متجانسة الكشف السريع عن طريق فحوصات البيولوجي المغناطيسي نظام Biosensing التحوير

Summary

ويستخدم نظام مغناطيسي لتعديل biosensing بسرعة ، بحساسية وبساطة كشف المقايسات البيولوجية ، مثل جزيئات الحمض النووي والبروتينات.

Abstract

نظام مغناطيسي biosensing التعديل (MMB) [1،2] بسرعة والكشف عن الأهداف الحيوية بشكل متجانس في تركيزات منخفضة دون أي خطوة الغسيل أو الانفصال. عندما IL - 8 الهدف كان حاضرا ، وهو 'sandwich' المستندة إلى مقايسة المرفقة مع الخرز المغناطيسي IL - 8 القبض على الضد streptavidin بروتين فلوري جانب طريق مستهدفة IL - 8 و IL - 8 biotinylated الأضداد. وناور حبات المغناطيسي في حركة متذبذبة من خلال تطبيق المجال المغناطيسي بالتناوب التدرج من خلال قطبين الكهرومغناطيسي. ومكثف البروتينات الفلورية ، والتي تعلق على حبات المغناطيسي في المنطقة والكشف عن تحركاتهم داخل وخارج لشعاع الليزر متعامد تنتج إشارة الدوري الفلورسنت التي يتم الكشف demodulated باستخدام متزامن. كان يستخدم سابقا biosensing تعديل النظام المغناطيسي للكشف عن تسلسل الترميز للبروتين الفيروس غير الهيكلية ايباراكي 3 (NS3) DNA التكميلية ([كدنا]) [2]. ويمكن استخدام التقنيات التي أثبتت في هذا العمل الخارجي للتلاعب والتكثيف من الجزيئات لتطبيقات أخرى ، مثل تسليم المخدرات ، إلى جانب مغناطيسيا

Protocol

IL - 8 مقايسة :

1. وشملت خليط التفاعل المكونات الأربعة التالية من حيث الحجم النهائي 100 ميكرولتر من مقايسة العازلة في تركيزات كل منهما. 10 ميكروليتر من الخرز المغناطيسي مع الأضداد في التقاط حبات 100 / ميكرولتر تركيزات النهائي ، و 2 ميكرولتر من IL - 8 biotinylated الأضداد في التركيز النهائي nano-gram/μl 1 ، 1 ميكرولتر من بروتين فلوري streptavidin بتركيز 20 nano-gram/μl النهائي ، و 1 ميكرولتر من IL - 8 المستهدف عند 0.48 pico-gram/μl. تضاف المكونات واحدا تلو الآخر إلى المخزن المؤقت مقايسة واهتزت لمدة 30 دقيقة ثم.
2. ويتم إعداد رد فعل السيطرة على نفس الطريق دون أن يكون الهدف IL - 8.
3. يتم وضعها في وقت لاحق من دون أي ردود فعل الانفصال أو خطوة الغسيل في cuvettes وتفتيشها باستخدام نظام MMB.

MMB النظام :

1. ضع كفيت في موقفه بين القطبين الكهرومغناطيسي.
2. العمل الحالي التشكيل وانتظر 30 ثانية للسماح التجميع والتكثيف من الخرز
3. قياس إشارة القفل في مكبر للصوت باستخدام الذبذبات.

ممثل النتائج :

قدم الفحص البصري من الخرز المجمعة فرق واضح بين التفاعل مع الهدف والتفاعل من دون هدف. في ردود الفعل على كل شيء مع هذا الهدف ، شكلت الخرز واحد ، التجميعية الكثيفة التي انتقلت من وإلى شعاع الليزر بطريقة توحد. ومع ذلك ، في رد فعل كل ذلك من دون هدف ، كانت حبات أقل مجمعة وحركتهم كان أقل توحيد (انظر الشكل 1).

الشكل 1 : التفتيش البصري المناعية الساندويتش "(أ) دون هدف IL - 8 (ب) والهدف IL - 8.

وتعرض على مدار الساعة التشكيل قطب (الصفراء) وإشارة الناتج PMT (أرجواني) ، في حين كشف 0.48 بيكو غرام IL - 8 المستهدفة في الشكل 1 (أ). تردد التحوير لكل قطب هو في 2 هرتز. لكن ، وكما كان متوقعا من الناحية النظرية ، عند حبات تمرير شعاع ليزر ، ويكشف PMT ضوء الفلورسنت وهناك قمة في انتاج التيار الكهربائي PMT. لذلك ، تردد هو الإستخلاص في 4 هرتز. عندما يتم تغذية إشارة PMT وعلى مدار الساعة ، تضاعف التعديل (في 4 هرتز) للقفل في مكبر للصوت ، في مرحلة حساسة للكشف عن بالكشف عن التزامن والنتائج مع الجهد العالي (انظر الشكل 2).

الشكل 2 : (أ) على مدار الساعة التشكيل (الأصفر) ، وإشارة PMT (أرجواني) عند الكشف 0.48 بيكو غرام IL - 8 المستهدفة. (ب) وتأمين التيار الكهربائي أدى إلى مكبر للصوت على اثنين من يمسح مختلفة.

لم القفل في مكبر للصوت لا يكشف عن أي إشارة عندما تم اختبار عينة السيطرة. هذه الحقيقة ، جنبا إلى جنب مع الفرق البصرية في التجميع تشير إلى أن نظام MMB يمكن تحديد واضح لوجود IL - 8 المستهدفة.

Discussion

باختصار ، لقد أظهرنا أنه يمكن استخدام هذا النظام MMB للكشف عن وجود IL - 8 هدف في تركيزات منخفضة (0.5 بيكو غرام هو الحد من الكشف عن فحوصات دقيقة بيو برو خلوى الصفيف [3،4]). لا يقتصر على قدرة النظام على IL - 8 ، ويمكن استخدامها للكشف عن البروتينات الأخرى. مزايا نظام MMB هي القدرة على ?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Bio-Plex Pro Human Cytokine IL-8 set	Bio-Rad	171-B5008M
Recombinant human IL-8 target	Thermo Fisher Scientific, Inc.	R202625
Biotinylated monoclonal mouse anti human IL-8 antibody G265-8	BD Biosciences	554718
Streptavidin coupled fluorescent protein	Bio-Rad	Streptavidin PE