جهاز ميكروفلويديك مع أنماط Groove لدراسة السلوك الخليوي

Summary

وصفنا بروتوكول لتصنيع أجهزة ميكروفلويديك التي تتيح التقاط الخلايا والثقافة. في هذا النهج تستخدم المجهرية منقوشة مثل الأخاديد داخل قنوات ميكروفلويديك لإنشاء مناطق منخفضة إجهاد القص داخل الخلية والتي يمكنها ان ترسو.

Abstract

نحن تصف جهاز ميكروفلويديك مع أنماط السلوك microgrooved لدراسة الخلوية. هذه المنصة ميكروفلويديك يتكون من قناة fluidic العلوي والسفلي ركيزة microgrooved. الى افتعال القنوات microgrooved ، كان أحد كبار محاذاة بولي (dimethylsiloxane) (PDMS) العفن الذي يحتوي على انطباع من القنوات ميكروفلويديك والمستعبدين من ركيزة microgrooved. باستخدام هذا الجهاز ، وكانت الخلايا الليفية يجمد الماوس ومنقوشة داخل ركائز microgrooved (25 ، 50 ، 75 ، وعرضها 100 ميكرون). وكان لدراسة الخلايا في جهاز ميكروفلويديك ، perfused وسائل الإعلام التي تحتوي على بيروكسيد الهيدروجين ، والخامس Annexin ، ويوديد propidium fluidic في القناة لمدة 2 ساعة. وجدنا أن الخلايا المعرضة للالاكسدة أصبحت أفكارك. وتأكدت هذه الخلايا أفكارك قبل الخامس Annexin أن منضمة إلى فسفاتيديل في النشرة الخارجي للغشاء البلازما أثناء عملية موت الخلايا المبرمج. باستخدام هذا الجهاز ميكروفلويديك مع أنماط microgrooved ، لوحظ في عملية موت الخلايا المبرمج في الوقت الحقيقي وتحليلها باستخدام ميكروسكوب مقلوب يحتوي على غرفة الحضانة (37 درجة مئوية ، 5 ٪ CO _2). لذلك ، يمكن لهذا الجهاز ميكروفلويديك تدمج مع ركائز microgrooved تكون مفيدة لدراسة سلوك وأداء الخلوية عالية الإنتاجية فحص المخدرات.

Protocol

ألف التصنيع الدقيق للجهاز ميكروفلويديك

1. يعامل 4 بوصة رقاقة سيليكون مع البلازما الاكسجين التفاعلية (5 دقائق في 30W ، Harrick العلمية ونيويورك).
2. مقاوم الضوء السلبية (SU - 8 2015 ، Microchem ، MA) هو زيادة ونقصان المغلفة عند 900 دورة في الدقيقة لمدة 1 دقيقة على رقاقة سيليكون.
3. رقاقة لينة المخبوزة في 95 درجة مئوية لمدة 6 دقائق على موقد ويتعرضون لضوء الأشعة فوق البنفسجية (200W) لمدة 4 دقائق من خلال فيلم قناع يحتوي microchannels.
4. الرقاقة هو خبز في آخر 95 درجة مئوية لمدة 6 دقائق وتطويرها باستخدام SU - 8 المطور مقاومة للضوء.
5. يتم وضع رقاقة منقوشة مقاوم الضوء تحتوي microchannels في طبق بتري.
6. هي ملفقة بولي (dimethylsiloxane) (PDMS) (Sylgard 184) قوالب السيليكون التي الاستومر الاختلاط وكيل علاج (10:1 نسبة).
7. يسكب الخليط PDMS على القالب الرئيسي سي وضعها على فراغ مجفف لإزالة الفقاعات.
8. غير مملح PDMS في 70 درجة مئوية لمدة 1 2 ساعة ~.
9. ومقشر ثم قوالب PDMS الخروج من القالب الرئيسي سي.

B. تجميع الجهاز

1. ويتم الحصول على 40 ميكرومتر سميكة أعلى قنوات fluidic و 40 ميكرون قنوات أسفل microgrooved سميكة (25 ، 50 ، 75 ، و 100 واسعة μ م) من اثنين من مختلف القوالب الرئيسي سي.
2. واللكم قناة مدخل ومخرج الجهاز fluidic.
3. مستعبدين بشكل لا رجعة فيه قنوات وقنوات Fluidic مرسمة مجهارية بواسطة البلازما الاكسجين التفاعلية (5 دقائق في 30W ، Harrick العلمية ونيويورك).
4. وهي مغلفة المصفوفة خارج الخلية (ECM) (أي فبرونيكتين) داخل جهاز ميكروفلويديك لمدة 1 ساعة في حاضنة (37 درجة مئوية).

جيم بذر الخلية والإعداد التجريبية

1. يتم استزراع الخلايا الليفية الماوس NIH - 3T3 في نسيج الثقافة القارورة باستخدام وسائل الإعلام في التعديل Dulbecco النسر (DMEM) تحتوي على 10 ٪ مصل بقري جنيني (FBS).
2. الخلايا trypsinized وفصلها.
3. فصل الخلايا يتم تحميلها في القنوات مرسمة مجهارية في كثافة خلية من 3 × 10 ⁶ خلية / مل (الشكل 1).
   
   
   الشكل 1
   
   
4. وسائل الإعلام التي غرست 2 مل ، 100 ملي مول H ₂ O ₂ ، ومقايسة موت الخلايا المبرمج (20 ميكرولتر Annexin V و 40 يوديد propidium ميكرولتر ، Invitrogen ، CA) إلى قناة باستخدام مضخة محقنة (1 ميكروليتر / دقيقة).
5. الخلايا في الوقت الحقيقي رصد باستخدام مجهر مقلوب (نيكون TE 2000).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

ويجمد منقوشة داخل الخلايا وركائز microgrooved في جهاز ميكروفلويديك. ولوحظ في عملية موت الخلايا المبرمج للخلايا تعرضت لبيروكسيد الهيدروجين في الوقت الحقيقي وتحليلها باستخدام Annexin الخامس ويوديد propidium. وبالتالي ، يمكن لهذا الجهاز يحتوي على قنوات ميكروفلويديك مرسمة مجهارية تكون مفيدة ?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
PDMS	Reagent	K.R. Anderson Co.	2065622	Poly(dimethylsiloxane), Dow Corning Sylgard 184 (8.6 lb)
DMEM	medium	Invitrogen	11965	Dulbecco’s Modified Eagle’s Media
FBS	serum	Invitrogen	10082-147	Fetal Bovine Serum
Hydrogen peroxide	Reagent	Sigma-Aldrich	H1009
Apoptosis assay		Invitrogen	V13242	Annexin A, propidium iodide
Negative photoresist		MicroChem Corp.	SU-8 2015
Si wafer	Tool			4 inch silicone wafer
Reactive oxygen plasma	Reagent	Harrick Scientific Products, Inc.		treat wafer 5 min at 30W
inverted microscope	Tool	Nikon Instruments	TE 2000