غير الغازية تصوير الزاجل كريات بيضاء والهجرة في الجسم الحي</em

Summary

هنا ، نحن تصف غير الغازية ثنائية الفوتون نهج المجهري (2P) لدراسة الكريات البيض صاروخ موجه في قاطع الطريق الماوس. نحن مناقشة الجوانب التقنية لدينا نسيج التحضير والتصوير والمشي القارئ من خلال تجربة نموذجية من الأولية التي أنشئت لتنفيذ وجمع البيانات.

Abstract

ثنائي الفوتون (2P) المجهري هو التصوير عالية الدقة التقنية التي تم تكييفها على نطاق واسع من قبل علماء الأحياء. قيمة المجهري 2P هو أنه يقدم معلومات غنية spatiotemporal بشأن السلوكيات داخل أنسجة الخلايا في فئران سليمة وحية. التوظيف الكريات البيض تلعب دورا هاما في الدفاع المضيف ضد العدوى وعندما لم يتم التحقق منه ، يمكن أن تسهم في الأمراض الالتهابية والمناعة الذاتية. دراسة الكريات البيض في الجسم الحي التوظيف يشكل تحديا تقنيا منذ خلايا تتحرك بسرعة داخل الأوعية تقع عميقا داخل أنسجة تشتت الضوء. حتى الآن ، ومعظم الدراسات التصوير intravital الجراحية تتطلب تحضيرا لفضح الأوعية الدموية والأنسجة. لتجنب تلف الأنسجة والالتهابات الناجمة عن الجراحة نفسها ، وهنا ، نحن تصف غير الغازية نهج التصوير وحيدة الخلية والتي يمكن استخدامها لدراسة الكريات البيض في الاتجار قاطع الطريق الماوس والسلاميات. نحن مناقشة الجوانب التقنية لدينا 2P التحضير والتصوير والمشي القارئ من خلال تجربة نموذجية من الأولية التي أنشئت لتنفيذ وجمع البيانات.

Protocol

1. الحيوان التحضير :

هذا البروتوكول يستخدم الكبار البالغات LysM - eGFP الفئران ، والتي هي fluorescently المسمى العدلات والضامة عن طريق التعبير عن eGFP ^1.

1. وسم الأوعية الدموية :
   لتصور الأوعية الدموية ، 15μl الكم من النقاط غير المستهدفة (655nm) والمخفف الى 100 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني وحقن في الوريد إلى 10-30 دقيقة الماوس قبل التصوير.
2. التخدير :
   1. ضع الماوس في غرفة تحريض النظام استنشاق التخدير البيطري (نوبل الخدمات الطبية ، وشركة).
   2. تعيين المرذاذ إلى 3-4 ٪ Isoflurane والناقل للغاز الأكسجين 100 ٪ معدل التدفق إلى ~ 1 لتر / دقيقة. لمنع جرعة زائدة عرضية التخدير ، وتراقب عن كثب هذا الحيوان حتى يتم فقدان قرصة إصبع القدم الخلفية المنعكس.
   3. الحفاظ على التخدير 1.5 ~ 2 ٪ Isoflurane وصقلها خلال التصوير لتقليل الآثار التنفس عند الضرورة. ويتم رصد معدل التنفس من الفأرة بعناية طوال الدورة التصوير لتأمين طائرة كافية من التخدير.
   4. يتم تطبيق Puralube مرهم البيطرية للعيون لمنع جفاف.
   5. يتم وضع الماوس على تنظيم 36 درجة مئوية وسادة التدفئة (برينتري العلمية) خلال الحقن والتصوير ومنع انخفاض حرارة الجسم.
   6. لمنع الجفاف ، وتعطى الماوس ميكرولتر من 100 SC PBS كل 1-2 ساعات.
3. تقديم حافز التهابات للحث على تجنيد الكريات البيض :
   1. ضع الماوس على مرحلة الجراحة ومسحة من قاطع الطريق مع الايثانول 70 ٪.
   2. ثني إبرة حقنة الانسولين ~ 90 درجة بالقرب من شطبة لتسهيل الحقن وتحسين دقة وعمق التسليم.
   3. تحميل المحاقن مع 0.5 ميكروغرام من القولونية bioparticles مخففة في برنامج تلفزيوني 1μl. ويمكن القيام بذلك في غطاء أنبوب microfuge لجعله أسهل لتحميل الحبرية.
   4. الاستمرار على القدمين مع ملقط المنحنية وادخال الإبرة من الجلد بلطف مع شطبة تواجه التصاعدي حتى يتم فقط تحت الجلد.
   5. حقن ببطء وعقد في المركز لمدة 5 ثوان لمنع أي تدفق الى الوراء.

2. التصوير مرحلة الإعداد :

منصة التصوير يتكون من لوحة الألومنيوم مع وجود ثقب دائري قطع طريق المركز. يتم لصقها على الزجاج غطاء كبير في الجزء السفلي من لوحة وغير لاصق من المطاط يا الدائري في أعلى لإنشاء غرفة السائل محكم راحة لاستيعاب مخلب الخلفي. واستعد لوحة الألومنيوم إلى 36 درجة مئوية خلال عناصر التدفئة الملحقين الجزء العلوي من لوحة.

1. ضع الماوس على مرحلة ما قبل التصوير وتحسنت الحفاظ على درجة حرارة جسم الفأر الأساسية باستخدام الاحترار 36 درجة مئوية وسادة.
2. تأمين مخلب إلى ساترة للغرفة التصوير مع طبقة رقيقة من superglue.
3. غسل مخلب مرتين لإزالة أي بت العائمة من الغراء ثم ملء الغرفة مع برنامج تلفزيوني جديد (قبل تحسنت إلى 36 درجة مئوية).

ولا يمكن تصوير الفئران لمدة تصل إلى 4 ساعات من دون جدوى تضم الحيوان. يمكن أن يكون الإفراج القدم بلطف مع كمية صغيرة من الأسيتون والفئران إحياء للدراسات طولية التصوير. ومع ذلك ، في هذه الحالة ، فإننا نوصي فترة التصوير لساعات 2 <والانتظار 24-48 ح بين الدورات لتقليل خطر جرعة زائدة من المخدر او الجفاف.

3. التصوير اكتساب

المجهر ثنائي الفوتون (2P المجهر) المستخدمة في هذا البروتوكول هو مبنية خصيصا المزدوج الليزر الفيديو نظام سعر تتكون المجهر تستقيم. وقد تم تجهيز النظام مع اثنين تي : ليزر الياقوت ، وأربعة وجها لوجه بي القلوي فرق إدارة المشاريع PMT للقناة في وقت واحد اقتناء 3 و 4 وغمر المياه 20X الهدف (أوليمبوس ، 20x/0.95 NA).

1. توليف XR الحرباء تي : الياقوت الليزر (المتماسك شركة) إلى 900nm - 890.
2. استخدام المرايا مزدوج اللون 480nm 560nm و(SemRoc) للفصل بين ثلاث قنوات : الأزرق (<480 نانومتر ، والثانية إشارة الجيل التوافقي) ، والأخضر (480 - 560nm ، LysM - eGFP العدلات إيجابية) والحمراء (> 560 نانومتر ، والكم نقطة الأوعية الدموية المسمى ). بدلا من ذلك ، يمكن استبدال المرشح 560nm 570nm مع مرشح للتمييز E. bioparticles القولونية (576nm bioparticles ستظهر البرتقالي) من نقاط الكم 655nm (سوف يظهر أحمر عميق).
3. انخفاض بعناية الهدف في برنامج تلفزيوني ، والتركيز على متن سفينة من أخمص قدميه.
4. مع سرعة التشغيل في صورة حيازة معدل الفيديو (30f/sec) واستخدام الإشارة الثانية التوافقي المنبثقة من الكولاجين والأنسجة معلما ، والمسح بسرعة النسيج (على سرعة اقتناء الفيديو معدل) لتحديد وعاء دموي من الفائدة (واحد بالمعتدلات lysM - eGFP مرئية).
5. تعديل على كسب هذه الفرق لتحسين فصل الألوان وتقليل كمية الليزر اللازمة لتحقيق إشارة كافية على خلفية (سواءالحرص على عدم تشبع الصورة!).
6. مرة واحدة تقع المنطقة مجال المصالح ، تبدأ الوقت الفاصل بين التصوير. لا يمكن أن يؤديها الوقت الفاصل بين التصوير مع القرارين الزمنية المختلفة. المتداول الخلية التصوير والالتصاق وفي الوقت الحقيقي داخل الأوعية الدموية ، ونحن اكتساب 30f/sec على طائرة واحدة - Z. لتوثيق الخلية التسرب والهجرة في لحمة نقوم 3D الوقت الفاصل بين التصوير. وهناك بروتوكول نموذجي يتكون من اقتناء المتوسط ​​15 لقطة لكل خطوة Z - 21 ، واكتساب 2.5μm متتابعة ض الخطوات لحجم 200-225 50μm على فترات 30 ثانية.
7. مرة واحدة يتم تخزين ملفات البيانات على الخادم المختبر ، ويمكن استخدام Imaris Volocity أو البرمجيات لأداء متعددة الأبعاد وجعلها خلية تتبع ^{2 ، 3.}

4. ممثل النتائج

1.Real الوقت (30f/sec) تخيل العدلة من المتداول على طول هذه السفن في 200X. الفاصل الزمني يبين التصوير العدلات ، والخضراء ، والمتداول على طول بطانة الأوعية الدموية حول 10mins بعد الإصابة بفيروس Listeria monocytogenes ، كما هو مبين في الحمراء. ألياف الكولاجين في النسيج الضام يظهر باللون الأزرق. الرجاء النقر هنا لمشاهدة الفيديو.

2.Time مرور 3D التصوير ديناميات التوظيف في العدلة 200X. ويرد التوظيف العدلة نموذجية من التداول ، والهجرة من خلال الأنسجة الملتهبة. الرجاء النقر هنا لمشاهدة الفيديو.

Discussion

في هذا البروتوكول الفيديو نظهر إجراءات التصوير 2P غير الغازية من الكريات البيض في التوظيف استجابة للالتهاب.

وقاطع الطريق هو موقع الكلاسيكية الفسيولوجية لدراسة التهاب مثل مرض الحساسية ، والعدوى والمناعة الذاتية ^4-7. 2P التصوي...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Isoflurane, USP	Butler Animal Health Supply	029405
655nm non-targeted quantum dots	Invitrogen	Q21021MP
Tetramathylrhodamine conjugated E. coli BioParticles	Invitrogen	E2862
Listeria monocytogenes (Lm)	Reference 2
Quick gel	Duro
Puralube Vet Ointment	Pharmaderm Animal Health
Insulin syringes	BD Biosciences	08290-3284-38
PBS	Thermo Fisher Scientific, Inc.	SH30256.02