الحمض النووي الريبي. مزيج من قبل pipetting صعودا وهبوطا 3-4 مرات.
8. في احتضان 42 درجة مئوية لمدة 2 ساعة في thermocycler.
9. الطرد المركزي عينات لفترة وجيزة ووضع على الجليد. الشروع فورا في الخطوة التالية من التوليف dsDNA.
10. إعداد ستراند ^{الثانية} 2 التجميعي مزيج الرئيسي على الجليد (مع الفائض بنسبة 10 ٪ لpipetting الخطأ) (الجدول 2)
11. بلطف ماصة ميكس ماجستير أو نفض الغبار إلى المزيج ، ثم الطرد المركزي لفترة وجيزة.
12. نقل 80μl لكل عينة والمزيج بلطف صعودا ونزولا pipetting 3-4 مرات.
13. في احتضان 16 درجة مئوية لمدة 2 ساعة في thermocycler.
14. بعد حضانة 2 ساعة ، والمضي قدما في خطوة لتنظيف [كدنا] أو تجمد على الفور في -20 درجة مئوية.

الجزء 2 : مزدوجة الذين تقطعت بهم السبل [كدنا] تنظيف

1. إزالة الصرفة [كدنا] من الثلاجة والسماح لها لكي تتوازن إلى درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة قبل الاستخدام. يهز زجاجة لresuspend تماما المغناطيسي الخرز ملزم [كدنا] قبل الاستخدام.
2. قسامة nuclease خالية من الماء في أنبوب 1.5mL واحتضان في 50-60 درجة مئوية لمدة 10 دقائق على الأقل خلال حضانة لل2hr السابقة.
3. إضافة 180μl البحتة [كدنا] لكل عينة ، ومزيج دقيق من قبل pipetting صعودا وهبوطا. نقل العينات إلى لوحة الجولة القاع 96 - جيدا.
4. الاستمرار في خلط العينات التي تهز برفق على لوحة شاكر المداري ما لا يقل عن 2 دقيقة.
5. نقل لوحة الى وقفة لالتقاط المغناطيسي الخرز المغناطيسي. ترك لوحة على الوقوف لحوالي 6 دقائق ، أو حتى يصبح المزيج شفافة والخرز ومكعبات ملزمة.
6. نضح بعناية طاف مع الشافطة فراغ من دون إزعاج الخرز المغناطيسي. بدلا من ذلك ، إزالة بعناية طاف مع ماصة وتجاهل طاف.
7. إزالة لوحة من الوقوف المغناطيسي.
8. إضافة 150μl الاحتياطي اغسل [كدنا] إلى كل بئر ويهز لوحة لمدة 1 دقيقة على شاكر المداري بسرعة معتدلة. والخرز NOT تفريق في هذه الخطوة ، نظرا لانخفاض التوتر السطحي للالعازلة يغسل.
9. نقل لوحة الى وقفة لالتقاط المغناطيسي الخرز المغناطيسي.
10. نضح بعناية طاف مع الشافطة فراغ من دون إزعاج الخرز المغناطيسي. بدلا من ذلك ، إزالة بعناية طاف مع ماصة وتجاهل طاف.
11. إزالة لوحة من الوقوف المغناطيسي.
12. تكرار غسل مرة ^{الثانية} مع 2 150μl الاحتياطي اغسل [كدنا].
13. بعد غسل ^{الثانية} 2 ، تجفيف الخرز التي تهز لوحة لمدة 2 دقيقة على شاكر المداري في أقصى سرعة. لا overdry!
14. أزل [كدنا] من الخرز بإضافة 18μl الماء nuclease خالية محمى على كل عينة.
15. هزة بقوة لوحة لمدة 3 دقائق على شاكر المداري ، ثم تحقق للتأكد من مشتتة تماما الخرز المغناطيسي. إذا لم يكن كذلك ، لا تزال تهتز.
16. مرة واحدة حبات المغناطيسي قد فرقت بشكل كامل ، نقل الى وقفة لوحة المغناطيسي لالتقاط حبات المغناطيسي.
17. نقل بعناية eluted [كدنا] (~ 16μl) لوحة PCR جديد (أو أنابيب PCR).
18. الانتقال مباشرة إلى الخطوة التالية ، أو تجميد [كدنا] في -20 درجة مئوية.

الجزء 3 : النسخ في المختبر (IVT)

1. تحضير مزيج الرئيسي IVT في درجة حرارة الغرفة (الجدول 3)
2. ماصة بلطف ميكس ماجستير أو نفض الغبار إلى المزيج ، وأجهزة الطرد المركزي لفترة وجيزة.
3. إضافة إلى كل 24μl العينة ، والمزيج بلطف صعودا ونزولا pipetting 3-4 مرات.
4. احتضان عند 37 درجة مئوية لمدة 14 ساعة في thermocycler ، ثم اضغط على 4 درجات مئوية حتى على استعداد لاتخاذ الخطوة التالية.

الجزء 4 : آرنا تنظيف بعد IVT

1. دوامة حبات الحمض النووي الريبي ملزمة لفترة وجيزة للحصول على مزيج حتى قبل استخدامها.
2. تحضير مزيج آرنا ملزم في درجة حرارة الغرفة (الجدول 4) ويمكن القيام بذلك في وقت مبكر -- ويمكن تخزين هذا المزيج أعد ملزمة في درجة حرارة الغرفة لمدة تصل إلى أسبوع واحد.
3. مزيج جيد من قبل vortexing.
4. قسامة شطف آرنا الاحتياطي في أنبوب 1.5mL واحتضان في 50-60 درجة مئوية لمدة لا تقل عن 10 دقيقة.
5. إضافة 70μl من مزيج آرنا ملزملكل عينة ومزيج جيد من قبل pipetting صعودا وهبوطا 3-4 مرات.
6. نقل عينات من لوحة إلى لوحة PCR جولة القاع 96 - جيدا.
7. إضافة 50μl 100 ٪ الأيزوبروبانول لكل عينة ومزيج جيد من قبل pipetting صعودا وهبوطا 3-4 مرات.
8. يهز بلطف على لوحة شاكر المداري على الأقل 2 دقيقة لمزيج دقيق العينات.
9. نقل لوحة الى وقفة لالتقاط المغناطيسي الخرز المغناطيسي. ترك لوحة على الوقوف حتى يصبح المزيج شفافة والخرز ومكعبات ملزمة.
10. نضح بعناية طاف مع الشافطة فراغ من دون إزعاج الخرز المغناطيسي. بدلا من ذلك ، إزالة بعناية طاف مع ماصة وتجاهل طاف.
11. إزالة لوحة من الوقوف المغناطيسي.
12. إضافة محلول الغسيل 100μl آرنا إلى كل بئر ويهز لوحة لمدة 1 دقيقة على شاكر المداري بسرعة معتدلة. قد لا تفريق حبات تماما في هذه الخطوة.
13. نقل لوحة الى وقفة لالتقاط المغناطيسي الخرز المغناطيسي.
14. نضح بعناية طاف مع الشافطة فراغ من دون إزعاج الخرز المغناطيسي. بدلا من ذلك ، إزالة بعناية طاف مع ماصة وتجاهل طاف.
15. إزالة لوحة من الوقوف المغناطيسي.
16. تكرار غسل مرة ^{الثانية} مع الحل 2 100μl اغسل آرنا.
17. بعد غسل ^{الثانية} 2 ، تجفيف الخرز التي تهز لوحة لمدة 1 دقيقة على شاكر المداري في أقصى سرعة. لا overdry العينات!
18. أزل في آرنا من الخرز بإضافة 40μl شطف آرنا محمى الاحتياطي على كل عينة.
19. هزة بقوة على لوحة شاكر مدارية لمدة 3 دقائق ، ثم تحقق للتأكد من مشتتة تماما الخرز المغناطيسي. إذا لم يكن كذلك ، لا تزال تهتز.
20. مرة واحدة حبات المغناطيسي قد فرقت بشكل كامل ، نقل الى وقفة لوحة المغناطيسي لالتقاط حبات المغناطيسي. وطاف يحتوي على آرنا أدرجت نيراتوفيتشي الأميني الآليل.
21. نقل بعناية آرنا eluted لوحة PCR جديد (أو أنابيب PCR).
22. (خطوة اختيارية) للتحقق من تركيز الحمض النووي الريبي من العينات عن طريق قياس 1.5μl على معمل NanoDrop.
23. تواصل فورا على الخطوة التالية ، أو تخزين آرنا في -80 درجة مئوية.

الجدول رقم 1 : [كدنا] ^شارع ستراند 1 التجميعي ميكس ماجستير

الكاشف	المبلغ : 1 رد الفعل
10X الاحتياطي ستراند الأولى	2 ميكرولتر
dNTP ميكس	4 ميكرولتر
ريبونوكلياز المانع	1 ميكرولتر
مجموعة النصي	1 ميكرولتر

الجدول 2 : [كدنا] ستراند ^{الثانية} 2 التجميعي ميكس ماجستير

الكاشف	المبلغ : 1 رد الفعل
Nuclease المياه مجانا	63 ميكرولتر
10X الاحتياطي ستراند الثانية	10 ميكرولتر
dNTP ميكس	4 ميكرولتر
بوليميراز الدنا	2 ميكرولتر
ريبونوكلياز H	1 ميكرولتر

الجدول 3 : IVT ماجستير ميكس

الكاشف	المبلغ : 1 رد الفعل
aaUTP حل (75 ملم)	2 ميكرولتر
ATP ، CTP ، GTP مزيج (25 ملم)	12 ميكرولتر
T7 UTP حل (75 ملم)	2 ميكرولتر
T7 الاحتياطي الرد 10X	4 ميكرولتر
T7 أنزيم ميكس	4 ميكرولتر

الجدول 4 : آرنا ميكس تجليد

الكاشف	المبلغ : 1 رد الفعل
الخرز RNA ملزم *	10 ميكرولتر
حبة * إعادة تعليق الحل	4 ميكرولتر
100 ٪ الأيزوبروبانول **	6 ميكرولتر
آرنا مركزة الاحتياطي تجليد	50 ميكرولتر

* مزيج من الحمض النووي الريبي ملزمة مع حبات الحل إعادة تعليق خرزة الأولى.
** إضافة الأيزوبروبانول وتخلط جيدا قبل إضافة تركز آرنا العازلة ملزمة.

Discussion

خطوات حاسمة

لا ينصح الجولة الثانية من التضخيم كما لوحظت التحيز في البيانات صفيف. الاختلاط في كل خطوة بعناية الأنزيمية (1 و 2 ^ش التوليف حبلا ^{الثانية} [كدنا] ، IVT) أمر حاسم للحصول غلة جيدة التضخيم ، كما هو احتضان كل خطوة الأنز...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Amino Allyl MessageAmp II aRNA amplification kit	Reagent	Applied Biosystems	AM1753	For 20 reactions
Amino Allyl MessageAmp II aRNA amplification kit	Reagent	Applied Biosystems	AM1821	For 100 reactions, in a 96-well format
NanoDrop ND-1000 UV-VIS spectrophotometer	Other	NanoDrop	ND-1000	Or equivalent spectrophotometer