العزلة وتوقعات بنمو كبير من الكبار الإنسان خلايا غشائي السلف تشكيل مستعمرة

Summary

الخلايا البطانية التي تشكل مستعمرة السلف (ECFCs) هي أداة واعدة لدراسة التوازن الأوعية الدموية والإصلاح. ^1،2 هذه الورقة بتقديم رواية الحيوان مصل طريقة مجانية للعزلة وتوسيع ECFC من الدم البشري heparinised الكبار الطرفية مع تجمع الصفيحات lysate الإنسان (pHPL) يقلل من مخاطر الألغام المضادة للالبقري التحصين.

Abstract

هذه الورقة بتقديم استراتيجية جديدة لإنعاش الخلايا البطانية السلف تشكيل مستعمرة (ECFCs) من heparinized لكن unmanipulated خلاف الكبار الدم المحيطي الإنسان داخل وسيلة من 12 يوما. ويمكن توسيع نطاق واسع بعد أن حصلت> 1x10 ⁸ ECFCs لاجراء مزيد من الاختبارات. مفيد يمكن باستخدام pHPL استبعاد الاتصال بالخلايا البشرية مع مستضدات المصل البقري. ويمكن من خلال التدفق الخلوي والمناعية تتسم الخلايا المعزولة كما ECFC ويمكن اختبارها في المختبر لتشكيل وظائف الأوعية الدموية مثل الهياكل في مقايسة matrigel. ويمكن كذلك أن تكون هذه الخلايا حقن تحت الجلد في نموذج الفأر لتشكيل وظيفية ، perfused السفن في الجسم الحي. بعد التوسع والانتشار على المدى الطويل الحفظ بالتبريد والوظيفة والاستقرار الجيني يبدو أن الحفاظ عليها. ^3،4

هذه العزلة من البروتين الحيواني الحر والأسلوب توسيع ينطبق بسهولة على توليد كمية كبيرة من ECFCs.

Protocol

A.) ECFC ISOLATON

DAY 1 :

1. قبل أن تبدأ مع التجربة تحضير مستنبت نمو الخلايا غشائي متوسطة 2 (EGM - 2). تكملة غشائي بصل متوسطة 500ml - 2 مع الهيبارين (1ml يو 1000 / مل) ، والحل 100X 5ml من البنسلين / الستربتوميسين (جميع سيغما ، وسانت لويس ، MO ؛ www.sigmaaldrich.com ) ، L - الجلوتامين (2 ملي التركيز النهائي ) ، و 50 مل تجمع الصفيحات lysate الإنسان (pHPL). ثم يضاف 0.2 مل هيدروكورتيزون ، 2 مل hFGF - B ، 0.5 مل VEGF ، 0.5 مل EGF ، 0.5 مل IGF - 1 و 0.5 مل حمض الاسكوربيك (على النحو المنصوص عليه SingleQuots ، كل Lonza ، Walkersville ، MD ؛ http://www.lonzabioscience. كوم / ). رشاحة العقيمة والمتوسطة من خلال مسام - 0.2 م تصفية حجم 500 مل الفراغ ميليبور. منذ pHPL أشكال الجلطات الصغيرة قد تحتاج لأحد عاملي المتوسط. دافئ قبل تصفيتها EGM - 2 إلى 37 درجة مئوية في حمام مائي
2. جمع عينات الدم عن طريق الرسم 5 مل من الدم المحيطي الكبار الإنسان من الوريد المرفقي في حافظة مجانا 6ml هيبارين الصوديوم في الدم أنبوب vacutainer. يجب معالجة عينات الدم خلال مدة أقصاها ساعتين.
3. البدء بإعداد one 75 سم ² (T75 ؛ Costar) مع غطاء القارورة تنفيس ، واحدة ماصة 25 مل واثنين من 5 مل ماصات في تدفق الصفحي مقاعد البدلاء.
4. قبل ملء 15 مل قبل تحسنت تستكمل EGM - 2 في قارورة مع ماصة 25 مل. الآن فتح قنينة دم وعينة كل 5 مل مع ماصة 5 مل في القارورة. شطف قنينة دم فارغة مع 5 مل من الجمعية العمومية غير العادية إضافية 2 - second مع ماصة 5 مل. الحجم الكلي داخل T75 هو 25 مل. إغلاق سقف تنفيس ، القارورة وضعها في حاضنة في 37 درجة مئوية ، 5 ٪ CO ₂ و الرطوبة 95 ٪ لمدة 24 ساعة.

يوم 2 :

1. بعد حوالي 24 ساعة (أكثر من ليلة) يجب إزالة الخليط المتوسطة الدم للتخلص من الخلايا غير ملتصقة. لهذا ماصات تحضير 25 مل وثلاثة two ماصات 5 مل في تدفق الصفحي ، قبل دافئ 20 مل من استكمال EGM - 2 (المعد في اليوم السابق) و 30 الى 37 مل PBS درجة مئوية في حمام مائي.
2. إزالة القارورة مع عينة من الحاضنة وإزالة كافة طاف مع ماصة 25 مل. الحرص على عدم خدش السطح القارورة لتجنب إتلاف أي مستعمرة محتملة. غسل القارورة الداخلية سطح الخلية الانضمام ثلاث مرات وذلك بإضافة 10 مل بلطف من قبل تحسنت قارورة برنامج تلفزيوني وتميل من جانب واحد على الآخر. إزالة برنامج تلفزيوني على الفور في كل مرة وتجاهل.
3. إضافة 20 مل من EGM - 2 قبل تحسنت جديدة لالقارورة ووضعه مرة أخرى في الحاضنة. يجب أن يتم تنفيذ هذه العملية بأسرع وقت ممكن ورقيقة للخلايا يعلق على عدم فصل. ECFCs فصل بسهولة إذا جرى الاحتفاظ به في برنامج تلفزيوني أو في درجة حرارة الغرفة للفترة طويلة.
4. من خلال الشاشة القارورة بشكل منتظم كل يوم الثاني على التوالي بدءا من اليوم الثاني باستخدام التكبير المنخفض للمجهر الضوء يبحث عن ثمرة ECFC. عندما يتم العثور على مستعمرة علامة على أعلى في الجانب الخارجي من القارورة يدل على موقف للمستعمرة. علما بأن flaks لا ينبغي أن يكون خارج الحاضنة لأكثر من 5 دقائق.

اليوم 5 :

1. في اليوم الخامس بعد البذر إجراء تغيير كامل المتوسطة لإزالة الخلايا غير ملتصقة. لهذا الغرض قبل دافئ 20 مل من EGM - 2 إلى 37 درجة مئوية في حمام مائي وإعداد كل منهما 25 ماصات مل.
2. إزالة كاملة المتوسطة باستخدام ماصة 25 مل وإضافة جديدة ، قبل تحسنت EGM - 2 تستكمل في أقرب وقت ممكن. لا ينبغي أن تترك الخلايا دون المتوسط ​​لأكثر من دقيقة واحدة لتجنب الجفاف. المكان مرة أخرى في حاضنة وتكرار فحص القارورة اليومية.
3. تغذية الخلايا عن طريق استبدال 30 ٪ من المتوسط ​​عن طريق جديدة تستكمل مرتين أسبوعيا EGM - 2.

اليوم 14-28 :

1. وينبغي أن المستعمرات النموذجية مع التشكل المرصوفة بالحجارة تظهر حول يوم 12. بمناسبة رأس الجانب الخارجي من القارورة تشير إلى موقف كل مستعمرة. السماح للمستعمرات أن ينمو حتى 28 يوم واحد ما لم تبدأ الخلايا لفصل. مرة واحدة ، وقد تم تحديد المستعمرات الأولية يمكن حصادها بين أيام 14 و 28 ، اعتمادا على حجمها.

باء) ECFC HARVEST

1. دافئ قبل 5 مل التربسين 0.05 ٪ / EDTA ، 20 مل برنامج تلفزيوني و5ml جديدة تستكمل EGM - 2.
2. إزالة متوسطة من قارورة في أنبوب فالكون (الحرص على عدم لمس سطح القارورة لتجنب إتلاف أي مستعمرة المحتملين) وغسل خلايا بعناية مع 10 مل PBS محمى.
3. إضافة 5 مل التربسين / EDTA واحتضان لمدة 5 دقائق في الحاضنة. لا ينبغي أن الخلايا تكون معرضة لالتربسين لأكثر من 7 دقائق منذ أن تصبح سامة. التنصت بدقة جوانب القارورة يساعد الخلايا لفصل. إخماد نشاط الأنزيم البروتيني التربسين بإضافة حوالي 10 مل من الحفاظ على الثقافة المتوسطة المستخدمة.
4. إزالة التعليق الخلية الى 50 مل فالكون الأنبوب. غسل القارورة مرة واحدة مع 10 مل PBS التي تضاف بعد ذلك إلى تعليق خلية المقطوع. تعليق الطرد المركزي في الخلية 300 غرام لمدة 7 دقائق في 4 درجات مئوية لجمع وإزالة الخلايا التربسين. تجاهل وطاف resuspend الكرية الخلية على الفور في برنامج تلفزيوني 1 مل. تبقي على الجليد.
5. تحديد عدد الخلايا كما هو موضح في بروتوكول إن الرب ريكاردو وPhelani ر ك ⁵

جيم) ECFC توسع

1. تكملة 500 مل EGM - 2 كما هو موضح في و1.1). قبل الدافئة إلى 37 درجة مئوية في حمام مائي.
2. لمساحة نحو 2500 سم ² الثقافة بإعداد إما 11 T220 (225 سم ²⁾ أو 15 T175 (175 سم ²⁾ أو مصنع واحد من أربع طبقات الخلية (CF - 4 ؛ نونك ، نابرفيل ، IL ؛ http://www.nuncbrand . com ). بالإضافة إلى ذلك ، تحتاج إلى جزأين الطازجة تنفيس مباراة دولية وخاصة قمع العقيمة في تدفق الصفحي مقاعد البدلاء.
3. لECFCs البذور في مناطق ذات كثافة الخلية بدءا من 100 ج / سم ² حساب عدد الخلايا غير الضرورية. واحد ومعلق CF - 4 252800 الخلايا في 500 مل الطازجة 2 - EGM وتدفقوا على CF - 4 باستخدام القمع العقيمة. إغلاق أحد المخارج مع كاب تنفيس وإمالة CF - 4 الجانب خط الطول واحد ، مما يتيح توزيعا متساويا في المتوسط ​​بين كل 4 دقيق. إمالة ثم يعود للغرفة وفتح غطاء كاب تنفيس. مكان CF - 4 في الحاضنة.
4. تغيير 20 ٪ من المتوسط ​​في الأسبوع على الأقل مرة واحدة حتى CF - 4 متموجة.
5. حصاد الخلايا كما هو موضح في باء) باستخدام 70 مل من التربسين / EDTA وحوالي 200 مل PBS.

الممثل النتائج

استخدام هذا الأسلوب لاحظنا العزلة تشكيل مستعمرة الابتدائية في اليوم 12. في دراسة سابقة كانت قادرة على استرداد يعني من 4.0 ± 0،8 ECFC - المستعمرات المستمدة من كل مل من الدم المحيطي. أظهرت ⁴ ECFCs نموذجي مظهر المرصوفة بالحجارة. بعد توسيع نطاق واسع ، مع كثافة البذر من 100 خلية / سم ² ، حصلنا على> 1 × 10 ⁸ خلايا في ما مجموعه 30 يوما تقريبا من الذكور و 1 3 المتطوعات (العمر بين 26 و 50 عاما).

عرضت ECFC المثقف في ظل هذه الظروف أن يكون التكاثري والفنية ومستقرة genomically ، ويمكن تخزينها ⁴ خلايا وعلاوة على ذلك (10 ٪ في DMSO) في النيتروجين السائل للاستخدام. ^3،4

Discussion

هذه العزلة رواية وطريقة توسيع عملية بسيطة وفعالة تكون أكثر كفاءة وأقل استهلاكا للوقت من خلال تجنب أي فصل الخلية (أي التدرج الكثافة المطلوبة) ، وأقل كلفة من التقنيات التقليدية. باستخدام اتصال pHPL لمستضدات الأبقار وxenoimmunization اللاحقة المفترضة هي مستبعدة. خلال الفترة من ا...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Endothelial basal Medium-2	Lonza Inc.		500ml
EGM-2 SingleQuots	Lonza Inc.		EGF, hFGF-B, VEGF, IGF-1, Hydrocortisone, ascorbic acid
preservative-free Heparin	Biochrom AG		10U/ml per EGM-2
L-Glutamine	Sigma-Aldrich		2mM per EGM-2
Penicillin and Streptomycin	Sigma-Aldrich		100U/mL Penicillin and 100μg/mL Streptomycin per EGM-2
Trypsin/1mM EDTA	Invitrogen		7ml for T75 flask 70ml for CF-4
PBS
Four-layered cell factory (CF-4)	Corning
Sterile Funnel	Corning
T75cm2 culture flask (with vented cap)	Corning
6 mL vacutainer tubes (preservative-free sodium heparin)	BD Biosciences		preloaded with 108 IU/6ml of preservative-free sodium heparin
50ml Falcon tubes	Falcon BD
5ml Stripetts	Costar
25ml Stripetts	Costar
Squeezer	Costar
0,2 pore size sterile filter	EMD Millipore		2x 500ml per EGM-2