تجميد والذوبان الخلايا الجذعية الجنينية البشرية

Summary

منذ جيمس طومسون وآخرون تطوير تقنية في عام 1998 لعزل وتنمو HES في الثقافة ، وتصبح خلايا لاستخدامها لاحقا تجميد والذوبان ، وتوسيع الخلايا من الأوراق المالية المجمدة الاجراءات الهامة التي أجريت في خلية ثقافة HES الروتينية. منذ HES خلايا حساسة للغاية لتؤكد للتجميد والذوبان ، يجب توخي الحذر خاصة. نحن هنا لشرح الطريقة المناسبة لإذابة الخلايا بسرعة HES من المخزونات النيتروجين السائل ، والطلاء لهم على الخلايا الجنينية الماوس المغذية ، وتجميد ببطء لهم على المدى الطويل التخزين.

Abstract

منذ جيمس طومسون

Protocol

1. ذوبان الخلايا HES

قبل انشاء التجريبية

1. قبل يوم واحد لخلايا HES ذوبان الجليد ، لوحة طبقة من الخلايا الليفية التغذية الماوس الجنينية المشع (MEF) ، CF1 سلالة ، وكذلك على واحد من الجيلاتين المغلفة جيدا 6 - نسيج لوحة الثقافة في مستنبت MEF (D MEM المتوسطة تستكمل مع القاعدية 10 ٪ الحرارة المعطل FBS و 1 ٪ غير الأحماض الأمينية الأساسية). يحضن بين عشية وضحاها على 37 درجة مئوية و 5 ٪ CO _2.
2. قبل إزالة الخلايا HES من النتروجين السائل ، يجب التأكد من أن جميع المعدات اللازمة والكواشف في مكان وعلى استعداد لاستخدامها لضمان وجود تحسن كفاءة ونجاحا.

ذوبان للخلايا HES

3. إزالة القارورة المبردة من الخلايا HES من خزان النتروجين السائل التخزين باستخدام الملقط المعدني.
4. لفة القارورة بين يدي القفاز لمدة 3-5 ثانية لإزالة الصقيع.
5. تسجيل المعلومات على التسمية من القارورة.
6. باستخدام الملقط المعدني ، اغمس القارورة في حمام ماء C ° 37. دوامة القارورة بلطف ومراقبة التقدم المحرز في ذوبان الجليد في كثير من الأحيان (ولكن بسرعة!) من خلال عقد القارورة إلى الضوء لمعرفة حجم الكريستال الجليد. لا تغمره غطاء قنينة من الماء في الحمام لأن ذلك قد يلوث الخلايا.
7. فقط عندما بلورة الجليد الصغيرة لا تزال ، يغرق القنينة بأكملها في الايثانول لتعقيم.
8. في خزانة السلامة البيولوجية العقيمة ، ونقل محتويات القارورة المبردة مباشرة إلى أسفل أنبوب مخروطي 15 مل.
9. إضافة ببطء 4 مل من خلية HES مستنبت (D-MEM/F-12 المتوسطة القاعدية تستكمل مع خروج المغلوب استبدال 20 ٪ المصل ، 1 ٪ غير الأحماض الأمينية الأساسية ، 1 ٪ L - الجلوتامين ، 0.2 ٪ β - المركابتويثانول و 4 نانوغرام / bFGF مل) في أنبوب. بلطف لمزج موسيقى الروك باستمرار الخلايا كما يتم إضافة هذه الوسيلة الجديدة للأنبوب.
10. الطرد المركزي الخلايا لمدة 5 دقائق في غرام × 200

طلاء للخلايا HES

11. في حين أن خلايا HES في جهاز الطرد المركزي ، وإعداد لوحة العلامات التي المغذية MEF مع المعلومات المناسبة الخلية HES : خط الخلية ، ورقم المرور ، وتاريخ ذوبان الجليد.
12. عندما يكون هناك ما يقرب من 2 دقائق من انتهاء الوقت على زيادة ونقصان ، ونضح مستنبت MEF وإضافة 1.0 مل من برنامج تلفزيوني إلى البئر.
13. تقديم مكعبات الخلايا HES يعود الى مجلس الوزراء السلامة البيولوجية ، ونضح بعناية طاف. يجب الحرص على عدم نضح الخلية بيليه ، ولكن كما طاف إزالة أكبر قدر ممكن ، وهذا الحل يتضمن DMSO المتوسطة من التجمد.
14. إعادة تعليق بيليه بلطف جدا عن طريق إضافة 2.5 مل من خلية HES مستنبت زجاجي باستخدام الماصة 5 مل وpipetting 3-4 مرات.
15. نضح في برنامج تلفزيوني من وحدة التغذية MEF جيدا وإضافة ببطء كل ​​مل 2.5 من نظام التعليق الخلية HES للاستعداد جيدا لوحة 6 - جيدا.
16. وضع لوحة في الحاضنة 37 درجة مئوية والشريحة بعناية لوحة الأمام إلى الخلف ، وجنبا إلى جنب لتوزيعها بالتساوي على الخلايا في جميع أنحاء البئر. دوامة لا لوحة في نمط دائري لتجنب التركيز على المستعمرات في المركز.
17. السماح للخلايا لنعلق على 37 درجة مئوية و 5 ٪ CO ₂ بين عشية وضحاها.
18. بعد يوم من ذوبان الجليد ، وإزالة المتوسطة (مع أية خلايا التعويم) وإضافة 2.5 مل من خلية جديدة HES مستنبت إلى البئر.
19. اختياري : يمكن نقل المتوسطة وإزالة الخلايا لوحة منفصلة أعدت MEF المغذية. هذه الخطوة بإنشاء مستعمرات جديدة في كثير من الأحيان يمكن أن يكون المثقف بالتوازي مع الخلايا من ذوبان الجليد الأصلي.
20. احتضان لوحات عند 37 درجة مئوية و 5 ٪ CO ₂ بين عشية وضحاها.

2. تجميد خلايا HES

1. في حين أن خلايا HES هي في أجهزة الطرد المركزي ، تسمية قارورة المبردة داخل مجلس الوزراء السلامة البيولوجية ، بما في ذلك خط الخلية ، ورقم المرور ، وتاريخ التجميد. كثافة نموذجي للخلايا HES تجميد هي واحدة من الخلايا بشكل جيد (من لوحة 6 أيضا) في القارورة المبردة.
2. عندما يتم الانتهاء من الخلايا HES الطرد المركزي ، ليصبح أنابيب العودة الى مجلس الوزراء السلامة البيولوجية. وطاف نضح من الأنبوب ، والحرص على عدم تعكير صفو فضفاضة معبأة الخلية بيليه.
3. Resuspend بيليه في الخلية التي تحتوي على كمية مناسبة من خلية HES مستنبت : 0.5 مل الخلية HES مستنبت في القارورة المبردة. أن يكون لطيف للغاية عندما pipetting ، والخلايا على نحو أفضل عندما HES استرداد القطع المجمدة في مستعمرة كبيرة نسبيا.
4. ببطء ، في حين تهز برفق الأنبوب ، إضافة إلى مبلغ مناسب (0.5 مل لكل cryovial) من الخلية 2X HES تجميد المتوسطة (60 ٪ FBS محددة ، و 20 ٪ ثقافة الخلية HES المتوسطة ، و 20 ٪ DMSO) إلى الخلايا. بمجرد إضافة المتوسطة التجميد ، الماصة الحل بلطف بالغ 1-2 مرات لالمزيج.
5. بسرعة ولكن بلطف ، إضافة 1 مل من خلية إلى تعليق كل قارورة المبردة.
6. نقل قوارير في وعاء تجميد الأيزوبروبانول ووضعه فيa المجمد -80 درجة مئوية خلال الليل. سيتم تجميد الخلايا في 1 درجة مئوية في الدقيقة الواحدة في حاوية تجميد الأيزوبروبانول.
7. في اليوم التالي ، ونقل بسرعة القنينات المجمدة إلى خزان النتروجين السائل التخزين باستخدام الملقط المعدني.

ممثل النتائج

في اليوم الأول بعد إذابة الخلايا ES الإنسان ، قد مستعمرات صغيرة شفافة وتظهر قد يكون من الصعب أن نرى تحت المجهر. منذ خلايا ES إذابة حديثا تميل إلى تتكاثر ببطء ، فإنها قد يستغرق بضعة أيام لتظهر كما أنشأت مستعمرات (الشكل 1).

الشكل 1. وقد التقط الانتعاش والنمو الخلية. إذابة الخلايا HES من النيتروجين السائل 1 و 7 و 11 يوما بعد الذوبان.

Discussion

شريط الفيديو المرافق يوضح طريقة للذوبان وتجميد الخلايا HES. يجب إذابة خلايا مجمدة في النيتروجين السائل حمام بأسرع وقت ممكن للحصول على الانتعاش أفضل وجه ممكن. تذكر أن نكون حذرين للغاية عندما pipetting الخلايا ذوبان : تقليل التعامل مع الخلايا وماصة بلطف. يمكن مطلي قارورة واحدة من الخلايا HES على أي واحد أيضا من لوحة 6 - جيدا ، أو كل من الآبار لوحة 4 - جيدا وعلى الفور وضعت في الحاضنة. منذ زرع في أربع آبار منفصلة يقلل من احتمال فقدان ثقافة كاملة للتلوث ، ويجعل من الاسهل لتحديد موقع الخلية HES المستعمرات على مساحتها أقل ، فمن المستحسن لوحة 4 - جيدا عندما يذوب الخلايا HES للمرة الأولى.

اليوم الأول بعد ذوبان الخلايا HES ، مستعمرات صغيرة وربما تكون شفافة. تجديد الثقافة الخلية HES المتوسط ​​كل يوم ، حتى لو كانت المستعمرات ليست واضحة تحت المجهر منذ ان الامر قد يستغرق بضعة أيام في الثقافة لخلايا HES لتظهر كما أنشأت مستعمرات. من المهم أن استخدام التغذية MEF مطلية حديثا طبقة الخلايا عند ذوبان الجليد ، والمستعمرات في كثير من الأحيان لا تصل إلى حجم مناسب لالركض حتى يوم 12 10 بعد ذوبان الجليد.

عندما يذوب قارورة مرور منخفض من خلايا HES ، ومن الممارسات الجيدة لتوسيع وتجميد قارورة إضافية للحفاظ على المخزون من الخلايا مرور منخفض للثقافة والتجارب في المستقبل. كما أنها فكرة جيدة لتجميد جميع صحي روتيني "إضافية" للحفاظ على خلايا HES الأسهم المجمدة. وقد جمدت يذوب أنجح والثقافات اللاحقة كما عالية الجودة ، وغير متمايزة ، وتقسيم المستعمرات بنشاط الخلية HES. خلايا HES التعافي من تجميد أكثر فعالية إذا ما تم تناوله برفق والمجاميع الكبيرة الخلية. يجب أن يكون حجم الكلي النهائي ستكون مماثلة (أو أكبر قليلا من) حجم الركام مطلي بعد مرور روتينية.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
D-MEM	Invitrogen	11965-092	For MEF mediumjavascript:void(0);
Fetal Bovine Serum (FBS), Certified	Invitrogen	16000-044	Heat-inactivated For MEF medium
D-MEM/F-12	Invitrogen	11330-057
Knockout Serum Replacement	Invitrogen	10828-028	Pre-screen to ensure support of hES cells
bFGF	Stemgent	03-0002	Use at [4 ng/mL] final
Non-essential Amino Acids	Invitrogen	11140-050
L-glutamine	Invitrogen	25030-081	200 mM (100X) Use at [1X] final
PBS	Invitrogen	14190-250	Without Ca2+ or Mg2+
Collagenase IV	Invitrogen	17104-019	Make a fresh solution at 1 mg/mL in D-MEM/F-12
Gelatin	Sigma-Aldrich	G1890	Type A, Porcine
DMSO	Sigma-Aldrich	D2560	For freezing medium
Fetal Bovine Serum (FBS), Defined	Hyclone	SH300.70.01	For freezing medium
6-well plates	Nalge Nunc international	140675	For general culture
4-well plates	Nalge Nunc international	176740	For thawing
5 mL glass pipettes	Fisher Scientific	13-678-27E	Individually wrapped
15 mL conical tubes	Corning	430052	Polypropylene
Cryogenic vials	Nalge Nunc international	5000-1020	1.5 mL capacity
Freezing container	Nalge Nunc international	5100-0001	Mr. Frosty”