JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Protocol
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

مصير replisome عقب اصطدامها وجها لوجه بوليميريز الحمض النووي الريبي (RNAP) غير معروف. نجد أن الأكشاك replisome عند اصطدامها RNAP وجها لوجه ، ولكن بعد استئناف استطالة تهجير RNAP من الحمض النووي. MFD يعزز إعادة تشغيل النسخ المتماثل من خلال تسهيل تهجير RNAP بعد الاصطدام.

Abstract

في الجسم الحي تشير الدراسات إلى أن يتم القبض على الشوك بسبب تكرار اللقاءات وجها لوجه مع المجمعات النسخ. ومع ذلك ، فإن مصير replisome وبوليميريز الحمض النووي الريبي (RNAP) عقب اصطدام وجها لوجه غير معروف. هنا ، نجد أن هاء القولونية الأكشاك replisome عند اصطدامها وجها لوجه النسخ المعقدة ، ولكن بدلا من الانهيار ، تفرع تكرارها لا تزال مستقرة للغاية وتستأنف في نهاية المطاف استطالة بعد تهجير RNAP من الحمض النووي. ونجد أيضا أن عامل اقتران النسخ لاصلاح ، MFD ، ويشجع على إعادة تشغيل المباشر للمفترق عقب الاصطدام عن طريق تسهيل تهجير RNAP. تؤكد هذه النتائج على استقرار لا يتجزأ من جهاز النسخ ودورا جديدا لإصلاح المسار ، إلى جانب النسخ المتماثل الماضية في تعزيز كتلة RNAP.

Protocol

وقد استخدم هذا الأسلوب في البحث عنها في بومرانتز وأودونيل ، العلوم 327 ، 590-592 (2010) .

1. أنجز التجمع من مجمع RNAP استطالة توقفت على النحو التالي :

500 نانومتر تركيز النهائي من E. القولونية RNAP σ 70 وكان سعادة مختلطة مع تركيز 5 نانومتر النهائية لbiotinylated 3.6 كيلوبايت تحتوي على الحمض النووي القالب المروج T7A1 في 100 ميكرولتر من العازلة A (20 ملي تريس - CL (الرقم الهيدروجيني 7.5) ، 8 ملم MgCl 2 ، EDTA 0.5 ملم ، 5 ملي DTT ، الجلسرين 10 ٪) لمدة 10 دقيقة عند 37 درجة مئوية. أضيفت من 100 ميكرومتر و 40 ميكرومتر APU كل من GTP ، ATP ، وCTP للحصول على 10 دقيقة إضافية بلغت 37 درجة مئوية.

2. تم تنفيذ تجميد مجمع RNAP استطالة على وقف الخرز streptavidin على النحو التالي :

تم إضافة 200 ميكرولتر من الخرز streptavidin المغلفة المغناطيسي (Invitrogen) للتفاعل أعلاه لمدة 10 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.

3. أجريت تنقية يجمد أوقفت RNAP معقدة استطالة على النحو التالي :

وكانت تغسل حبات (من فوق) 5 مرات مع 0.9 مل من العازلة والتي تحتوي على كلوريد الصوديوم 0.75 م ، و 200 ميكروغرام / مل الهيبارين ، و 20 ميكروغرام / مل ssDNA (تمت إزالة طاف بعد كل خطوة يغسل بواسطة مغناطيس.) التالي ، وكانت تغسل حبات 2 مرات مع 0.9 مل من ألف العازلة

4. تشكيل الشوكة تكرار النسبي المصب في الرأس على RNAP أجريت على النحو التالي :

وكان معلق الخرز (من فوق) في 100 ميكرولتر من جديد Biolabs العازلة انكلترا 4 و 10 وحدات من أنا ساب (نيو إنجلاند Biolabs) وأضيف لمدة 10 دقيقة عند 37 درجة مئوية. وكانت تغسل حبات 3 مرات مع 0.9 مل من المخزن ثم ألف ومعلق في 50 ميكرولتر من الربط السريع T4 العازلة التفاعل (نيو إنجلاند Biolabs). وأضيف 2 ميكرولتر من يغاز T4 السريع (نيو إنجلاند Biolabs) جنبا إلى جنب مع تركيز نانومتر 6 النهائي للصلب قبل متشعب الحمض النووي (RP10 ، RP22 ، RP25) لمدة 10 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. وكانت تغسل حبات 3 مرات مع 0.9 مل من ألف العازلة

5. أنجز التجمع من replisome والشروع في تركيب حبلا عند مفترق الطرق المؤدية تكرارها على النحو التالي :

وقد حضنت بمول 448 من DnaB (كما مسدوس) مع 150 ميكرولتر حبات العازلة A (20 ملي تريس - CL (الرقم الهيدروجيني 7.5) ، 8 ملم MgCl 2 ، 0.5 مم EDTA ، 5 ملم DTT ، الجلسرين 10 ٪) لمدة 30 ثانية في 23 درجة مئوية. أضيفت 4.9 بمول الثالث بول * (بول الثالث سعادة ناقص β) ، و 15 من بمول β ، 2 مم اعبي التنس المحترفين ، و 60 ميكرومتر كل من dGTP وdATP إلى وحدة تخزين من 200 ميكرولتر المحتضنة وأخرى 5 دقائق عند 37 درجة مئوية. بدأ النسخ المتماثل على إضافة 10 و 24 ميكروغرام SSB ميكرومتر كل من dATP dTTP وجنبا إلى جنب مع [α P - 32] وdTTP [α P - 32] dCTP (نشاط معين ، 3،000-5،000 CPM / بمول) إلى الحجم النهائي من 250 ميكرولتر. أنهيت ردود الفعل بعد 10 دقيقة بعد إضافة 12 ميكرولتر من EDTA 500 مم.

6. أجريت تنقية وتركيز الاذاعة المنتجات ذات العلامات الحمض النووي على النحو التالي :

ومغلي حبات (من فوق) بعد إنهاء رد الفعل من أجل إزالة الحمض النووي من الخرز. تمت إزالة أي بقايا الحمض النووي المتبقية التي تعلق على حبات الخرز عن طريق معالجة بروتين مع K في حجم 10 ماي لمدة 30 دقيقة عند 50 درجة مئوية. ومغلي ثم الخرز وأزيل طاف بواسطة مغناطيس. وقد طاف تنقية مجتمعة تحتوي على الحمض النووي باستخدام PCR Qiagen تنظيف الطقم. تنقيته ثم تم تحليل الراديو المنتجات ذات العلامات ال DNA في الجل agarose القلوية.

* تم حذف النسخ المتماثل في غياب 70 وجها لوجه RNAP أوقفت تم تنفيذ مجمع استطالة على النحو الوارد أعلاه ، ومع ذلك ، σ ملف.

ممثل النتائج :

تصادم replisome مع وجها لوجه RNAP النتائج عادة في اثنين من المنتجات من 2.5 و 3.6 كيلو بايت في الطول. المنتج 2.5 كيلوبايت يمثل طول الحمض النووي من مفترق الطرق إلى توقف RNAP والنتائج من replisome توقف عند الاصطدام مع RNAP. المنتج 3.6 كيلوبايت تمثل كامل طول الحمض النووي والنتائج سواء من إشغال كاملة من المروج التي RNAP replisome أو الجزئي من خلال قراءة للRNAP وجها لوجه. نتيجة جيدة أو دقيقة يدل على أن يتم إنتاج حوالي 50 ٪ من كامل طول الحمض النووي. ومع ذلك ، في بعض الحالات أقل من إشغال المروج التي RNAP يحدث ويلاحظ أن نسبة أعلى من كامل طول الحمض النووي منذ زيادة عدد سكان replisomes لا تواجه RNAP وجها لوجه. النسخ المتماثل في حالة عدم وجود نتائج RNAP أوقفت في الحمض النووي كامل طول فقط (3.6 كيلوبايت).

figure-protocol-5162
الرقم. 1 أعاق replisome بواسطة RNAP وجها لوجه.
(أ) الإعداد التجريبية. وهاء عمودط RNAP تم تجميعها أوقفت معقدة استطالة على الحمض النووي الذي يحتوي على مروج biotinylated T7A1 كما هو موضح سابقا (9). لفترة وجيزة ، تم تشكيل مجمع استطالة اوقفت 20 نقطة أساس المصب من المروج التي يحتضنها عميم الإنزيم RNAP biotinylated مع الحمض النووي لمدة 10 دقيقة تليها إضافة APU ، GTP ، ATP ، وCTP عن 10 دقيقة أخرى. تم إضافة الخرز Streptavidin ل10 دقيقة إضافية ثم تم غسلها الخرز خمس مرات مع كل 0.9 مل من العازلة التي تحتوي على كلوريد الصوديوم 0.75M ، 200 الهيبارين مغ / لتر ، و 100 نانومتر واحد حبلا الحمض النووي لإزالة غير مستقر RNAP الدنا والمجمعات NTPs الزائدة . وهضمها ثم الحمض النووي مع SAPI ، وغسلها ، وligated إلى الحمض النووي قبل صلب متشعب. وكانت تغسل حبات مرة أخرى قبل التجمع في replisome. يقع المروج 2.5 كيلوبايت من شوكة والتوجه إلى النسخ المباشر نحو مفترق الطرق (ب) ​​تم ادراج DnaB ثم تم تجميعها replisome وشرع تكرار سواء في وجود (حارة 2) أو غياب (حارة 1) من وجها لوجه RNAP.

Disclosures

غسل معقدة استطالة أوقفت منضمة إلى حبات الملح مع ارتفاع أمر بالغ الأهمية من أجل إزالة أي غير مستقر أو غير محدد جزيئات RNAP ملزمة. RNAP لديه قابلية عالية للغاية بالنسبة التمهيدي - قالب هياكل الحمض النووي النوع. وبالتالي ، فمن الضروري إزالة هذه المنظمات غير محددة RNAP الدنا المجمعات من أجل إجراء النسخ المتماثل من القالب التمهيدي. التركيز على المنتجات ذات العلامات الراديو باستخدام الحمض النووي لتنقية PCR Qiagen طقم أمر بالغ الأهمية أيضا من أجل الحصول على ما يكفي من ارتفاع اشارة المشعة التي يمكن ملاحظتها في هلام.

Acknowledgements

ونحن ممتنون بشكل خاص لDarst سيث لتوفير البروتينات وRNAP MFD وناقلات التعبير. ونحن نشكر أيضا Borukhov سيرجي لتوفير GreB وتشانغ دان للحصول على الدعم الفني. وأيد هذا العمل عن طريق منحة من المعاهد القومية للصحة (وزارة الدفاع) وكذلك من خلال ماري خوسيه كرافيس وهنري زمالة في جامعة روكفلر (RTP).

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
Dynabeads M-270Invitrogen653.05
SapINew England BiolabsR0569S
T4 Quick LigaseNew England BiolabsM2200S
PCR Purification KitQiagen28104

References

  1. Rudolph, C. J., Dhillon, P., Moore, T., Lloyd, R. G. Avoiding and resolving conflicts between DNA replication and transcription. DNA Repair (Amst). 6, 981-98 (2007).
  2. Vilette, D., Ehrlich, S. D., Michel, B. Transcription-induced deletions in plasmid vectors: M13 DNA replication as a source of instability. Mol Gen Genet. 252, 398-398 (1996).
  3. Trautinger, B. W., Jaktaji, R. P., Rusakova, E., Lloyd, R. G. RNA polymerase modulators and DNA repair activities resolve conflicts between DNA replication and transcription. Mol Cell. 19, 247-247 (2005).
  4. McGlynn, P., Lloyd, R. G. Modulation of RNA Polymerase by (p)ppGpp Reveals a RecG-Dependent Mechanism for Replication Fork Progression. Cell. 101, 35-35 (2000).
  5. McGlynn, P., Guy, C. P. Replication forks blocked by protein-DNA complexes have limited stability in vitro. J Mol Biol. 381, 249-249 (2008).
  6. Labib, K., Hodgson, B. Replication fork barriers: pausing for a break or stalling for time. EMBO Rep. 8, 346-346 (2007).
  7. Bidnenko, V., Ehrlich, S. D., Michel, B. Replication fork collapse at replication terminator sequences. Embo J. 21, 3898-3898 (2002).
  8. Pomerantz, R. T., O'Donnell, M. Replisome mechanics: insights into a twin DNA polymerase machine. Trends Microbiol. 15, 156-156 (2007).
  9. Pomerantz, R. T., O'Donnell, M. The replisome uses mRNA as a primer after colliding with RNA polymerase. Nature. 456, 762-762 (2008).
  10. Heller, R. C., Marians, K. J. Replication fork reactivation downstream of a blocked nascent leading strand. Nature. 439, 557-557 (2006).
  11. Yuzhakov, A., Turner, J., O'Donnell, M. Replication fork reactivation downstream of a blocked nascent leading strand. Cell. 86, 557-557 (1996).
  12. Hinkle, D. C., Ring, J., Chamberlin, M. J. Replisome assembly reveals the basis for asymmetric function in leading and lagging strand replication. J Mol Biol. 70, 197-197 (1972).
  13. Kaplan, D. L., O'Donnell, M. Studies of the binding of Escherichia coli RNA polymerase to DNA. V. T7 RNA chain initiation by enzyme-DNA complexes. Mol Cell. 15, 453-453 (2004).
  14. Park, J. S., Marr, M. T., Roberts, J. W. Twin DNA pumps of a hexameric helicase provide power to simultaneously melt two duplexes. Cell. 109, 757-757 (2002).
  15. Hanawalt, P. C., Spivak, G. E. coli Transcription repair coupling factor (Mfd protein) rescues arrested complexes by promoting forward translocation. Nat Rev Mol Cell Biol. 9, 958-958 (2008).
  16. Hanawalt, P. C. Transcription-coupled DNA repair: two decades of progress and surprises. Science. 266, 1957-1957 (1994).
  17. Selby, C. P., Sancar, A. Transcription-coupled repair and human disease. J Biol Chem. 270, 4882-4882 (1995).
  18. Liu, B., Alberts, B. M. Structure and function of transcription-repair coupling factor. I. Structural domains and binding properties. Head-on collision between a DNA replication apparatus and RNA polymerase transcription complex. Science. 267, 1131-1131 (1995).
  19. George, D. L., Witkin, E. M. Slow excision repair in an mfd mutant of Escherichia coli B/r. Mol Gen Genet. 133, 283-283 (1974).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

38 replisome

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved