Intravital المجهري للماوس دوران الأوعية الدقيقة الدماغ باستخدام نافذة مغلقة القحف

Summary

Intravital المجهري لمتابعة الأحداث الزمانية والمكانية الدورة الدموية والتهابات في دوران الأوعية الدقيقة حنوني.

Abstract

وقد صمم هذا النموذج التجريبي لتقييم دوران الأوعية الدقيقة الماوس حنوني خلال الدورة الدموية ، الحادة والمزمنة والفسيولوجية والمرضية في جسم المريض ، وظروف التهابات والأيض ، وذلك باستخدام المجهر مضان في الجسم الحي. وضعت نافذة مغلقة في الجمجمة خلال القشرة الجداري القذالي الأيسر من الفئران. يتم تسجيل دوران الأوعية الدقيقة المحلية في الوقت الحقيقي من خلال النافذة باستخدام برنامج التحصين الموسع وإنارة مضان ، وقياسات للأقطار السفن وخلايا الدم الحمراء (RBC) يتم تنفيذ سرعات. ويتم قياس سرعة RBC في الوقت الحقيقي باستخدام عبر ارتباط و / أو كرات الدم الحمراء التي تحمل علامات الفلورسنت. تصنع الكريات البيضاء والصفائح الدموية الانضمام للسفن حنوني وتقييم نضح وتسرب الأوعية الدموية مع مساعدة من علامات مضان المسمى مثل الأجسام المضادة الزلال ، ومعاداة FITC TxR CD45. يمكن أن يكون دوران الأوعية الدقيقة مرارا الفيديو المسجلة على مدى عدة أيام. استخدمنا لأول مرة في الدماغ نافذة المجهري intravital قريبة من دراسة دوران الأوعية الدقيقة حنوني لمتابعة التغيرات الدينامية خلال عدوى المتصورة أنكا berghei في الفئران وتبين أن يرتبط التعبير عن CM مع الاختلالات microcirculatory يتميز تضيق الأوعية ، وانخفاض عميقة في الدم تدفق الأوعية الدموية ، والانهيار في نهاية المطاف.

Protocol

1. حج القحف

A حج القحف في 8 إلى 10 أسبوعا من العمر الفئران الاحتياجات التي يتعين القيام بها في وقت مبكر ك ¹ الموصوفة سابقا ، إلا أنه لم يتم وضع شريط التيتانيوم في رأس الحيوان. نافذة المزمن هو فحص الجمجمة التحضير مستقر يسمح للدوران الأوعية الدقيقة حنوني أشهر حتى بعد أن زرع. عادة ، نحن لدينا إجراء دراسات 2-3 أسابيع بعد الزرع النافذة في الجمجمة.

2. Intravital المجهري

1. ليومين أو ثلاثة أسابيع بعد حج القحف ، يتم فحص درجة حرارة الجسم ومن ثم الفأر هو تخدير باستخفاف مع isoflurane (4 ٪ لتحريض ، 1-2 ٪ للصيانة). يستخدم التخدير الخفيفة لمنع التوتر والانزعاج الحيوانات أثناء إجراء التجارب.
2. ثم توضع في موقف الحيوانات المعرضة على إطار التجسيمي ورئيس المضمون بعناية باستخدام قضبان الأذن. يتم ضبط مستوى باستخدام العتلات اليمين واليسار. يتم الاحتفاظ درجة حرارة الجسم الأساسية باستخدام وسادة التدفئة. لأن الفئران مع الملاريا الدماغية تطوير انخفاض حرارة الجسم ، وضبط درجة الحرارة يجب أن يتم تعديلها لكل حيوان.
3. يتم تنظيف بلطف زلة تغطية على نافذة الجمجمة مع قطعة من القطن مبللة مع الزيوت المعدنية ويتم التقاط صورة بانورامية للسفن تحت النافذة مع مساعدة من stereomicroscope وكاميرا رقمية (نيكون 995 ، اليابان). تتم طباعة الصور ، التي تم تحديدها ومؤرخة وسيتم استخدامها كخريطة للقياسات من قطر السفينة وسرعات خلايا الدم الحمراء (RBC).
4. ثم يتم نقل الماوس لمرحلة المجهر intravital (مخصصة لايكا - McBain ، سان دييغو ، كاليفورنيا). يتم وضع قطرة من الماء على النافذة الجمجمة الاستفادة من تشكيل جيدا من الاكريليك الأسنان ، ويتم ضبط التركيز. وتجرى القياسات باستخدام الغمر بالماء 20X (LUMPFL - WIR ، الفتحة العددية 0.6 ، أوليمبوس) الهدف. يتم اتباع نفس السفن بحيث يمكن إجراء المقارنات المباشرة إلى مستويات خط الأساس الخاص بها مما يسمح للإحصاءات أكثر قوة لعينة صغيرة من السكان. يتم التقاط الصور باستخدام الكاميرا الرقمية منخفضة الضوء عالية السرعة (هاماماتسو C9300 - 221 ، اليابان) ، أو منخفضة الضوء الكاميرا التماثلية (COHU 4815 ، وسان دييغو ، كاليفورنيا) متصلا إلى شريط فيديو (JVC ، اليابان) ، وختم الوقت (فيديو MicroImage نظم ، Boyertown ، والسلطة الفلسطينية) وشاشة ملونة (بيلكو ، كلوفيس ، كاليفورنيا). يتم التعرف بشكل صحيح على الشريط قبل بدء التسجيل ، والطابع الزمني يتيح التعرف على الأحداث من خلال توثيق الجدول الزمني الذي تم خلاله تكبد مثل هذه الأحداث.
5. يتم إجراء الفحص الأول من السفن لتقييم جودة لإعداد وإذا كان الدم يتدفق في جميع السفن. ثم ، يتم اختيار من السفن إلى أن تقاس ، وينبغي أن تشمل الأوردة والشرايين من أقطار مختلفة (في الأعمال التحضيرية لدينا حنوني الماوس ، ومعظم السفن التي تتراوح ما بين 20 و 80μm) وتغطي مواقع مختلفة داخل منطقة كشفها بواسطة النافذة. ويمكن الشرايين والأوردة متباينة بسهولة عن طريق التحقق من اتجاه تدفق الدم في تشعبات السفينة (سواء كانت توزع أو يجمع الدم). في دراستنا ، يتم إجراء قياسات في 12 سفينة. الموقع الدقيق من كل بقعة على أن يقاس هو مشروح في الصورة من الأوعية الدموية حنوني.
6. لكل بقعة ، يتم قياس قطر السفينة باستخدام جهاز القص الصورة (صورة القص ، فيستا الإلكترونيات ، وسان دييغو ، كاليفورنيا) ^2. مرة واحدة يتم تحديد المكان ، يتم محاذاة صورة للسفينة في الوضع الرأسي والمنفصمة الصورة حتى يتم محاذاة المتطرفة تعارض ويتم توثيق القراءة. ويمكن ترجمة هذه القيمة إلى ميكرومتر بواسطة المعايرة السابقة لكل التكبير محددة باستخدام مرحلة المعايرة شبكاني ميكرومتر (ادموند بصريات ، وشركة بارينغتون ، ونيو جيرسي).
7. يتم تسجيل كل بقعة خلال 30 ثانية على الأقل لتتبع كرات الدم الحمراء. لتتبع ، يتم جمع عينة من الدم ، وfluorescently المسمى الكريات الحمراء مع carbocyanine صبغ ديل (المسابر الجزيئية ، كارلسباد ، كاليفورنيا) وأكسب من خلال الوريد الذيل للحصول على التركيز في الجسم الحي من 0،4-0،5 ٪ ~ ^3. في الحيوانات المصابة المتصورة berghei أنكا (PBA) معربا عن ببروتين أخضر (PBA - GFP ، تبرعا من أبحاث الملاريا والمراجع الكاشف مركز الموارد MR4 ، ماناساس ، فرجينيا ؛ أودعتها Janse CJ والمياه ا ف ب) ، أي ضخ المسمى الخلية هو ضروري. يتم تسجيل صور الفيديو بسرعة 150 لقطة في الثانية. يتم تعيين هذا المعدل للحصول على صور 1-6 في خلية على الإطار فيديو واحد لتحديد سرعات تصل إلى 8 ملم / ثانية. والرقمية وصور الفيديو مع جهاز كمبيوتر شخصي باستخدام برنامج Adobe 4.0 الممتاز ، ويتم الحصول على البيانات XY تنسيق لكل صورة الخلية باستخدام SigmaScan برو 4.0 البرمجيات (SPSS شيكاغو ، IL) ^4. وتتحدد المواقف الخلية بدلا من يدويا عن طريق تحليل الصور ، نظرا لأنه يظهر للعين من مراقب مدربين لإعطاء تقدير جيد لموقع مركز للخلية ، والتيح عموما يناظر موقع مضان القصوى لاحظ توجهات معظم الخلية. تصنع قرارات متعددة لموقف والسرعة ، ولكل خلية للحصول على متوسط ​​السرعة يعني RBC.
8. عندما يتم إجراء قياسات سرعة RBC حاليا ، في الوقت الملاحظة الإجمالية لكل الماوس لا تتجاوز 10-15 دقيقة التقليل من الآثار cardiodepressive من التخدير.
9. مرة واحدة بقطر السفينة وقياسات سرعة RBC متوفرة ، ويمكن إجراء حساب تدفق الدم في كل سفينة باستخدام الصيغة : س = س π V (D / ²⁾ 2 ، حيث س = تدفق الدم ، V = RBC السرعة والتطوير = قطر السفينة.
10. ويمكن تكرار هذه الإجراءات على مر الزمن. على سبيل المثال ، في نموذج الفأر من الملاريا الدماغية ، ونحن أداء قياسات يومية ابتداء من يوم 4 من العدوى. تم تطبيع القيم التي تم الحصول عليها في كل يوم عن كل ما يتعلق الماوس في اليوم 0 (قبل الاصابة) ، الذي يعتبر أن تكون 100 ٪.
11. بالإضافة إلى قطر السفينة وقياسات تدفق الدم ، ويمكن إجراء تقييمات إضافية على سبيل المثال تقييم تحسين التروية وتحليل المتداول الكريات البيض و / أو الصفائح الدموية في الأوعية والتقيد حنوني. يتم تنفيذ هذه القياسات مع مساعدة من علامات الفلورسنت ذات العلامات. في حالة من الملاريا ، ويمكننا أيضا الكشف عن الطفيليات المنتشرة أو ملتصقة به من قبل وسائل الضغط التي تعبر عن PBA GFP.
12. لتقييم نضح نستخدم حل FITC المسمى ألبومين (سيغما ، وسانت لويس ، MO 50μg/mouse) ، والانضمام لقياس الكريات البيض للسفن حنوني نستخدم الأجسام المضادة ضد علامة عموم الكريات البيض CD45 الأحمر المسمى مع ولاية تكساس (TxR) ( Invitrogen ، كارلسباد ، كاليفورنيا 4μg/mouse). لهذا ، من 25μL مختلطة هي (200μg/mL) الألبومين FITC (2mg/mL) و20μL من أضداد CD45 - PE وحقن في الوريد قبل الذيل تحسنت. ويمكن عندئذ يمكن تصوير الماوس على الفور ، ولكن إذا تسرب القياسات سوف تتخذ يسمح الألبومين FITC أن تعمم لمدة 15 دقيقة. يتم التقاط مخضر (518nm) المنبعثة من FITC - الألبومين وGFP (PBA - GFP pRBC) باستخدام وALPHA حية : XF100 - 2 (أوميغا البصرية ، براتلبورو ، VT) ، ومكافحة CD45 TxR ومضان (615nm) وخرجت و أسر مع قياسي حيوي : XF42.
13. والألبومين الفلورسنت ذات العلامات يسمح التصور تحسين شبكة الأوعية الدموية ، بما في ذلك سفن اختراق ، وانها مفيدة بشكل خاص في ولايات مثل مرض الملاريا الدماغية للتحقق من السفن غير perfused أو تحت perfused. ويمكن أيضا أن تستخدم لقياس تسرب الأوعية الدموية ^5.
14. الفلوريسنت ذات العلامات المضادة للأضداد CD45 تجعل من السهل تحديد وقياس والتصاق الكريات البيض المتداول للسفن حنوني. لتجنب التحيز في تقدير ، ونحن كمية المتداول والتصاق في نفس المواقع المحددة مسبقا لقياس تدفق الدم. يرصد الكمي للالتصاق الكريات البيض التي تحصي عدد الكريات البيض في طول 100μm - السفينة. هو كمية المتداول من قبل احتساب عدد الكريات البيض السفر في سرعة أبطأ بكثير من سرعة الدم في طول 100μm نفسه ، وخلال 30 ثانية.

3. ممثل النتائج

الشكل 1. (الخطوة 2.6) صور من شبكة الأوعية الدموية الماوس حنوني الوصول إليها من خلال نافذة في الجمجمة.

الشكل 2. (3،1-3،5 خطوات) عرض تخطيطي للإعداد للفحص المجهري للدوران الأوعية الدقيقة intravital الماوس حنوني. 1 : المجهر intravital ؛ 2 : 20X الهدف غمر المياه ؛ 3 : مصدر الضوء ؛ 4A : الرقمية الإضاءة المنخفضة كاميرا عالية السرعة ؛ 4B : كاميرا تمثيلية ؛ 5 : الماوس في إطار التجسيمي ؛ 6 : شاشة الحاسوب ؛ 7 : التناظرية شيرر رصد تظهر كيف تتم تقطيع الصورة (السهم) لقياس قطرها السفينة.

الشكل 3. (الخطوة 3،6-3،8) الاوعية الدموية الدقيقة الخلية قياسات سرعة الدم الحمراء عن طريق تتبع خلية من تسجيلات الفيديو مضان سرعة عالية. صور من ألف إلى واو هي صور تسلسل سفينة واحدة حنوني ، مما يدل على واحد يتحرك RBC عبور محدد الحقل المجهري بواسطة الكاميرا. تقرير مختصر من الإطار بواسطة مناصب الإطار من 15 أو أكثر من الخلايا عبور المجال ، وعلى مسافة ما قبل معايرة ، ويتيح حساب سرعة RBC يعني في كل سفينة بمساعدة جدول بيانات Excel.

الشكل 4. (الخطوة 3.9) بيانات من تجربة تمثيلية تظهر التغيرات في تدفق الدم حنوني على مر الزمن في المتصورة berghei أنكا (PBA) الفئران المصابة (ن = 5) ، والسيطرة على الفئران غير المصابة (ن = 5). في حين أن الفئران السيطرة على تدفق الدم حنوني غير مستقرة نسبيا مع مرور الوقت ، PBA الفئران المصابة تبين انخفاضا ملحوظا في تدفق الدمفي ذلك الوقت للتنمية الملاريا الدماغية (اليوم 6). البيانات هي يعني ± SEM.

الشكل 5. (الخطوة 4.3) وهناك عدد كبير من الكريات البيض تمسكا السفن حنوني على فأرة الحاسوب المصابين المتصورة berghei أنكا ، كما يتضح من تلطيخ مع الأضداد الأحمر لمكافحة CD45 - تكساس الفلورسنت.

Discussion

الأسلوب المجهري intravital الموصوفة هنا يوفر أداة فريدة وقوية لرصد تفصيلي للدوران الأوعية الدقيقة حنوني في الماوس. أنها تسمح استفراد فرد الشرايين والأوردة وقياس التغيرات في عدد من المعلمات مثل أقطار السفينة ، RBC السرعات ، وتدفق الدم ، والالتزام والمتداول من الكريات البي...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Isoflurane	Baxter Internationl Inc.	FDG9623
Carbocyanine dye Dil	Molecular Probes, Life Technologies	D306
Albumin-FITC	Sigma-Aldrich	A9771
Anti-CD45-TxR Ab	Invitrogen	MCD4517
P. berghei ANKA-GFP	MR4	MRA-865