يعيش التصوير خلية من طراز F - أكتين حيوية عن طريق الميكروسكوب الرقطة نيون (FSM)

Summary

الاختيار ، microinjection ، والتصوير من fluorescently المسمى F - أكتين عبر الفلورسنت رقطة المجهري (FSM).

Abstract

في هذا البروتوكول وصفنا استخدام الميكروسكوب الرقطة نيون (FSM) لالتقاط صور عالية الدقة للديناميات أكتين PtK1 في الخلايا. وهناك ميزة فريدة من FSM هو قدرته على التقاط الحركة ودوران حركية (التجميع / التفكيك) من شبكة من طراز F - أكتين داخل الخلايا الحية. هذه التقنية مفيدة بشكل خاص في القياسات الكمية المستمدة من طراز F - أكتين ديناميات عندما يقترن برامج الكمبيوتر الرؤية (qFSM). نحن تصف التحديد ، والتصور microinjection تحقيقات أكتين الفلورية في الخلايا الحية. الأهم من ذلك ، إجراءات مماثلة تنطبق على تصور macomolecular الجمعيات الأخرى. وقد ثبت عن FSM ميكروتثبول ، خيوط وسيطة ، والمجمعات الالتصاق.

Protocol

المادة 1 : الحصول على أكتين الخاص fluorescently المسمى لFSM

المواد المطلوبة : تنقية أكتين ، fluorophore (اليكسا ، X - رودامين مستحسن). G - العازلة ، نابذة فائقة السرعة

1. ومن المكونات الرئيسية لاكتساب FSM الأفلام الجيدة يتطلب وضع العلامات المناسبة أكتين (أو هيكل الخلية البروتينات الأخرى) مع fluorophore من اختيارك.
   ونحن نوصي باستخدام fluorophores من اليكسا (488 ، 568 من موجات) وX - رودامين المشتقات استر succinimidyl التي تستهدف كشف بقايا يسين على سطح أكتين.
2. عند اختيار fluorophore الخاص وطول موجته المناسبة ، تأكد من أن الإعداد الخاص المجهر والفلاتر المناسبة (الإثارة والانبعاث) والقنابل المضيئة (الزئبق مصباح القوس و / أو الليزر) لاستيعاب سمة الخاص الفلورسنت. نوصي موجات في اختيار اللون البرتقالي لموجات الأحمر (560-630 نانومتر) للحد من آثار مضان الذاتي والصورة والضرر لضمان توافقه مع GFP - تقارن.
3. ويمكن استخراج نقي أكتين من الأنسجة العضلية المنتمين إلى الجرذ أو الدجاج ، ولكنها تتطلب إجراءات مطولة من استخراج مسحوق الأسيتون العضلات. يمكن شراؤها من العضلات مسحوق Invitrogen الأسيتون. هو لم تناقش إجراءات وضع العلامات في هذا البروتوكول ، ولكن يمكن العثور عليها هنا [1]
4. بدلا من ذلك ، يمكنك شراء البروتينات أكتين المسمى من الباعة عدة من بينها شركة الهيكل الخلوي ، وInvitrogen. خدمات العلامات مخصصة تتوفر أيضا من خلال Invitrogen. يمكن شراؤها المنقى وغير المسمى أكتين (كلا العضلات وأكتين nonmuscle) من شركة الهيكل الخلوي
5. إذا كنت قررت شراء أو تحضير الخاصة بك أكتين المسمى ، وتريد أن تضمن أن نسبة العلامات هي في مكان ما حول 0،3-0،7 الأصباغ في مونومر أكتين. قد مرتفعة جدا نسبة العلامات تأثير حركية دوران (وملزم للبروتينات المرتبطة بها) لخيوط الأكتين ، في حين أن نسبة منخفضة للغاية وضع العلامات سوف يؤدي الى سوء يبحث الرقطة (إشارة إلى انخفاض الضجيج) ، ويمكن أن يسبب مشاكل microinjection (أنظر أدناه). وهذا هو عامل حاسم من أجل الحصول على صور جيدة رقطة.
6. قبل التخزين على المدى الطويل ، ينبغي توضيح الحل أكتين صفها في الغزل 75000 -- 80000 x ج لمدة 20 دقيقة في 4 درجات مئوية. يجب أن يتم تخزينها في أكتين المسمى G - العازلة الحل وأبقى -80 درجة مئوية. 2 إعداد aliquots UL ينصح بشدة للحد من الآثار الضارة للذوبان تجميد المتكرر (يؤدي الى ذوبان كتل). الامتناع عن تعريض الحل أكتين المسمى إلى الضوء المباشر (لن photobleaching من fluorophores). نوصي باستخدام أنابيب microcentrifuge مبهمة للتخزين على المدى الطويل.

المادة 2 : إعداد الخلايا وصفت Microinjection أكتين

المواد المطلوبة : الإبر microinjection ، microsyringe ، microloaders ، ووسائل الإعلام الخلية prewarmed ، العازلة الحقن ، ودلو من الجليد ، والمجهر (عصابة المرحلة ، مرحلة الهدف النقيض 40X ، transjector ، مجتذب الإبرة ، micromanipulator)

1. العديد من أنواع الخلايا قابلة للأوروغواي ، ولكن الحصول على صور جيدة رقطة تعتمد اعتمادا مباشرا على نجاح الإجراء microinjection. عند اختيار الخلايا لFSM ، والخلايا ينبغي أن تكون كبيرة (> 50 أم في قطر) ، ينبغي أن تنتشر عندما مطلي ، وتكون ملتصقة بطبيعة الحال إلى ركائز (أو الأطباق البلاستيكية زراعة الأنسجة). كما أنها تساعد في العصارة الخلوية إذا الخلية تحتل مساحة أكبر من نواتها. المعايير المذكورة آنفا ضمان خلايا قابلة للmicroinjection. نجاح المرشح تشمل خطوط الخلية (ولكن ليس على سبيل الحصر) PtK1 [2،3] ، وخلايا الرئة نيوت [4] ، والخلايا العصبية Aplysia [3].
2. وينبغي مطلي الخلايا على الزجاج coverslips مربع (22 × 22 ملم ؛ لا 1-1/2) التي تم حمض غسلها. ويمكن تطبيق المعيار طلاء الركيزة إلى ساترة ، وسوف لن يؤثر microinjection.
3. الاختيار الصحيح من الإبر microinjection يعتمد على حجم الفتحة تلميح. عادة ، يمكن أن أحجام حفرة كبيرة في حجم من 0.5 إلى أم كبيرة مثل أم 3. ومع ذلك ، فإننا نوصي بأن حقن أكتين يتطلب حجم افتتاح الأمثل بين 0،5-1 أم. إذا واجهت مشاكل انسداد باستمرار ، ويمكن استيعاب أحجام أكبر حفرة لتقديم موحودي غير المرغوب فيها وكذلك شعيرات أكتين بلمرة. يمكن شراؤها عن طريق الإبر Microinjection الباعة عدة بما في ذلك النظم التي تجعل من الإبر إيبندورف microinjection femtotip. إذا بدلا من مجتذب إبرة التجارية المتاحة ، ويمكن أن الأنابيب الزجاجية التي تم شراؤها من microinjection سوتر ، وسحبت المطابقة للمواصفات. للمبتدئين ، ونوصي وجود 10-20 الإبر سحبت على اليد قبل البدء في إجراء الحقن.
4. من تركيز الحقن "المثالي (تركيز النهائي من أكتين تحميلها في إبرة الخاص) من أكتين بين 0،5-1،0 ميكروغرام / UL على أساس نسبة 40 ٪ من العلامات صبغ لمونومر أكتين. ويمكن تعويض انخفاض نسبة توسيم أكتين الخاص بك عن طريق الحقن في تركيزات أعلى (1-3 ميكروغرام / UL). ومع ذلك ، فإن وتيرة انسداد إبرة الخاصيمكن زيادة. هذا يمكن أن يخفف جزئيا باستخدام الإبر مع فتحات أكبر. يمكن أن تضعف تركيز المخزون من أكتين بإضافة الثلج الباردة العازلة الحقن. ويمكن أيضا الجليد الباردة ddH2O يمكن استخدامها لتخفيف سريع للحقن. وينبغي في هذه المرحلة أن تبقى كل الحلول تعمل على الجليد.
5. تحميل 0،5-1،0 UL حل أكتين الخاص باستخدام microsyringe (ضيقة عيار -- هاملتون) ، أو بدلا من ذلك باستخدام ماصة غيض microloader.
6. الاستغناء بعناية الحل أكتين ، وإطلاق سراح بلطف الحل. وينبغي تجنب الفقاعات ، ولكن يمكن إزالتها بسهولة عن طريق تناول السوائل الزائدة المحيطة الفقاعة.
7. ضمان أن الحل أكتين يستريح تماما على الحافة الإبرة. يمكن حل الزائد في أي مكان على طول شعري من الإبرة عرقلة تدفق الحقن.
8. الآن ، ونعلق بعناية الإبرة ، وتجنب الاتصال مع طرف الإبرة ، لصاحب حاقن. موقف حامل الإبرة بحيث يجعل زاوية 35-50 درجة إلى قاعدة للمرحلة المجهر. ويفضل أقل الزوايا.
9. تخفيض رأس الإبرة حتى أنه بالكاد فواصل السطح من وسائل الإعلام الاستحمام الخلايا الخاصة بك.
10. الموقف الآن طرف الإبرة (بدون تخفيض) بحيث تقع مباشرة فوق مركز للهدف. إذا محاذاة طرف الإبرة مع هذا الهدف ، يجب أن ترى هالة مشرقة من خلال العدسة. هذا هو نهاية الحافة الإبرة. تتحرك ببطء قد إبرة الجانب إلى الجانب (باستخدام مناور) مساعدة أفضل موقع هالة.
11. ضبط ض التركيز على المجهر حتى الخلايا الخاصة بك في عرض واضح. الآن ، وانخفاض ببطء غيض حتى الهالة يضيق تدريجيا حتى تتلاقى في النهاية في رأس الإبرة -- سوف تحتاج إلى السيطرة على التركيز (Z - الموقف) في وقت واحد. ميزة إضافية للبحث عن هو رمح الإبرة ، والتي سوف يلقي الظلال الخطية. وخفض الإبرة تحدد تدريجيا رمح الإبرة. متى يجب القيام به بشكل صحيح نهاية الإبرة وخلايا الخاص على حد سواء أن تكون في عرض واضح. قد تكون هناك حاجة لتعديل طفيف على عصابة المرحلة لتحسين التباين.
12. عند التنقل ، وضمان رأس الإبرة هو أعلى بكثير من الخلايا الخاصة بك لمنع كسر رأس الإبرة.
13. عند اختيار لحقن الخلايا ، يجب أن الخلايا التي يمكن أن تواجه الحواف الحرة طرف الإبرة. وسيضمن هذا المنحدر انخفاض الخلية (سمكا من النقطة ، حيث يقيم نواة ، في أنحف نقطة الحافة الأمامية) سيجتمع طرف الإبرة ، بدلا من تشغيل موازية له.
14. يجب تعيين ضغط إبرة في 0،3-0،8 رطل. سوف تطبق نتيجة الضغط المستمر في تدفق مستمر من الحل أكتين.
15. بعد اتخاذ قرار بشأن خلية لحقن ، والموقف الخاص بك حتى إبرة غيض بجانب النواة (منطقة محيط بالنواة ، سمكا جزء من الخلية حيث النواة ليست مباشرة أدناه).
16. انخفاض ببطء ، وتعديل الموقف من الإبرة حتى غيض محبط الغشاء ، والآن انخفاض تدريجي حتى الحافة الإبرة قد اخترقت الغشاء. إذا كانت قد اخترقت إبرة تماما الغشاء ، وسوف تظهر الخلية أكثر إشراقا ، في أقرب وقت كما ترون هذا الاختلاف رفع الإبرة حتى أنه لم يعد يلامس الخلية. فإن ثقب الفعلية والعملية عن طريق الحقن تأخذ 0.5 الى 2 ثانية.
17. عندما يوظف بشكل صحيح ، وسوف تظهر على شكل خلية دون تغيير ، في حين حقن الكثير سيؤدي التراجع السريع من حافة الخلية ، وفي بعض الحالات سوف نرى في الواقع الخلية تنفجر.
18. إذا كنت لا ترى التغييرات في الخلية عندما microinjecting (لا تحصل على أكثر إشراقا) ، قد تكون مغلقة رأس الإبرة. يمكنك اختبار هذا عن طريق الضغط على "تنظيف" إذا كانت متوفرة على الزر الخاص transjector. إذا كان مفتوحا ، فإن ذلك سيزيد بشكل كبير من تدفق الضغط المستمر وهو ما يمكن ملاحظته من خلال العدسات -- سوف تظهر كما يمكن ملاحظة التموجات والحطام في مكان قريب تفريق.
19. إذا تم إغلاق غيض الإبرة ، يمكنك اختيار لادخال ابرة microinjection جديدة أو محاولة لكسر رأس الإبرة بلطف عن طريق خفض الإبرة حتى غيض من مكابس إبرة ضد ساترة الزجاج ، مما تسبب في نهاية جدا من غيض لكسر. وينبغي أن يكون منطقة الكسر ليس أكثر من ^عشر 1 / 5 من منطقة نقطة الإبرة (ذلك الجزء من الإبرة الذي يبدأ لتتلاقى في نقطة).
20. تواصل مع الحقن ، والإنفاق لا يزيد عن 20 -- 45 دقيقة لكل دورة microinjection (سيعتمد على نوع من الخلايا). وكقاعدة عامة ، ينصح دورات أقصر لتقليل الضغط على الخلايا.
21. بعد الانتهاء من microinjection ، وتغير وسائل الإعلام في خلية الطبق بإضافة وسائل الاعلام prewarmed الطازجة. ثم السماح لاسترداد الخلايا لمدة 30 دقيقة في حاضنة قبل التصوير. هذا سيسمح ايضا للأكتين على الاندماج في الهيكل الخلوي الشبكة الموجودة.

الباب 3 : تجميع دائرة التصوير

المواد المطلوبة : ، ساترة الشريط مزدوجة الجوانب ، Q - نصائح ، ملقط ، valap كيم القضاء ، oxyrase ، ووسائل الإعلام والتصوير ، وشفرة حلاقة ، P200 بيpette ، والإيثانول النقي

1. تبدأ وسائل الإعلام prewarming التصوير وذوبان a قسامة 15 ماي من Oxyrase. تأكد لحماية oxyrase حساس من الضوء. وإضافة oxyrase يقلل كثيرا من آثار photobleaching.
2. Prewarm في valap ، من خلال تحديد درجة حرارة منخفضة لوحة الساخنة. لا اسخن / حرق valap لأنها سوف تفقد فعاليتها باعتبارها تسرب.
3. مسح أسفل ساترة مع kimwipe وصب مع الإيثانول النقي لتنظيف وازالة الحطام صغيرة.
4. مكدس اثنين من أطوال الحجم يساوي (2.5 سم طويلة) من وجهين الشريط على رأس كل منهما الآخر ، وذلك باستخدام سطح نظيف شقة كمنبر. اضغط على أي فقاعات الهواء المحبوس لإنشاء منبسط تماما.
5. باستخدام شفرة حلاقة ، وقطع قطعتين على التوالي على طول المحور الطويل ، بحيث يكون لكل قطاع التدابير 0.5 سم في العرض.
6. باستخدام الملقط ، وضع كل قطاع على حافة طويلة ساترة بحيث شرائح اثنين من الشريط يخلق فجوة في وسط ساترة الخاص. اضغط برفق على الشريط لجعل الختم لطيفة مع الزجاج. سوف يجرد من الشريط بمثابة الفواصل بين ساترة وساترة ل.
7. تأكد من وvalap المسال تماما قبل البدء في الخطوة التالية.
8. استرداد الوسائط prewarmed التصوير ، مضيفا 15 من المجاهدين في كل oxyrase UL 500 من وسائل الإعلام.
9. kimwipes أضعاف إلى مثلثات لإنشاء 3 حواف حادة. وسيتم استخدام هذا لإنشاء سطح جاف لعصا على الشريط.
10. استرداد خلايا الجسم من الحاضنة. باستخدام الملقط ، والاستيلاء على ركلة ركنية من ساترة. المكان بسرعة ساترة على kimwipe (الجانب الخلية مواجهة ، وليس لمس الأنسجة) ، واستخدام kimwipe مطوية لمحو الجانبين معارضة من ساترة لخلق سطح شبه الجافة (على السطح حيث بقية خلايا الجسم).
11. باستخدام الملقط ، والاستيلاء على الزاوية ساترة ووضعه على ساترة بحيث يتم محاذاة السطوح الجافة إلى شرائح اثنين من الشريط. لاحظ الآن لديك الجانبين مغلقة واثنين من الشقوق المفتوحة. ببطء ماصة UL 200 من حلول التصوير وسائل الإعلام ، oxyrase الخاص على مقربة من أحد الافتتاح. الأهم ، ينبغي إدخال أي فقاعات هواء. وينبغي أن امتص الحل تصل الى غرفة تجميعها حديثا من قبل قوات الشعرية ، وبالتالي غمر خلايا الجسم بشكل كامل في الحل.
12. باستخدام الداب Q - غيض من الزوايا الأربع مع ساترة الخاص valap ذابت بسرعة لتركيب وتثبيت ساترة. ستلاحظ أن يجف على الفور valap (خلال ثوان في درجة حرارة الغرفة).
13. بدأت الآن مع الجانبين مفتوحة (غير الشريط الجانب) ، وإرساء شريط رقيقة من valap باستخدام Q - غيض ومحاكاة لسكتة دماغية بالفرشاة. تكرار للجانبين مغلقة. ببطء بناء على معطف من valap ، مما يعزز ختم بتكرار الخطوات الطلاء. وينبغي أن يقتصر على حواف valap ، تاركا وسط ساترة واضحة.
14. بلطف تنظيف جزء من مركز ساترة باستخدام Q - غيض مع ddH2O لإزالة أي بقايا وسائل الاعلام ، لأنها تدرك ليس لسحق الخلايا. تكرار تنظيف الخطوة مع الإيثانول النقي.
15. سيكون لديك الآن في غرفة التصوير مغلق تماما الأمثل لطخة التصوير. وجود العلبة مغلقة تماما منع fluorophores بك من photobleaching بسرعة.

المادة 4 : الخلايا التصوير

المواد المطلوبة : مقلوب widefield المجهر ، mecury مصباح والفلاتر المناسبة ، تبرد الكاميرا CCD مع بكسل 6،7 ميكرون ، والفتحة العددية العالية للنفط ، الغمر خطة لامزيغ الأهداف (60X إلى 100X ، أو مرحلة DIC). الاهتزاز الجدول. التصوير البرمجيات.

1. Prewarm المرحلة المجهر الى 37 درجة. المكان غرفة التصوير الخاص استكملت حديثا ، وانتظر 10-15 دقيقة لدرجة الحرارة في الاستقرار قبل التصوير.
2. تبدأ الخلايا من خلال التركيز الخاص في الميدان برايت ، والعثور على خلايا الجسم ثم حقنها بواسطة تبديل الإعدادات الصحيحة مضان. في محاولة للتقليل من وقت التعرض للحد من photobleaching مضان.
3. بحث عن الخلايا التي حقنت صحية رائدة حواف منحنية. ستتميز خلال حقن الخلايا (خلايا انفجرت) من حواف خشنة وتراجعوا ، تشبه أرجل كاذبة خيطية عديدة -- تجنب تصوير هذه الخلايا.
4. وضبط حيازة تعتمد على نوع من الخلايا ، ونوعية أكتين المسمى ، ومكونات المجهر. ومع ذلك ، ينبغي ضبط التعرض لا يكون أكبر من 2 ثانية ، ويجب تعيين الفاصل الزمني بين الإطارات بين 5 و 10 ثانية. يمكن أطوال نموذجية لسلسلة زمنية (لكل خلية المصورة) تختلف في أي مكان ما بين 10 إلى 30 دقيقة ، وغير محدودة من آثار photobleaching. ويمكن تشغيل إعدادات الكاميرا على كسب أعلى لزيادة الإشارة إلى الضوضاء.
5. رقطة الخصائص المثالية ينبغي أن يكون كل رقطة متباعدة بواسطة ~ 2 رقطة أقطار مجاورة لطخة المقبل. وهذا أمر الأمثل المعاينة المكانية والزمانية للهيكل أكتين. للخلايا الظهارية ، سوف تظهر شبكة أكتين الأرقط متجانسة ، مع بقع تنتشر بالتساوي على حدة. خطوط الخلايا التي تتميز الألياف الكثيفة أو الإجهاد lamellipodiaوسيتم تمييزها ، ولكن سوف يكون له مظهر منقط / الأرقط. وينبغي تعديل إعدادات التعرض للحصول على أفضل الصور الأرقط.
6. والإفراط في خلايا microinjected الرقطة والمزدحمة بالسكان والتي لا تبدو منفصلة. وألياف التوتر وlamellipodia يفقد مظهره المنقط.
7. وتحت microinjected تظهر الخلايا قاتمة للغاية من خلال العدسة ، التي تحتوي على بقع التي هي بعيدة عن بعضها البعض (> 10 الرقطة بعيدا) والتي تظهر بشكل عشوائي متناثرة. والألياف والتوتر وlamellipodia في هذه الخلايا لا يمكن تمييزها.
8. مفتاح الحصول على "الجيدة" رقطة الأفلام هو الحفاظ على التركيز. هذا مهم بشكل خاص لتحليل الوظائف التي تنطوي على تدفق رقطة والقياسات دوران. وبالتالي فإن نوعية التحليل الكمي في تأمين تعتمد على التركيز لمدة مرور الوقت. هذا يمكن أن يكون تحديا من نوع خاص ، إذا كانت الطائرة التصوير رقيقة جدا. وعوامل أخرى تعتمد على استقرار النظام المجهر ، وخصوصا مرحلة الإسكان وغرفة التصوير. ويمكن استخدام التباين القائم على التركيز إذا كان الفاصل الزمني أطوال الصورة هي كافية لاستيعاب هذه الميزة. خيارات أخرى تشمل شراء القريب من الأشعة تحت الحمراء نظام يستند إلى التركيز الذي يوفر موثوقة التعديلات التركيز في الوقت الحقيقي. يمكنك أن تجد هذه العروض من نيكون وأوليمبوس وASI.

المادة 5 : التحليل qFSM

هو لم يناقش هذا القسم بالتفصيل ، ولكن يمكن العثور على معلومات عن برامج التحليل هنا [5]. ويمكن تقديم طلبات تنزيل البرامج على موقعنا (lccb.scripps.edu).

الموضوعات التي يتم تناولها :

• الضوضاء المعايرة
• كشف رقطة
• تتبع باستخدام نهج هجين من تتبع الارتباط القائم على صورة الحركة الخشنة لطخة المناطق واحدة تتبع لحركة الجسيمات مفصلة الرقطة الفردية.
• حساب التجميع البوليمر ومعدلات التفكيك من شدة التقلبات خلال رقطة المظهر وأحداث الاختفاء.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

عدة عوامل رئيسية هي حاسمة لنجاح رقطة الحصول على الصور ، الرقطة جيدة ولكن تبدأ وتنتهي مع نوعية أكتين الخاص fluorescently المسمى. وهناك نسبة عالية من العلامات صبغ لمونومر أكتين ، بتعيين حوالي 0،4-0،7 ضمان الرقطة ستظهر مشرق ومنفصلة ، في حين أن البروتين المسمى ذاتها ينبغي أن تكون...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials