JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Protocol
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

بروتوكول للعدوى الوقس من خلايا هيلا وتحليل المضيف والفيروسية التعبير الجيني. الجزء 3 يصف عملية وضع العلامات fluorescently تضخيم الحمض النووي الريبي من كل من المضيف والعينات الفيروسية التي اقتران الآليل الأمينية من الأصباغ. الجزء 3 من 3.

Abstract

الأسرة

Protocol

الجزء 1 : آرنا العلامات : الأمينية اقتران الآليل من الأصباغ

  1. إضافة 1μg من العينات آرنا في أنابيب microcentrifuge 1.5mL.
  2. فراغ تجفيف العينات في درجة حرارة منخفضة أو معدومة حتى تجف تماما. سقف كل أنبوب في أقرب وقت كما هو جاف -- لا overdry!
  3. إضافة إلى اقتران 9μl العازلة لكل أنبوب وresuspend وآرنا بواسطة vortexing بلطف لمدة 1 دقيقة. أجهزة الطرد المركزي لفترة وجيزة لجمع العينات في الجزء السفلي من الأنبوب ثم يسمح العينة الجلوس على الجليد.
  4. إضافة 22μl DMSO ذات جودة عالية إلى كل أنبوب Cy3 أو Cy5 صباغة. أنبوب واحد من صبغة يكفي لمدة 2 العينات. الصبغة Cy3 هو لوصفها عينات مرجعية الخاص بك ، وصبغ Cy5 هو لوصفها عينات الاختبار.
  5. دوامة الأصباغ إلى مزيج دقيق. الحفاظ على الأصباغ في الظلام حتى جاهزة للاستخدام. لا تعد صبغة في وقت سابق من 1 ساعة قبل استخدامها. تأكد من عدم الماء يحصل في مزيج صبغ / DMSO في أي لحظة.
  6. إضافة 11μl الصبغة DMSO / قبرصي على استعداد لكل عينة. مزيج جيد من قبل vortexing بلطف.
  7. احتضان عن 30-45 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. تغطية العينات مع البربون أو الاحتفاظ بها في درج للحد من التعرض للضوء.
  8. بعد حضانة ، إضافة إلى 4.5μl hydroxlyamine كل عينة لإرواء التفاعل. مزيج جيد من قبل vortexing بلطف.
  9. احتضان لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. تغطية العينات مع البربون أو الاحتفاظ بها في درج للحد من التعرض للضوء.

الجزء 2 : إعتبر آرنا تنظيف

  1. دوامة حبات الحمض النووي الريبي ملزمة لفترة وجيزة للحصول على مزيج حتى قبل استخدامها.
  2. تحضير مزيج آرنا ملزم في درجة حرارة الغرفة (الجدول 1)
  3. مزيج جيد من قبل vortexing.
  4. Aliquote الاحتياطي شطف آرنا في أنبوب 1.5mL واحتضان في 50-60 درجة مئوية لمدة لا تقل عن 10 دقيقة.
  5. إضافة 70μl من مزيج آرنا ملزمة لكل عينة ومزيج جيد من قبل pipetting صعودا وهبوطا 3-4 مرات.
  6. نقل عينات من لوحة إلى لوحة PCR جولة القاع 96 - جيدا.
  7. إضافة 50μl 100 ٪ الأيزوبروبانول لكل عينة ومزيج جيد من قبل pipetting صعودا وهبوطا 3-4 مرات.
  8. يهز بلطف على لوحة شاكر المداري على الأقل 2 دقيقة لمزيج دقيق العينات.
  9. نقل لوحة الى وقفة لالتقاط المغناطيسي الخرز المغناطيسي. ترك لوحة على الوقوف حتى يصبح المزيج شفافة والخرز ومكعبات ملزمة.
  10. نضح بعناية طاف مع الشافطة فراغ من دون إزعاج الخرز المغناطيسي. بدلا من ذلك ، إزالة بعناية طاف مع ماصة وتجاهل طاف. يجب أن يكون إما طاف ردي مشرق أو زرقاء لامعة في هذه المرحلة نظرا لجزيئات صبغة فردية.
  11. إزالة لوحة من الوقوف المغناطيسي.
  12. إضافة محلول الغسيل 100μl آرنا إلى كل بئر ويهز لوحة لمدة 1 دقيقة على شاكر المداري بسرعة معتدلة. قد لا تفريق حبات تماما في هذه الخطوة.
  13. نقل لوحة الى وقفة لالتقاط المغناطيسي الخرز المغناطيسي.
  14. نضح بعناية طاف مع الشافطة فراغ من دون إزعاج الخرز المغناطيسي. بدلا من ذلك ، إزالة بعناية طاف مع ماصة وتجاهل طاف.
  15. إزالة لوحة من الوقوف المغناطيسي.
  16. تكرار غسل مرة الثانية مع الحل 2 100μl اغسل آرنا.
  17. بعد غسل الثانية 2 ، تجفيف الخرز التي تهز لوحة لمدة 1 دقيقة على شاكر المداري في أقصى سرعة. لا overdry العينات!
  18. أزل في آرنا من الخرز بإضافة 20μl شطف آرنا محمى الاحتياطي على كل عينة.
  19. هزة بقوة على لوحة شاكر مدارية لمدة 3 دقائق ، ثم تحقق للتأكد من مشتتة تماما الخرز المغناطيسي. إذا لم يكن كذلك ، لا تزال تهتز.
  20. مرة واحدة حبات المغناطيسي قد فرقت بشكل كامل ، نقل الى وقفة لوحة المغناطيسي لالتقاط حبات المغناطيسي. وطاف يحتوي على تنظيف ، وعينات آرنا المسمى ، ويجب أن يكون إما وردي شاحب أو أزرق شاحب.
  21. نقل بعناية آرنا eluted لوحة PCR جديد (أو أنابيب PCR).
  22. (خطوة اختيارية) للتحقق من تركيز الحمض النووي الريبي وكمية من الصبغة في العينات عن طريق قياس 1.5μl على معمل NanoDrop باستخدام وحدة ميكروأري.
  23. هجن فورا آرنا صفت على منصة ميكروأري من اختيارك ، أو بدلا من ذلك ، يمكنك تخزين آرنا المسمى في -80 درجة مئوية حتى تكون جاهزة للتهجين.

الجدول ميكس آرنا 1 تجليد

الكاشف المبلغ : 1 رد الفعل
الخرز RNA ملزم * 10μl
حبة * إعادة تعليق الحل 4μl
100 ٪ الأيزوبروبانول ** 6μl
آرنا مركزة الاحتياطي تجليد 50μl

* مزيج من الخرز RNA ملزم معحبة حل إعادة تعليق first
** إضافة الأيزوبروبانول وتخلط جيدا قبل إضافة تركز آرنا العازلة ملزمة.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

خطوات حاسمة

عند إجراء اقتران الأمينية الآليل ، فمن الأهمية بمكان أن resuspend الصبغة DMSO في فترة وجيزة (أقل من 1 ساعة) قبل توصيل المياه وضمان عدم وجود مزيج يحصل في صبغ / DMSO ، لأنها سوف تتفاعل مع مجموعة نشطة على صباغة. لا overdry الحمض النووي ال...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

معهد وايتهيد زملاء صناديق

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
CyDye Post-Labeling Reactive Dye PackReagentGE HealthcareRPN5661Contains both Cy3 and Cy5 dyes
NanoDrop ND-1000 UV-VIS spectrophotometerOtherNanoDropND-1000Or equivalent spectrophotometer

References

  1. Rubins, K. H., Hensley, L. E., Bell, G. W., Wang, C., Lefkowitz, E. J., Brown, P. O., Relman, D. A. Comparative analysis of viral gene expression programs during poxvirus infection: a transcriptional map of the vaccinia and monkeypox genomes. PLoS ONE. 3 (7), e2628-e2628 (2008).
  2. Assarsson, E., Greenbaum, J. A., Sundström, M., Schaffer, L., Hammond, J. A., Pasquetto, V., Oseroff, C., Hendrickson, R. C., Lefkowitz, E. J., Tscharke, D. C., Sidney, J., Grey, H. M., Head, S. R., Peters, B., Sette, A. Kinetic analysis of a complete poxvirus transcriptome reveals an immediate-early class of genes. Proc. Natl. Acad. Sci. 105 (6), 2140-2145 (2008).
  3. Satheshkumar, P. S., Moss, B. Poxvirus transcriptome analysis. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, E62-E62 (2008).
  4. Assarsson, E., Greenbaum, J. A., Sundström, M., Schaffer, L., Hammond, J. A., Pasquetto, V., Oseroff, C., Hendrickson, R. C., Lefkowitz, E. J., Tscharke, D. C., Sidney, J., Grey, H. M., Head, S. R., Peters, B., Sette, A. A. Reply to Satheshkumar and Moss: Poxvirus transcriptome analysis. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, E63-E64 (2008).
  5. Guerra, S., López-Fernández, L. A., Pascual-Montano, A., Muñoz, M., Harshman, K., Esteban, M. Cellular gene expression survey of vaccinia virus infection of human HeLa cells. J Virol. 77 (11), 6493-6506 (2003).
  6. Guerra, S., López-Fernández, L. A., Conde, R., Pascual-Montano, A., Harshman, K., Esteban, M. Microarray analysis reveals characteristic changes of host cell gene expression in response to attenuated modified vaccinia virus Ankara infection of human HeLa cells. J Virol. 78 (11), 5820-5824 (2004).
  7. Guerra, S., López-Fernández, L. A., Pascual-Montano, A., Nájera, J. L., Zaballos, A., Esteban, M. Host response to the attenuated poxvirus vector NYVAC: upregulation of apoptotic genes and NF-kappaB-responsive genes in infected HeLa cells. J Virol. 80 (2), 985-998 (2006).
  8. Guerra, S., Nájera, J. L., González, J. M., López-Fernández, L. A., Climent, N., Gatell, J. M., Gallart, T., Esteban, M. Distinct gene expression profiling after infection of immature human monocyte-derived dendritic cells by the attenuated poxvirus vectors MVA and NYVAC. 81 (16), 8707-8721 (2007).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

26 Ambion MessageAmpII

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved