تصور الخلية إلى خلية نقل فيروس نقص المناعة البشرية باستخدام النسخ نيون فيروس نقص المناعة البشرية ومتحد البؤر المجهري لايف

Summary

تصور هذه التجربة هو بمثابة دليل لاستخدام استنساخ الفلورسنت لفيروس نقص المناعة الجزيئية للعيش تجارب التصوير مبائر.

Abstract

التفجير بواسطة بروتين الفلورية الخضراء للبروتينات المفضلة لديهم ، وعلماء الأحياء والآن لدينا القدرة على دراسة العمليات الخلوية الحية معقدة باستخدام المجهر مضان الفيديو. لتتبع تحركات بروتين فيروس نقص المناعة البشرية الأساسية خلال خلية الى خلية من انتقال فيروس نقص المناعة البشرية ، لدينا GFP الموسومة البروتين الكمامة في سياق استنساخ الجزيئية المعدية فيروس نقص المناعة البشرية ، ودعا فيروس نقص المناعة البشرية الكمامة - iGFP. ندرس هذا استنساخ الفيروسية باستخدام المجهر مبائر الفيديو. في التجربة التالية تصور ، ونحن transfect خلية T الإنسان تمشيا مع فيروس نقص المناعة البشرية ، iGFP الكمامة ، ونحن نستخدم CD4 المعافين fluorescently المسمى + الخلايا التائية لتكون بمثابة الخلايا المستهدفة للفيروس. استخدام تسميات مختلفة الفلورسنت يمكننا بسهولة تتبع الإنتاج الفيروسية وهياكل النقل عبر نقاط الاشتباك العصبي بين الخلايا يسمى الفيروسية. بسيطة غرف الغاز نفاذية التصوير يسمح لنا أن نلاحظ المشابك مع مبائر المجهري المباشر من دقائق إلى أيام. ويمكن استخدام هذه الأساليب لتتبع البروتينات الفيروسية لأنها تتحرك في خلية واحدة من لالمقبل.

Protocol

وقد استخدم هذا الأسلوب في البحث عنها في هوبنر آخرون العلوم 323 : 1743-1747 (2009) .

1. نظرة عامة

ووصف في الأصل من خلية إلى خلية انتشار فيروس نقص المناعة البشرية باستخدام الخلايا المصابة بفيروس نقص المناعة البشرية Jurkat كخلايا المانحة وCD4 + الخلايا اللمفية تي الأولية كخلايا متقبل ^1،2،3. في هذه الدراسات ، تم الكشف عن الفيروس في خلايا محددة باستخدام تلوين الأجسام المضادة. لتتبع نقل الفيروس من خلية إلى خلية في الخلايا الحية ، ونحن استغلال والمعدية المؤتلف استنساخ الجزيئية للفيروس يسمى فيروس نقص المناعة البشرية الكمامة iGFP - ^4. أنها تحمل بروتين الفلورية الخضراء (GFP) إدراج داخليا في البروتين الكمامة بين المجالات الماجستير وكاليفورنيا. هذا استنساخ الجزيئي للعدوى بفيروس نقص المناعة البشرية يحتفظ دون الحاجة لفيروس المساعد. يتم تحميل stoichiometrically جزيئات الفيروس مصنوعة من استنساخ مع هذا البروتين الفلوري الأخضر ، وتوفير إشارة قوية لرصد مضان التجمع الفيروسية ونقلها بين الخلايا. عندما تستخدم بالاقتران مع خلايا خاملة تتبع الأصباغ الفلورية ، ويمكن تمييز الخلايا من خلايا المتلقي المانحة المدخلات ، والسماح لتصور واحد لنقل الفيروس من خلية مصابة إلى تي تي خلية مصابة ^5. ويمكن عندئذ تشكيل المشبك الفيروسية ونقل الفيروس من خلية واحدة إلى أخرى يتعين مراعاتها في الخلايا الحية في حين أنها في تربيتها مختومة ، وغرفة التصوير الغاز قابلة للاختراق.

(يوم 1)

2. Transfected إعداد فيروس نقص المناعة البشرية الكمامة - iGFP Jurkat خلايا T

1. إعداد CD4 الإنسان + T خط خلوي Jurkat (آي تي سي سي ، ماناساس ، VA) من خلال الحفاظ على بعناية الخلايا بتركيز يتراوح بين 2 × 10 ⁵ و 8 × 10 ⁵ خلية / مليلتر في Jurkat ثقافة الإعلام (RPMI 1640 ، 10 ٪ مصل بقري جنيني ، 100 وحدة / مل البنسلين ، و 100 الستربتوميسين ميكروغرام / مل). مفتاح النجاح : سوف ثقافة الخلايا Jurkat بتركيزات تزيد على 8 × ⁵ 10 خلايا / مل نتيجة انخفاض في كفاءة ترنسفكأيشن.
   
   ملاحظة : ترنسفكأيشن من الحمض النووي الكمامة - iGFP proviral فيروس نقص المناعة البشرية إلى خلايا تي ، على النحو المبين أدناه ، والنتائج في إنتاج فيروس النسخ المتماثل ، المختصة نقص المناعة البشرية. على هذا النحو ، وجميع الإجراءات التي يتعين الاضطلاع بها إلا من خلال تدريب العاملين في المختبرات المعتمدة في مستوى السلامة الحيوية 2 + أو زراعة الأنسجة مستوى السلامة الحيوية 3 (BL2 + / BL3) غرفة. يجب الموافقة على العمل مع فيروس نقص المناعة البشرية المعدية في مراكز التصوير الخاصة بك عن طريق المكاتب المحلية للسلامة الأحيائية المؤسسية.
2. Transfect في Jurkats مع البلازميد الفيروسي ، وفيروس iGFP - الكمامة باستخدام الأسلوب nucleofection Amaxa (Lonza ، Walkersville ، دكتوراه في الطب). بيليه 5 × 10 ⁶ الخلايا بواسطة الطرد المركزي لمدة 10 دقيقة عند 150 س ز. مخزنة نضح طاف وغسل الخلايا في الفوسفات العقيمة المالحة (PBS). الطرد المركزي الخلايا وresuspend الكرية إلى 97 ميكرولتر من قبل تدفئته ، والخامس حل nucleofector تحتوي على استكمال الشركة الصانعة. إضافة ثلاثة ميكرولتر من الذيفان الداخلي مجانا فيروس نقص المناعة البشرية الكمامة - iGFP البلازميد (1 ميكروغرام / ميكرولتر) الى تعليق الخلية والمزيج بلطف. نقل إلى خلية تعليق كفيت وnucleofect باستخدام برنامج S - 18. على الفور نقل الخلايا إلى 3 مل من وسائل الاعلام prewarmed الثقافة Jurkat بدون المضادات الحيوية.
3. لإعداد CD4 + الخلايا المستهدفة لنقاط الاشتباك العصبي الفيروسي ، ونحن الحصول على خلايا الدم المحيطية وحيدات النوى من المعاطف الشهباء باستخدام معيار Ficoll - Paque (GE للرعاية الصحية ، أوبسالا ، السويد) البروتوكول. ثم يتم خلايا CD4 + T مختارة سلبا باستخدام مواد العزل المغناطيسي حبة (Miltenyi بيوتيك ، صحراء ، كاليفورنيا). قد تكون هذه تخزين بالتبريد في N2 السائل في aliquots من 5 × ⁶ ميكرولتر cells/500 10 من وسائل الاعلام تجميد (90 ٪ الجنين البقري DMSO serum/10 ٪). تستزرع CD4 + الابتدائية إذابة الخلايا التائية في FBS 10 ٪ RPMI ، على أن تستكمل مع 10 وحدة / مل من IL - 2.

(يوم 2)

3. استعادة الخلايا الحية من Jurkats Transfected بفيروس نقص المناعة البشرية الكمامة - iGFP وتلون الخلايا المستهدفة مع الأصباغ نيون

1. السماح للخلايا Jurkat للتعافي من ترنسفكأيشن بين عشية وضحاها. ثم إزالة الحطام الخلوية بواسطة الطرد المركزي أكثر من مادة hypaque ficoll التدرج الكثافة. الاستغناء عن 1.5 مل من Paque - Ficoll إلى أسفل أنبوب مخروطي 15 مل. تراكب الانحدار برفق هذه المواد مع Jurkats transfected في حجم 5 مل من RPMI. الطرد المركزي الخلايا في 400 x ج لمدة 20 دقيقة في درجة حرارة الغرفة مع قبالة الفرامل. إزالة الخلايا بعناية من واجهة وسائل الاعلام / Ficoll باستخدام ماصة. نقلها إلى أنبوب جديد 15 مل المخروطية. تمييع الخلايا مع RMPI إلى وحدة تخزين ما مجموعه 15 مل وأجهزة الطرد المركزي في 300 x ج لمدة 10 دقيقة. Resuspend الكرية في 3 مل من وسائل الإعلام في ثقافة Jurkat جيدا سم 2 (6 - جيدا لوحة) والعودة إلى خلايا الأنسجة حاضنة الثقافة.
2. للتمييز بين الخلايا المستهدفة من الخلايا المانحة في نقل التجارب خلية خلية لأننا prelabel CD4 + الخلايا المستهدفة مع الأصباغ الفلورية. وصفت CD4 + الخلايا التائية الابتدائي حتىجي قبل الاستخدام. لقد كان لدينا ممتازا الخلايا T النجاح مع كل العلامات CellTracker والأصباغ CellTrace (Invitrogen ، كارلسباد ، كاليفورنيا). بينما يجب أن يكون الأمثل للتركيز الأصباغ وحضانة مرات اعتمادا على صبغة خاصة ونوع من الخلايا المستخدمة ، وبروتوكول ممثل التالي. بيليه 4 × 10 ⁶ CD4 + الخلايا التائية الأولية من خلال الدوران في 400 x ج لمدة 10 دقيقة. غسل الخلايا مع 5 مل من برنامج تلفزيوني وresuspend في 2 مل من برنامج تلفزيوني. إضافة CellTracker أورانج (CMTMR ، Invitrogen ، كارلسباد ، كاليفورنيا) إلى تركيز النهائي من 1.5 ميكرومتر واحتضان عند 37 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة. إضافة 8 مل من وسائل الاعلام Jurkat كاملة وأجهزة الطرد المركزي في 400 x ج لمدة 10 دقيقة. Resuspend الخلايا في 3 مل من وسائل الإعلام كاملة تستكمل مع 10 وحدة / مل من IL - 2 ومكان في النسيج حاضنة الثقافة بين عشية وضحاها.

(يوم 3)

4. رصد خلية إلى خلية نقل فيروس نقص المناعة البشرية الكمامة - iGFP باستخدام التصوير الخلية الحية

نستخدم عادة فيروس نقص المناعة البشرية الكمامة - iGFP الخلايا Jurkat transfected 48 ساعة بعد ترنسفكأيشن. ومع ذلك ، فقد استخدمنا بنجاح الخلايا في أقرب وقت على مدار 24 ساعة ، ووقت متأخر من 72 ساعة بعد ترنسفكأيشن.

1. ما يقرب من 48 ساعة بعد ترنسفكأيشن ، تحسب فيروس نقص المناعة البشرية الكمامة ، معربا عن iGFP Jurkats ، وغسلها مع CO ₂ وسائل الإعلام المستقلة (Invitrogen ، كارلسباد ، كاليفورنيا) ، ومعلق في الخلية الحية وسائل الإعلام التصوير (CO ₂ وسائل الإعلام المستقلة ، و 10 ٪ مصل بقري جنيني ، 100 U / مل البنسلين ، و 100 الستربتوميسين ميكروغرام / مل ، 10 وحدة / مل IL - 2) في تركيز خلايا 1-3 × ⁷ 10 / مل.
2. بطريقة مماثلة ، وغسل وresuspend CD4 الابتدائية المسمى + الخلايا التائية عند تركيز من x 01-03 أكتوبر ⁷ خلايا / مل العيش في وسائل الإعلام التصوير الخلية.
3. مزيج فيروس نقص المناعة البشرية الكمامة - iGFP - transfected Jurkats مع CD4 + الخلايا التائية الابتدائي في نسبة 1:2 أو 1:03 وتحميلها الى زراعة الأنسجة المعالجة والغاز قابلة للاختراق ، microchamber (Ibidi ، فيرونا ، ويسكونسن). على سبيل المثال ، مزيج من 20 ميكرولتر Jurkats الكمامة - iGFP فيروس نقص المناعة البشرية transfected مع 40 ميكرولتر من CD4 + الخلايا الأولية المسمى تي. تحميل 50 ميكرولتر من هذا الخليط الى غرفة Ibidi وختم الغرفة مع المقابس. تأمين المقابس بواسطة التفاف قابس / Ibidi اجهة الغرفة مع parafilm.

5. اعتبارات لمنصات المجهر : الغزل القرص مبائر التصوير

بعد تحميل وغرفة التصوير Ibidi مع الخلايا ، ونحن جبل فورا على جهاز بصري المجهر المقلوب (iX71 أوليمبوس ، ومركز وادي ، والسلطة الفلسطينية). وينبغي أن ينقل إلى غرفة Ibidi المجهر فقط من قبل العاملين في المختبرات BL2 + مدربين يرتدون ملابس السلامة المناسبة. على الرغم من أن الخلايا الحية التصوير يستخدم عادة غرف الحضانة مكلفة للحفاظ على بيئة مستقرة 37 درجة مئوية ، وقد تحقق ذلك باستخدام جهاز التدفئة بسيطة واقتصادية الحرارية (ASI 400 ، Nevtek ، Williamsville ، VA) جنبا إلى جنب مع طرف الحرارية نوع T - شنت بجوار نموذج لردود الفعل درجة حرارة مناسبة. لقد تم العثور على ثاني أكسيد الكربون باستخدام ₂ وسائل الإعلام المستقلة يسمح لنا للحفاظ على بقاء الخلية عالية مع تجنب استخدام الغرفة ₂ CO. للتخفيف من منصة ضد التقلبات في درجات الحرارة في الغرفة ولحجب ضوء الخلفية الغرفة ، ورايات سوداء كبيرة فوق الكفن الإعداد المجهر / سخان كله خلق جيب معزول الهواء في جميع أنحاء النظام. هذا يقلل بدرجة كبيرة من التباين في درجة الحرارة وما يرتبط بها من انحراف العينة المرتبطة بدرجات الحرارة ، ولكنها تتطلب قبل التسخين لمدة 30 دقيقة قبل تركيب العينة.

6. بيانات حيازة ونقل ومعالجة الصور

تؤخذ الصور باستخدام 60x النفط NA 1.42 هدف الغمر (UPlanApo N ، أوليمبوس) ، والفتحة العددية عالية (NA) يحسن إلى حد كبير القرار. لإنشاء الصور مبائر 3D ، ويتم تنفيذ المسح من قبل وحدة القرص الغزل مبائر (CSU - 10 ، Yokagawa واليابان) الذي يستخدم في وقت واحد> 800 البقع مبائر إلى زيادة كبيرة في معدل المسح الضوئي. مجاملة لسرعته ، ويتم إقران CSU - 10 مع جهاز حساسة للغاية ، إلى جانب متهم بضرب الإلكترون (EMCCD ، iXon + 897 ، Andor تكنولوجيز ، ايرلندا) للسماح الكاميرا بسرعة ، والتصوير على ضوء منخفض مما يقلل من كلا photobleaching والضيائية. مصدر الضوء الاستشعاع متعددة الطول الموجي ArKr ايون الغاز الليزر (70C إنوفا ومتماسكة ، وسانتا كلارا) حيث الطول الموجي المطلوب (488 نانومتر) ، وتقاس قوة الليزر الحق قبل الهدف المجهر (<1 ميغاواط) ويتم اختيار من قبل صوتية. البصري الانضباطي فلتر (AOTF) ، (Andor تكنولوجيز). لمزيد من خفض photobleaching وتمديد الوقت إجمالي التصوير ، وAOTF بسرعة (ميكرو) يغلق شعاع الليزر في كل مرة الكاميرا غير نشطة (10-20 مللي ثانية) ، بينما يتم تسليم صورة المكتسبة حديثا من اتفاقية مكافحة التصحر (15-30 مللي التعرض) إلى الكمبيوتر. ويقترن ضوء الليزر في نظام القرص الغزل باستخدام عصابة رباعية 405/488/568/647 مزدوج اللون المرآة (Semrock ، روتشستر ، نيويورك). يتم تصفية مضان الانبعاثات باستخدام ممر الموجة مرشح 525/50 (Semrock) داخل عجلة تصفية (Ludl المنتجات الالكترونية ، وهوثورن ، NY) منصة بetween الكاميرا EMCCD وحدة مبائر القرص الغزل. يتم التحكم في كافة الأجهزة وحيازتها ، بما في ذلك المرحلة ض (جنون مدينة مختبرات ، ماديسون ، ويسكونسن) ، بواسطة برنامج Andor v1.8 معدل الذكاء. لتحقيق أقصى قدر من سرعة اقتناء حوالي 1،2-1،9 second مداخن صورة 3D ، ونحن المحاصيل في المنطقة تسجيل الكاميرا EMCCD في المنطقة وصولا الى الخلوي الزوج على الفور. علاوة على ذلك ، على حساب بعض المعلومات في ض ، يمكن استخدام عدد كبير ض خطوة بين 0،45-0،75 ميكرومتر لتسريع الاستحواذ. يمكن التصوير في ظل هذه الظروف تستغرق ما يصل الى 6 ساعات -- استخدام شرائح دقيقة متواصلة 20-60 -- photobleaching مع الحد الأدنى. تماما ، كل قطعة بيانات تحتل عادة 5-20 غيغابايت من المساحة كما يتم أخذ عشرات الآلاف من الصور. لتسهيل النقل والتحليل من ملفات البيانات الكبيرة ، كل مجموعة اقتناء يحتاج إلى تقسيمها وتصديرها ك 1 غيغابايت شرائح TIFF ملف صورة باستخدام Andor قريش v1.8 البرمجيات. من هنا ، والعديد من حزم البرامج الممتازة المتاحة لتحليل الصور ، مثل Metamorph ، وVolocity ImageJ (نوصي به فيجي التباين).

عندما اثنين من علامات الفلورسنت أن تكون مجنزرة ، نسجل في الوقت ذاته من دون ابطاء اقتناء باستخدام "تقسيم الشاشة واسطة." نحن متحمسون سواء من قبل اثنين من علامات مختلفة خطوط الليزر ArKr في آن واحد (488 نانومتر ، وغالبا ما 568). إدراج مباشرة أمام الكاميرا EMCCD هو الخائن صورة (OptoSplit الثاني ، العلامة ، كينت ، المملكة المتحدة) التي تفصل بين الصورتين مختلفة. ومن ثم تصفية كل صورة بشكل مستقل باستخدام مرشحات مضان (Semrock) والمتوقعة جنبا إلى جنب على الكاميرا في خلق مرة واحدة في "تقسيم الشاشة" تأثير. هذا يتطلب ثم الاقتصاص اليدوي والتوفيق من الصور في وقت لاحق في معالجة الصور.

7. اعتبارات لمعالجة الصور وتحليل البيانات

نقوم عادة تحليل الصور مع Volocity (PerkinElmer ، التايم ، ماجستير) على أجهزة الكمبيوتر ماكنتوش (آبل ، وشركة). يتم أولا تعديل الغزل قرص ليزر الصور المجهري مبائر في حدتها لتصحيح photobleaching ، ثم مع deconvolved Volocity. يتم إجراء قياسات كثافة وتتبع نقاط والكمامة مع Volocity حدة القياس الكمي. لمجموعات الصور حيث الحركة النسبية لالمشبك قبل تشكيل يحتاج إلى أن تحسب ، ويستخدم خوارزمية التتبع الآلي الذي يقيس زر متشابك في جميع أنحاء تسلسل بأكمله. يجب إجراء التفتيش اليدوي للمناطق الفائدة التي يحددها البرنامج autotracking لتأكيد أن البرنامج قد تتبعت صحيح الكائن المطلوب. لكائنات حيث التباين مع الكائنات المحيطة ضعيفة جدا ، قد يتم تنفيذ تتبع الخط على أساس الإطار حسب الإطار. حزمة البرامج Volocity يسمح بتصدير XYZ موقع وحجم وإشارة متكامل داخل الكائنات المطلوب. يتم حساب المسافة من المشبك وسرعة الكائن تتبعها تطبيع الحركات وسط الزر متشابك.

8. ممثل النتائج

في غضون 10 إلى 15 دقيقة من الخلط وينبغي للمرء أن يكون قادرا على تصور فيروس نقص المناعة البشرية الكمامة - iGFP الخلايا Jurkat معربا عن التمسك CD4 + الخلايا التائية الابتدائي. تقارن هذه التصوير ، يمكن للمرء أن يقيم تحركات نقاط والكمامة في الخلايا المصابة ، وكذلك في الخلايا المستهدفة بعد synaspe. قد يلاحظ المرء حركة الكمامة - iGFP نقاط والخلايا المستهدفة في أقرب وقت بعد أن يتم تشكيل نقاط الاشتباك العصبي.

Discussion

نحن هنا وصف طريقة بسيطة لتصور نقل الفيروس من خلية خلية. الأبحاث الحديثة من مختبرنا وغيرها 'تشير إلى أن هذا قد يكون الطريقة السائدة لانتشار الفيروس بين خلايا تي. وصف الأسلوب هنا يوظف النموذج المؤتلف من فيروس نقص المناعة البشرية ، ودعا فيروس نقص المناعة البشرية ، iGFP الكمامة ، والذي يحمل علامة ترميز وراثيا ببروتين أخضر في الهيكلية الأساسية الكمامة ، والبروتين. وبسبب المستويات العالية للإنتاج في كل GFP جسيمات الفيروس ، وهذا تكرار استنساخ فيروس نقص المناعة البشرية المختصة ، تمكن الباحثون لتعقب جزيئات الفيروس الفردية في الوقت الحقيقي. هذا الفيروس ينبغي أن تكون مفيدة خاصة في الدراسات المتعلقة بنقل وتجميع خلية خلية من فيروس نقص المناعة البشرية.

نقل فيروس نقص المناعة البشرية من قبل خلية خلية ونقل عالية الكفاءة. خلال ثلاث ساعات شارك في الثقافة ، ونحن نرى الروتينية الفيروس نقلت إلى 20-30 ٪ من الخلايا التائية الابتدائية ، والمقررة من قبل التدفق الخلوي. وتعتبر الكفاءة النوعية مماثلة خلال تصوير الخلايا الحية. خلايا تي المصابة فيروسي بدء تشكيل نقاط الاشتباك العصبي مع الخلايا غير المصابة T الأولية على الفور تقريبا بعد الشروع في الثقافة المشتركة. للاهتمام ، وليس كل الخلايا الأولية T قادرة على التفاعل مع الخلايا المصابة بفيروس نقص المناعة البشرية Jurkat رغم التفاعلات القسري مع ملاقط الليزر (الملاحظات غير المنشورة ، وجنرال موتورز). وفيروس نقص المناعة البشرية الكمامة - iGFP ستكون بلا شك مفيدة لتحديد مجموعات فرعية الخلايا التائية التي هي الأكثر عرضة للخلية خلية نقل ، سواء في المختبر والمجراة.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Jurkat T Cells	ATCC
Leukocyte buffy coats from whole blood	New York Blood Center
RPMI	Sigma-Aldrich
Fetal Bovine Serum	Hyclone
Penicillin/Streptomycin	Invitrogen
Nucleofector System and Solution V	Lonza Inc.
EndoFree Maxi Prep Kits	Qiagen
HIV Gag-iGFP plasmid	Chen Laboratory
CD4+ T Cell Isolation Kit	Miltenyi Biotec
Ficoll-Paque	GE Healthcare
Celltracker/CellTrace Dyes	Invitrogen
CO2-Independent Media	Invitrogen
Imaging Chambers	Ibidi
Olympus IX-71 Inverted Microscope	Olympus Corporation
PlanApo N 1.42NA 60X oil objective	Olympus Corporation
Innova 70C ArKr ion gas laser	Coherent Inc.
CSU-10 Nipkow-type spinning disk confocal unit	Yokogawa
Di01-T405/488/568/647-13x15x0.5 dichroic beamsplitter	Semrock
525/50 bandpass filter	Semrock
iXon+ 897 electron-multiplied charged coupled devise camera	Andor
ASI 400 Thermostatic Heater	Nevtek