جبل كله<em&gt; في الموقع</em&gt; التهجين من E8.5 لأجنة الفئران E11.5

Summary

هذا كله جبل في الموقع بروتوكول التهجين يناقش الخطوات الحاسمة التي تضمن نتائج ذات جودة عالية للتكرار للدراسات التعبير الجيني في الأجنة اليوم E8.5-E11.5 الماوس القديمة.

Abstract

جبل بأكمله في الموقع التهجين هو نهج مفيدة للغاية لتحديد أنماط التعبير الجيني في الأجنة. والإجراءات في الموقع التهجين هي طويلة وتطالب تقنيا مع خطوات هامة المتعددة التي تسهم مجتمعة في نوعية النتيجة النهائية. يصف هذا البروتوكول في العديد من التفاصيل الخطوات الرئيسية لتحسين مراقبة الجودة ووضع العلامات التحقيق الأداء. عموما، لدينا بروتوكول يقدم وصفا مفصلا من الخطوات الحاسمة اللازمة للحصول على نتائج عالية الجودة بتكاثر. أولا، نحن تصف جيل من (DIG) تحقيقات digoxygenin RNA صفت في النسخ عن طريق المختبر من القوالب التي تم إنشاؤها بواسطة الحمض النووي PCR. نحن وصف ثلاثة فحوصات مراقبة الجودة الحرجة لتحديد مقدار والنزاهة والنشاط المحدد للتحقيقات DIG-المسمى. هذه الخطوات مهمة لتوليد تحقيقا للحساسية كافية لكشف mRNAs والمحلية في جنين فأر كله.وبالإضافة إلى ذلك، نحن تصف طرق لتثبيت وتخزين الأجنة اليوم E8.5-E11.5 الماوس القديمة في الموقع التهجين. ثم، نحن تصف طرق مفصلة لعملية الهضم محدودة K بروتين من الأجنة ميهت تليها تفاصيل عن ظروف التهجين، يغسل بعد التهجين والعلاج لإزالة ريبونوكلياز غير محددة التهجين التحقيق. يتم استخدام الأجسام المضادة AP-مترافق لتصور المسمى التحقيق والكشف عن نمط التعبير من نص الذاتية. وتظهر نتائج ممثلة من التجارب الناجحة والتجارب دون المستوى الأمثل نموذجية.

Protocol

1. الجيل Riboprobe عبر النسخ في المختبر

1. إعداد المنتجات PCR لفي قوالب النسخ المختبر.
   1. تصميم الاشعال PCR مع تسلسل النسخ بالعاثية المروج بنتيجة 5 في بلدانهم.
      ملاحظة: سيتم استخدام تسلسل المروج إضافة إلى 5'end من التمهيدي PCR الشعور حبلا سيتم استخدامها لتدوين التحقيق المعنى، وتسلسل المروج إضافة إلى 5'end من التمهيدي PCR مضاد لتوليف التحقيق مضاد للاحساس ^1-3. لدينا لم يتم الكشف عن أي اختلاف في كفاءة النسخ بين القوالب التي تحتوي فقط على المروج الأساسية للتسلسل مقابل القوالب التي تحتوي على مروج الأساسية بالإضافة إلى تسلسل 5 إضافية. وقد استخدم هذا الأسلوب مع T7، T3 والمروجين بالعاثية SP6.
      وينبغي تجنب متواليات التي يتم حفظها بدرجة كبيرة بين أفراد الأسرة أو تسلسل الجينات المتكررة للغاية لأنها يمكن أن تؤدي إلى التهجين غير محددة وtherebY زيادة تلطيخ الخلفية. سوف يبحث مع محتوى عال GC-محدودة digoxigenin rUTP التأسيس وتسلسل الحمض النووي القالب مع أشواط من مخلفات T سوف تحد من إدماج DIG-UTP بسبب تدخل الفراغية بين جزيئات digoxigenin. يمكن طول التحقيق تتراوح بين 300bp ل1KB. ولكن طالما تم استيفاء المعايير المذكورة أعلاه، وعادة ما يكون أطول تحقيقات أنشطة محددة أعلى.
   2. يمكن القالب لتكون PCR استنساخ البلازميد، أو استنساخ الجينوم الحمض النووي الجيني. عادة نقوم بشراء كامل طول EST استنساخ (على سبيل المثال من النظم البيولوجية أو ATCC فتح) لاستخدام قوالب PCR. تضخيم الحمض النووي القالب باستخدام معيار الإجراءات PCR لإنتاج منتج PCR يحتوي على تسلسل المروج. لجعل قوالب التحقيق بما يكفي لدعم العديد من ردود الفعل التوليف التحقيق وضعناها عادة ما يصل 8 × 50μl تقارير إتمام المشروعات. يتم تجميع ردود الفعل للخطوة التالية. وبصفة عامة لا الحصر تقارير إتمام المشروعات كبيرة الحجم أو ردود فعل أكثر الصغيرة (مثل ردود الفعل التي نستخدمها 50μl) لإعادة كافية لتوليد ما يكفي من القالب لعدة ردود فعل التوليف التحقيق.
   3. لإزالة البروتينات تلويث وآثار خاصة من ريبونوكلياز في الاستعدادات بلازميد، هضم كل من تفاعل PCR 100μl مع 1μl من 20mg/ml بروتين C ° K في 55 ل30 دقيقة على الأقل. ينبغي لجميع الكواشف والمواد الأخرى المستخدمة بعد هذا الهضم K بروتين تكون حرة وريبونوكلياز مخصصة تحديدا للعمل RNA.
   4. خلال عملية الهضم K بروتين، تشغيل عينة من رد الفعل على هلام PCR للتأكد من سلامة المنتج PCR. نستخدم المواد الهلامية الأكريلاميد البسيطة لحل أصغر المنتجات PCR (أقل من 600-700 بي بي) والمواد الهلامية الاغاروز لحل أكبر المنتجات PCR (> بي بي 600-700) للتحليل ومراقبة الجودة. إذا كنت ترى نطاقات متعددة على هلام، نوصي تحسين التفاعل PCR حتى يتسنى لك الحصول على المنتج PCR واحد من الحجم الصحيح.
   5. استخراج بدقة K بروتين مهضوم PCR تفاعل مع مجلد واحد على قدم المساواة من mixt الفينول / كلوروفورم (1:1)لدى عودتهم، يعقبه استخراج واحد حجم مساو من كلوروفورم. خلط في كل خطوة vortexing الأنبوب لمدة لا تقل 30 ثانية. يجب أن يتم تنفيذ هذه الخطوات في غطاء الدخان الكيميائي.
   6. يعجل المنتج PCR المنقى من خلال إضافة 0،1 حجم خلات الصوديوم 3M و 2 مجلدات من الايثانول 100٪. ترك في -20 درجة مئوية لمدة لا تقل عن 30 دقيقة.
   7. تدور لمدة 5 دقائق في 13000 دورة في الدقيقة في ميكروسنتريفوج، وإزالة طاف، ويغسل مع الايثانول 70٪. السماح للبيليه DNA حتى يجف تماما.
   8. إعادة تعليق DNA في حجم مناسب (على سبيل المثال 50μl) من 1xTE. قياس تركيز الحمض النووي باستخدام مقياس التألق.
   9. تحديد تسلسل النوكليوتيدات من كل قالب والإعدادية PCR باستخدام بادئات التي تتوافق مع تسلسل المروج بالعاثية أو تسلسل الداخلية في التحقيق. هذا هو خطوة حاسمة لمراقبة الجودة التي تضمن أن القالب التحقيق هو من التسلسل الصحيح.
   10. الحمض النووي هو على استعداد لتكون بمثابة نموذج لفي محضر المختبرأيون. تخزين القالب الحمض النووي في C. ° 4
2. في النسخ المختبر باستخدام PCR المنتج كقالب.
   1. إعداد النسخ RNA رد فعل في الحجم النهائي من 50μl. رد الفعل يتضمن النسخ 500 - 1000 نانوغرام من الحمض النووي القالب، 5μl من العازلة 10X التدوين (DTT 100mM مع)، 10μl 2.5MM DIG-NTP المزيج، 3μl (50 ~ 90 وحدة) من البلمرة RNA، 1μl ألفا ^P-32 CTP (حتى إلى 6 أشهر من العمر) ويتم إجراء ما تبقى من رفع مستوى الصوت عن طريق إضافة المياه diethylpyrocarbonate المعالجة. يتم عادة 2.5MM DIG-المزيج NTP على خط النار في الأسهم 40μl عمل تتضمن 10μl 10MM CTP، GTP 10μl 10MM، 10MM 10μl ATP، 6.5μl UTP 10MM، 10MM 3.5μl UTP digoxigenin-11. في رد فعل تجميع النسخ، تأكد أن درجة حرارة جميع مكونات التفاعل (باستثناء انزيم) إلى درجة حرارة الغرفة. خلط الحمض النووي والماء أولا، ثم إضافة رد الفعل العازلة، ثم قم بإضافة مزيج مكونات أخرىوإلا فإن سبيرمدين في المخزن المؤقت النسخ ترسيب DNA. احتضان لمدة 2 ساعة في درجة حرارة الموصى بها لبوليميراز RNA المستخدمة.
      ملاحظة: يتم إضافة P ^α-32 إلى رد فعل من أجل السماح لك لتحديد نسبة بركة النوكليوتيدات التي بدأت وهو مدرج في التحقيق RNA. هذا هو مقياس مهم للكفاءة التفاعل. كل من تتبع الخطوات التالية للتعامل مع الإجراءات P. ³²
      طريقة بديلة لقياس كمية الحمض النووي الريبي توليفها التحقيق هو استخدام الطيف ذات الحجم الصغير. هذا يتجنب استخدام الوسم P ³² (انظر الملاحظات في الخطوة 1.3.1)
   2. خلال بضع دقائق الأخيرة من الحضانة، وإعداد عمود الدوران السريع (روش) وفقا إرشادات الشركة المصنعة.
   3. بعد الحضانة، إضافة 1μl من الدناز I ريبونوكلياز الحرة واحتضان في C ° 37 لمدة 10 دقيقة.
   4. لتخفيف 100μl مع 50μl من العازلة التخفيف التفاعل (تريس 20MMpH7.5، 1٪ SDS، EDTA 20MM، كلوريد الصوديوم 100mM (ريبونوكلياز مجانا، وجعل الأسهم 50ML وتخزينها في درجة حرارة الغرفة)). اتخاذ 1μl (عادة في 4μl من TE 1X) لالتلألؤ العد والفرز لبدء العدد الكلي للتحليل وهلام.
   5. تطبيق بقية رد فعل على مركز العمود السرير وتدور في ز × 1100 لمدة 4 دقائق في جهاز للطرد المركزي السريرية الجدول الأعلى. بعد التحقيق تدور بك RNA هو في أنبوب جمع.
   6. إضافة 2 مجلدات من الايثانول 100٪ في رد فعل مزال. تخلط جيدا والحفاظ على الجليد ل5min (أو في -20 درجة مئوية أو 30 دقيقة).
   7. تدور في أنبوب ميكروسنتريفوج دورة في الدقيقة كحد أقصى لمدة 5 دقائق إلى RNA بيليه التحقيق في.
   8. إزالة طاف بواسطة ماصة، والسماح للهواء الجاف بيليه. لا تدع بيليه أكثر من الجافة لأنه سيكون من الصعب جدا حلها.
   9. حل التحقيق مع 50 ميكرولتر RNA - 100 ميكروليتر أو 1xTE DEPC-H ₂ O. أخذ عينة لتحديد 1 ميكرولتر التأسيس في المئة وللتحليل على ديناتخلال شهر هلام مادة الأكريلاميد. ضبط تركيزك التحقيق إلى 100 نانوغرام / ميكرولتر وفقا للعائد المقدرة.
   10. يمكن تحقيقات التي مرت على جميع ضوابط الجودة 3 ثم تخزينها في -20 درجة مئوية لمدة أشهر to12 6. ونحن عادة استنفاد المخزون التحقيق في غضون 12 شهرا. فمن المحتمل جدا التي يمكن تخزينها لفترات طويلة تحقيقات جدا في 20C-.
3. تقييم جودة riboprobe - قياس العائد التحقيق.
   1. لتقدير العائد التحقيق، تقسيم التهم تعافى بعد العمود تدور من التهم في رد الفعل قبل العمود زيادة ونقصان (قياس مع عينات أخذت في التحقيق بروتوكول التوليف). لهذا رد فعل، 100٪ = 33 إدراج ميكروغرام. رد فعل ناجح عادة يعطي عائدا 15-50٪. لا ينبغي إدراج تحقيقات مع أقل من 15٪ (<العائد ميكروغرام 5) يمكن استخدامها.
      ملاحظة: أسلوب بديل لقياس العائد التحقيق هو استخدام الطيف ذات الحجم الصغير أو مقياس التألقلقياس كمية مباشرة RNA بعد تقديم اللوني العمود زيادة ونقصان. هذا نهج بديل يتجنب استخدام العلامات التتبع من ³² P. لقد قمنا بقياس تركيز riboprobe باستخدام الطيف بيوتيك صفيحة ميكروسكوبية الحقبة. وأظهرت مقارنة بين القيم تم الحصول عليها من معمل لتقديرات الشامل riboprobe من إدماج P ³² التي الطريقتين تعطي نتائج مماثلة باستخدام وحدة تخزين صغيرة مماثلة (2 ميكرولتر) عينة من إعداد نتائج التحقيق النهائي.
      دائما ما يقرب من العائد المنخفض للغاية أو لا يرجع إلى تلوث ريبونوكلياز القادمة من إعداد البلازميد المستخدمة كقالب لPCR. تأكد من الحمض النووي الخاص علاج البلازميد والمنتجات PCR مع K بروتين كما هو موضح في الخطوة 1.1.3.
4. تقييم جودة riboprobe - قياس نشاط محدد.
   1. لقياس مدى digoxigenin - UTP إدراج إجراء اختبار البقعة. هذا هو CRUاالجتماعية اختبار مراقبة الجودة.
      ضبط تركيز التحقيق إلى 100 ​​نانوغرام / ميكرولتر. بقعة 1 ميكرولتر من التخفيفات التسلسلي (10 ^-2 إلى 10 ^-5) من التحقيق على 82mm قطرها من Hybond-N + (GE للرعاية الصحية) أو غيرها من النايلون تصفية ما يعادلها. وتشمل عينة DNA غير المسماة كعنصر تحكم سلبية. تشعبي تصفية رطبة فورا في crosslinker UV في 125mJoules أو وفقا لتعليمات الشركة المصنعة لتصفية النايلون الذي تستخدمه.
      يتم تنفيذها في طبق بتري على منصة هزاز في درجة حرارة الغرفة - كل من الخطوات التالية (1.4.6 1.4.2). لم يكن لديك ما يدعو للقلق بعد اكتشاف ريبونوكلياز والتخفيفات دقق في تصفية
   2. منع مرشح لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة في 10ML من 1٪ كاشف الحظر (روش) في TN 1X (10X العازلة TN = 1M تريس pH7.5، 1.5M كلوريد الصوديوم)
   3. غسل 1 X 15 دقيقة في المخزن المؤقت 10ML TN 1X.
   4. احتضان مع المضادة جزء فاب digoxigenin في 1/5000 في التخفيف 1X العازلة TN لمدة 30 دقيقة.
   5. يغسل 2 X 15 دقيقة في المخزن المؤقت 10ML TN 1X.
   6. يتم تنفيذ رد فعل اللون الأرجواني مع الركيزة BM (حاجة حوالي 5ml في الصحن). يجب أن يكون لون مرئية على الفور من التخفيف 10 ^-4 في 30 دقيقة. في تلك المرحلة، ووقف رد الفعل اللون عن طريق غسل 2 مرات لمدة 5 دقائق لكل منها TE 5X. إذا كانت إشارة غير مرئية في المكان الذي يتوافق مع التخفيف 10 ^-4 وينبغي بعد ذلك يتم تجاهل التحقيق.
      ملاحظة: في تجربتنا، تم العثور على نشاط محدد فقط غير كافية مع تحقيقات قصيرة. ينبغي زيادة حجم القالب التحقيق (إلى 1KB) مع الالتزام بمعايير التصميم الأخرى المحددة في هذا البروتوكول زيادة نشاط محدد من التحقيق. النشاط النوعي المنخفض يؤدي إلى انخفاض مستويات غير قابلة للكشف أو للإشارة.
5. اختبار سلامة التحقيق من قبل الكهربائي من خلال هلام 5٪ الأكريلاميد يبدل طبيعة.
   هذا هو آخر مهمة فحص ومراقبة الجودة.هذا البروتوكول يفترض أن تم وضع التحقيق مع ³² P خلال رد فعل التوليف (راجع الخطوة 1.2.1). نستخدم المواد الهلامية الأكريلاميد يبدل طبيعة لتوفير دقة عالية للغاية، مما يسمح لنا بسهولة للكشف عن تحقيقات المتدهورة أو غير كاملة. عادة 5٪ يبدل طبيعة مادة الأكريلاميد minigel اليوريا 7.5g (، 1.9ml الأكريلاميد بنسبة 40٪، 2٪ 1.9ml مكرر الأكريلاميد (أو استخدام مادة الأكريلاميد 20:01:، 1.5ml مكرر الأكريلاميد الحلول) هلام اجتماعات الأطراف 10X العازلة (0.2 M morpholinopropanesulfonic حمض، pH7.0، 50MM خلات الصوديوم EDTA 5MM) وH ₂ O إلى الحجم النهائي من 15 مل) يعمل بشكل جيد جدا لتسوية تحقيقات في حجم يتراوح المستخدمة في هذا البروتوكول.
   ملاحظة: كبديل لذلك، يمكن شراء TBE-اليوريا المواد الهلامية الجاهزة من مختلف الموردين. اتبع إرشادات الشركة المصنعة لتشغيل المواد الهلامية مسبقة الصنع.
   1. خلط العينة مع حجم مساو من الاحتياطي تحميل جل (Ambion) وتخلط جيدا.
   2. الحرارة إلى 95 درجة مئوية لمدة 5 دقائق لتفسد أي هيكل الثانوي.
   3. Immediately باردة على الجليد قبل تحميل على هلام لمنع إعادة الصلب.
   4. تشغيل قبل وبعد عينات معا في العمود 200V حتى الصبغة الزرقاء يمتد إلى نهاية الجل. يتم تشغيل هلام في هلام 1X العازلة اجتماعات الأطراف.
   5. التفاف جل في غلاف بلاستيكي وتعريضها لأشعة X-فيلم أو تصوير الشاشة الفوسفور للكشف عن الحمض النووي الريبي رديولبلد. إذا لم يتم استخدام ³² ف وضع العلامات يمكنك صمة عار الجل مع صبغة الفلورسنت التقليدية وللكشف عن الحمض النووي الريبي
   6. سوف تجميع التحقيق الناجح يؤدي إلى تحقيقات RNA أن يهاجر كما عصابة حادة قريبة جدا من الجزء العلوي من هلام.

2. جمع وتخزين أجنة الفئران

1. وينبغي جمع أجنة الفئران في الجليد الباردة PBST (PBS + 0.1٪ توين 20، (diethylpyrocarbonate (DEPC) تعامل)) ويحرص على الجليد خلال تشريح.
2. تتم معالجة الأجنة في 4 قوارير الزجاج المسمار مل توج. يمكن ان تكون ثابتة الأجنة متعددة في قنينة واحدة. ما يصل الى 10 حتي 15 E9.5يمكن أن تكون ثابتة أو 5 أجنة E10.5 في قارورة واحدة. نظرا لزيادة حجم الجنين، ينبغي hemisected الأجنة E11.5 مع شفرة حلاقة قبل التثبيت للمساعدة في الوصول التحقيق خلال التهجين. يمكن وضع ما يصل إلى 3 أجنة hemisected E11.5 في قارورة واحدة.
3. لتحقيق أقصى قدر من الفعالية من الخطوات في هذا البروتوكول والحد من الأضرار التي لحقت الأجنة، تثبيت الجنين ويتم تنفيذ جميع يغسل في قارورة العينة مع حلول ملء إلى انخفاض مستوى الرقبة قارورة بحيث لا فقاعة الهواء الصغيرة لا يزال، ما لم خلاف ذلك المحدد. لكافة الخطوات وضعت قنينة غسل أسفل الى جانبهم على منصة الروك.
4. إصلاح لمدة 6 ساعات ليلة وضحاها في 4 درجات مئوية على طاولة هزاز مع بارافورمالدهيد 4٪ (PFA) في PBST. ينبغي أن توضع أفقيا وهزت قوارير على منصة الروك في C. ° 4
5. بعد التثبيت، يتم غسلها مرتين الأجنة لمدة 5 دقائق في كل من PBST على الجليد ومتدرج من خلال المجففة ثم ميثاءNOL / PBST سلسلة (الميثانول 25٪ في PBST، والميثانول بنسبة 50٪ في PBST والميثانول 75٪ في PBST) في الميثانول بنسبة 100٪ عن طريق استبدال الحلول في قارورة زجاجية باستخدام ماصات باستور. ويمكن تخزين الأجنة المعرضين لل20C في الميثانول بنسبة 100٪ لمدة 8 أشهر وربما أطول.

3. المسمى التهجين من digoxigenin تحقيق لأجنة الفئران كله

1. قلوب ثقب ورؤساء وكبار السن E10.5 الأجنة بسكين تسليخ مجهري في حين أن الأجنة لا تزال في الميثانول (إذا لم يتم ذلك خلال تشريح). هذه الخطوة بسيطة يسمح للحلول غسل لدخول الحويصلات الدماغ وحجرات القلب مما يقلل إلى حد كبير تلطيخ الخلفية.
2. ترطيب الأجنة من يغسل المتعاقبة في سلسلة الميثانول / PBST (الميثانول 75٪ في PBST، والميثانول بنسبة 50٪ في PBST ثم الميثانول بنسبة 25٪ في PBST) لمدة 5-10 دقائق في كل تركيز الميثانول. يغسل مرتين لمدة 5 دقائق كل غسيل في PBST 100٪.
3. احتضان في 04:01 PBST: 30٪ H ₂ O ₂لمدة 1 ساعة على الجليد. ثم تغسل مع 3 تغييرات في كل 5 دقائق PBST 1X.
4. إزالة غسل PBST مشاركة واستبدالها مع 1ML 10 ميكروغرام / مل بروتين K في PBST. خلال عملية الهضم بروتين مكان K الأنابيب عموديا في رفوف في حمام مائي 25 ° C.
   ملاحظة: حلول للK بروتين يفقد النشاط مع مرور الوقت بسبب الهضم الذاتي. يجب لضمان النشاط القصوى ومتسقة أن يتم الحل K بروتين الطازجة مباشرة قبل كل استخدام. لكل استعمال جعل كمية صغيرة من الأسهم يضعف 1mg/ml بعد ذلك. وينبغي أن تحدد فترة حضانة لكل الكثير من مسحوق بروتين K ولكل عمر الجنين. على سبيل المثال، لأجنة E9.5 وقتا طيبا عادة 10-15 دقيقة عند 25 درجة مئوية في حين لE10.5 فإنه عادة ما يكون 20-30 دقيقة عند 25 ° C. وينبغي أيضا على حضانة K بروتين الوقت أن تقاس بدقة خلال التجارب للسماح للمقارنات صحيحة بين قوارير وبين التجارب. ينبغي الحفاظ على درجة حرارة بعناية خلال عملية الهضم لزيادةاستنساخ. الاختلافات صغيرة مثل 1 ° C يمكن أن يغير من كمية الهضم بين التجارب. فمن المستحسن أن يتم على الهضم K بروتين في حاضنة أو بالحمام المائي لمراقبة دقيقة لدرجات الحرارة. هذه الخطوة هو أمر حاسم لتحقيق والسماح للاختراق الأنسجة مما يولد إشارة قوية. ومع ذلك، فإن الإفراط في الهضم يضر الأجنة وأنها سوف تتفكك تدريجيا على مدى ما تبقى من خطوات.
5. وقف الهضم K بروتين عن طريق الغسيل مرتين لمدة 5 دقائق كل غسيل في درجة حرارة الغرفة مع 2 ملغ الطازجة / مل في جليكاين PBST. ثم يغسل مرتين لمدة 5 دقائق في كل من PBST.
6. إصلاح الأجنة هضمها لمدة 20 دقيقة في درجة حرارة الغرفة في PFA 4٪ / PBST، gluteraldehyde 0.2٪ (Polysciences). لا الزائد أو underfix. يغسل 3 مرات لمدة 5 دقائق في كل من PBST.
7. عند هذه النقطة، ينبغي تقسيم الأجنة إلى مجموعات للتهجين. إزالة PBST. إضافة 1 مل العازلة التهجين (ULT 50٪rapure الفورماميد (إينفيتروجن)، SSC 5X، ودرجة الحموضة 5، 1٪ SDS، 50 ميكروغرام / مل الهيبارين (أكروس)، 50 ميكروغرام / مل RNA المستخفية (سيجما)) التي تم تحسنت إلى 65 درجة مئوية (من دون التحقيق). السماح لتسوية الأجنة، قم بإزالة كافة المخزن المؤقت hybrization واستبدالها مع 1 مل العازلة التهجين الطازجة حرارة دون التحقيق.
8. Prehybridize لمدة 1 ساعة في C ° 65 في حمام مائي أو تهتز في فرن على منصة هزاز (على سبيل المثال فرن خبز واهتز Boekle 'ن'، انظر الجدول 1). إذا كنت احتضان قارورة في حمام مائي تأكد المياه تأتي ل، ولكن لم تنته، قمم من قوارير. ويمكن زيادة درجة حرارة تصل إلى 70 التهجين ° C. درجات الحرارة فوق 65 التهجين ° C لا تؤثر كثافة إشارة أو الخلفية مع معظم تحقيقات اختبرناها. الأجنة تصبح شفافة، لزجة، والهشة في مخازن الفورماميد (على سبيل المثال العازلة التهجين) توخي الحذر عند التعامل معها.
9. استبدال العازلة prehybridization مع 0.4ml العازلة التهجين التي تحتوي على التحقيق فيتركيز 0،25-1 ميكروغرام / مل. استخدام 0.5 ميكروغرام / مل من دقق في الأجنة تصل إلى حوالي E8.5. لكبار السن الأجنة، ينبغي معاير تحقيقات 1-0،1 ميكروغرام / مل لتحديد تركيز الأمثل للإشارة جيدة مع خلفية منخفضة (عادة 0،25-0،5 ميكروغرام / مل أو نحو ذلك). لاحظ أن أحجام أكبر التهجين قد تكون ضرورية لأكبر الأجنة. هجن بين عشية وضحاها في 65 درجة مئوية.
10. إذا تم علاج أكثر من الأجنة مع بروتين K. سوف تظهر شفافة للغاية. فإنها قد عصا أيضا إلى جوانب القارورة، أو ينهار. يجب التخلص من الأجنة التي تظهر بهذه الطريقة في هذه المرحلة من البروتوكول. معالجتها سوف يؤدي إلى مزيد من عدم تفسير البيانات.
11. استبدال العازلة التهجين مع الحل حرارة I (50٪، 5X الفورماميد SSC الرقم الهيدروجيني 5، 1٪ SDS) في 70 ° C. يغسل مرتين لمدة 30 دقيقة كل لغسل E8.5 الأجنة، ثلاث مرات لمدة 30 دقيقة لكل لغسل E9.5 وكبار السن.
12. يغسل مرة واحدة مع الحل قبل تحسنت 50٪ I: 50٪ الحل الثاني (0.5M كلوريد الصوديوم، حمض الهيدروكلوريك درجة الحموضة تريس 10MM 7.5، 0.1٪ توين 20) في 70 درجة مئوية لمدة 10 دقائق.
13. يغسل ثلاث مرات لمدة 5 دقائق لكل غسل II مع الحل في درجة حرارة الغرفة.
14. استبدال العازلة مع الحل II تحتوي على ريبونوكلياز A 100 ميكروغرام / مل، 100 وحدة ريبونوكلياز T1 / مل. على احتضان الروك في غرفة دافئة في 37C لمدة 30 دقيقة مرتين في غسل. وغسل ريبونوكلياز أمر ضروري للحد من خلفية نتجت عن تحقيقات المهجنة nonspecifically.
15. يغسل في الحل الثالث (50٪ الفورماميد، 2X SSC pH5) في 65 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة مرتين كل غسيل للE8.5 3 مرات، لمدة 30 دقيقة لكل لغسل E9.5 وكبار السن.
16. يغسل 3 مرات لمدة 5 دقائق لكل غسل TBST مع 1X (100 مل من TBS 10X يحتوي على كلوريد الصوديوم 8G، 0.2g بوكل، 12.5ml 2M تريس حمض الهيدروكلوريك درجة الحموضة 7.6 في المياه. لجعل 1X TBST تخفيف TBS 10X في حجم مناسب من الماء و إضافة توين تركيز النهائي 20 بنسبة 0.1٪)
17. ما لم يذكر، يتم تنفيذ جميع يغسل في قارورة العينة مع حلول ملء إلى انخفاض مستوىقارورة الرقبة. ليغسل كل الخطوات، وضعت قارورة أسفل الى جانبهم على منصة الروك.

4. كشف الأجسام المضادة المسمى من digoxygenin التحقيق

1. والأجنة مسبقا المحجوبة في 0.5 مل + 1X TBST الحرارة 10٪ مصل الأغنام المعالجة. صخرة قارورة ثم عموديا في درجة حرارة الغرفة (~ 20 ° C) للا يقل عن 2.5 ساعة.
2. استبدال الحل مع حظر TBST 1X الطازجة + 10٪ مصل يحتوي على 1:2000 - 1:5000 التخفيف من شظايا القلوية الفوسفاتيز الأغنام، مترافق المضادة للdigoxigenin فاب (طرح من قبل تفرخ مع مسحوق الأسيتون الجنين، انظر أدناه). استخدام أعلى التخفيفات لE9.5 وأقدم أجنة، وتصل إلى 1:5000 للحد من الخلفية. احتضان عموديا على الروك في 4 C ° بين عشية وضحاها.
   ملاحظة: لقد وجدنا أن الحضانة من شظايا فاب مكافحة digoxigenin مع الجنين مسحوق الأسيتون يقلل مستويات تلطيخ خلفية في هذا البروتوكول. لإعداد مسحوق الأسيتون الجنين التجانس المجمعة embr E12.5-14.5 الماوسيوس في حجم الحد الأدنى من PBS. إضافة 4 مجلدات من الجليد الباردة المزيج، الأسيتون واحتضان على الجليد لمدة 30 دقيقة. إزالة طاف من خلال الدوران في 10،000 XG لمدة 10 دقيقة. غسل بيليه مع الأسيتون الجليد الباردة وتدور مرة أخرى. نشر بيليه من وطحن الى مسحوق على ورقة من ورق الترشيح والسماح لها الهواء الجاف. ويمكن بعد ذلك مسحوق يمكن تخزينها في أنبوب محكمة الغلق في C ° 4 سنوات.
   الأجسام المضادة للالطرح، ينبغي أن الأجسام المضادة لاستيعاب مسبقا الجنين مسحوق الأسيتون ملزمة للحد من غير محدد أثناء أو قبل منع مسبقة. احتضان الضد في 100/1 مع كمية صغيرة من مسحوق الجنين (كمية ليست حرجة) في المصل 1xTBST/10٪ على الأقل 1HR في 4 درجات مئوية مع هزاز. إزالة مسحوق من خلال الدوران في ميكروسنتريفوج لمدة 10 دقيقة في C. ° 4 ويمكن تخزين الأجسام المضادة في طرح C ° 4 ل6 أشهر على الأقل.
3. يغسل ثلاث مرات مع كل 5 دقائق TBST 1X، ثم 5-6 مرات كل ل1HR في درجة حرارة الغرفة لإزالة الأجسام المضادة الزائدة. إذا عيشار، إلى القيام الغسيل الممتدة بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية للحد من الخلفية. يمكن غسل الحد بشكل كبير بين عشية وضحاها المستويات الأساسية وبالتالي زيادة إشارة إلى نسبة الضوضاء.
4. يغسل مرتين لمدة 20 دقيقة لكل يغسل مع الطازجة العازلة الفوسفاتيز القلوية (تريس 100mM، ودرجة الحموضة 9.5، 50MM MgCl _2، كلوريد الصوديوم 100mM، 0.1٪ توين 20. إضافة الليفاميزول 0.5mg/ml، المانع AP المحلية، وكبار السن لE9.5 الأجنة).
5. استبدال غسيل الماضي مع BM الركيزة AP بنفسجي (روش) prewarmed إلى درجة حرارة الغرفة.
6. السماح للرد فعل لاحتضان اللون في درجة حرارة الغرفة، ومشاهدة للإشارة بشكل دوري عن طريق المجهر تشريح. وينبغي لردود الفعل لون الموسعة (عدة ساعات ليلة وضحاها) وتكون محمية من الضوء قارورة. وينبغي الإشارة إلى وفرة mRNAs وتكون مرئية في غضون 15 دقيقة. يجب أن تتوقف ردود الفعل عندما كنت راضيا إشارة، أو عندما يبدأ خلفية مشكلة. إذا كان الحل نفسه يبدأ لتحويل الظلام يمكنك توسيع جرد فعل olor بالاستعاضة عن حل الركيزة.
7. وقف رد الفعل عن طريق الغسيل مرتين لمدة 5 دقائق لكل غسل 1X في PBST/5mM EDTA.
8. نقل إلى 4٪ بارافورمالدهيد / PBST لإعادة إصلاح، من عدة ساعات ليلة وضحاها. أو يمكن تخزين الأجنة في PBST paraformaldehyde/1X 4٪ لسنوات أو يمكن معالجتها على الفور الحصول على تقطيع. هذه الخطوة تثبيت النهائي هو أمر حاسم للحفاظ على المدى الطويل من نمط تلطيخ.

5. البارافين وتقطيع دمج الأجنة الملون

1. قبل أن يتم إصلاح الأجنة بعد اتخاذ رد فعل اللون (الخطوة 4.8) صور للأجنة جبل كله الملون عند مستوى تلطيخ هو في شدة المطلوب. بعد توثيق أنماط التعبير في الأجنة كله يتم تحضين أنها الركيزة في الأرجواني BM بين عشية وضحاها إلى 24 ساعة في درجة حرارة الغرفة حتى يصبح الجنين كله أزرق غامق. هذه الخطوة هو التأكد من أن تلطيخ سوف تكون مظلمة بشكل كاف لتظهر في اله أقسام الأنسجة. يرجى ملاحظة أن اللون الأزرق من الجنين ويرجع ذلك إلى ترسب طبقة رقيقة جدا من الصباغ في جميع أنحاء سطح الجنين. وهذا تلطيخ الخلفية لا يمكن كشفها داخل أنسجة الفائدة بعد تقطيع.
2. غسل الأجنة ملطخة PBS ثلاث مرات لإزالة رواسب الركيزة الزائدة وإصلاح بين عشية وضحاها في PFA 4٪ في 4 درجات مئوية.
3. يغسل ثلاث مرات مع برنامج تلفزيوني، ثم يذوى الأجنة في الميثانول بنسبة 100٪ (كما هو موضح في 2.4).
4. استبدال الميثانول مشاركة مع الزيلين. يغسل في 2 حتي 3 مرات الزيلين لمدة 2 دقيقة لكل يغسل حتى الأجنة تصبح واضحة. لا أكثر من غسل في الزيلين لأنه سيجعل الأنسجة هشة جدا بعد ذلك جزءا لا يتجزأ من مما يجعل من الصعب جدا لاسترداد أقسام سليمة. رصد بصريا كل حضانة الزيلين لجعل متأكد من الأجنة فقط لكونها وجهة واضحة ونكون حذرين للغاية لعدم السماح للحضانة الزيلين لتتجاوز هذه النقطة.
5. نقل الأجنة (E10.5 وكبار السن) إلى أشرطة متأكد تيك خزعة (Fisherbrand)، واحتضان الكاسيت كله في الشمع (Fisherbrand) لمدة 15 ~ 30 دقيقة عند 65 ° C. تغيير في الشمع الطازجة لمدة 15 ~ 30min ثم قم بتغيير مرة أخرى. أصغر الأجنة / جذوع الأنسجة تتطلب أقصر فترة حضانة الشمع. يمكن وضع الأجنة في قوالب E9.5 تضمين الأنسجة لجميع التغييرات الشمع. في هذه الحالات يمكنك إزالة الشمع من القالب بدلا من نقل الأجنة.
6. بعد التغييرات الشمع الثلاثة، نقل الأجنة في قوالب تضمين الأنسجة (Polysciences) وتضمين مع الشمع الطازجة. وضع بعناية لأجنة الطائرة المطلوب من تقطيع. السماح لتبرد الشمع حتى توطد.
7. القسم الكتل الشمع إلى 8 شرائح 14μm ~ باستخدام مشراح القياسية (مثل لايكا RM2155). جمع المقاطع على الشرائح المجهر (Fisherbrand).
8. اسمحوا الشرائح وضع مسطح والجافة على slidewarmer. ويمكن تخزين الشرائح في C ° 4 أشهر.
9. وdewaxed أقسام المجففة من قبل اثنين من xylen 5 دقائقيغسل وه. ميهت في الماء يغسل من الميثانول / الماء المسلسل (100٪ الميثانول 2 دقيقة، 100٪ الميثانول حد أدنى 2، 90٪ 2min الميثانول / الماء، و 70٪ 2min الميثانول / الماء، الماء منزوع الأيونات دقيقة 5)
10. وصمة عار مع المقاطع النووية حل سريع الأحمر تلطيخ (سيغما) لمدة 1 دقيقة. النووية لتوليد بسرعة حل تلطيخ الأحمر، تمييع الأسهم مركزة من الأحمر سريع النووية (0.1٪ الحمراء بسرعة النووية في كبريتات الألومنيوم 5٪ في الماء، ويذوب مع الحرارة وفلتر من خلال ورق الترشيح WHATMAN) 01:05 في محلول مائي من 5 كبريتات الألومنيوم٪. بعد تلطيخ تغسل الشرائح مع المياه الجارية حتى يصبح الماء واضحة. النووي الأعمال الحمراء أسرع وقت وملون مباين ويكشف هيكل الأنسجة الشاملة في الفروع. لونه يتناقض تماما مع الأرجواني والأزرق تلطيخ الذي يصادف توطين التحقيق RNA. الأحمر سريع النووية هو وصمة عار وتشبع يتم التحكم في شدة تلوين من تركيز محلول التلوين. إذا كانت شدة تلطيخ النووية الأحمر سريعغير كافية عند استخدام هذا الحل تلطيخ يمكنك تكرار هذه الخطوة مع حل سريع النووية أكثر تركيزا الحمراء.
11. إعداد الشرائح لتركيب coverslips من يغسل في كل من الحلول في السلسلة التالية: 90٪ الميثانول / الماء ثم يغسل بنسبة 2 في الميثانول بنسبة 100٪ تليها بنسبة 2 في الزيلين يغسل. احتضان الشريحة لمدة 2 دقيقة في كل من يغسل.
12. تحميل الشرائح المتوسطة مع Cytoseal تركيب 60 (ريتشارد ألان-العلمية). يرجى ملاحظة أن الأوساط المائية المتزايدة سيحل الأحمر النووية بسرعة وصمة عار.
    ملاحظة: لقد استخدمت أيضا راتنج البلاستيك التضمين (المناعي سريرا، Polysciences المؤتمر الوطني العراقي) لتوليد أجنة أقسام الملون مع نتائج ممتازة ^4.

6. ممثل النتائج:

الشكل 1 يوضح النتائج التي تم الحصول عليها باستخدام ممثل هذا البروتوكول. الرقم 1A يظهر نمط التعبير عن Gata3 في أجنة الفئران E10.5. هذه اللوحة يوضح ص جيدةesult مع إشارة إلى نسبة عالية الخلفية. الرقم 1C، في المقابل، يظهر فشل في الموقع التهجين لGata3 مرنا التي كانت تحقيقا RNA المتدهورة جزئيا. A منخفضة التحقيق نشاط معين سوف يؤدي إلى نتائج مماثلة مع إشارة النقيض من الأقل إلى الخلفية. مقارنة بين لوحات A و C يوضح أهمية على أداء دقيق لمراقبة الجودة المقررة للجودة لضمان تحقيق نتائج عالية الجودة. النتيجة التي تم الحصول عليها مع التحقيق Foxg1 (1B الشكل) يوضح أيضا نتيجة جيدة مع تلطيخ محددة في الدماغ الانتهائي مع خلفية منخفضة في أجزاء أخرى من الدماغ. الدماغ والقلب هي الأماكن الأكثر شيوعا لتلطيخ الناجمة عن الاحتباس خلفية التحقيق. ثقب الدماغ والقلب مع ملقط يسمح غسل الحلول في الجنين ويقلل من تلطيخ الخلفية (راجع الخطوة 3.1). يوضح الشكل 1D النموذجية ضوء خلفية زرقاء عندما لا يتم العثور على ثقب الدماغ. وهذا يدل لذلك دون المستوى الأمثل الحصول عليها باستخدام مسبار Pax1. لا يتم التعبير عن Pax1 في أي جزء من الدماغ وجميع من تلطيخ ينظر في دماغ الجنين هذا ومن المقرر أن الخلفية غير محددة.

النتائج الممثل الشكل 1. تظهر أمثلة ناجحة من (A، B) ودون المستوى الأمثل (C، D) النتائج. A. E10.5 الأجنة المهجنة مع Gata3 التحقيق. B. E11.5 الأجنة المهجنة مع Foxg1 التحقيق. C. E10. 5 الجنين تهجين مع Gata3 التحقيق أن يتحلل جزئيا، والتي تبين إشارة ضعيفة جدا ولكن الخلفية عالية من خلال الخروج من الجنين كله. D. E10.5 الأجنة المهجنة مع Pax1 التحقيق دون ثقب الرأس، تظهر تلطيخ خلفية في البطينين (رؤساء السهم).

Discussion

وقد تم تكييف الأساليب المبينة في هذا البروتوكول من عدد من المصادر المختلفة والأمثل لجبل كله E8.5-E11.5 الأجنة اليوم الماوس القديمة. طرق جبل بأكمله في الموقع التهجين الأجنة الفقارية وأول ما ظهرت في 1990s في وقت مبكر ^2،5-12. وقد تم تكييف هذا البروتوكول أساسا من الطرق ?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
اسم	نوع	شركة	كتالوج رقم	تعليقات
Digoxigenin-11-يوريدين-5'-ثلاثي الفوسفات	كاشف	روش	11209256910
ريبونوكليوزيد ثلاثي الفوسفات مجموعة	كاشف	روش	11277057001
أعمدة الدوران السريع لتنقية RNA رديولبلد	تزويد	روش	11274015001
T7 بوليميريز RNA	كاشف	روش	10881767001
SP6 الحمض النووي الريبي بوليميراز	كاشف	روش	10810274001
T3 RNA بوليميراز	كاشف	روش	11031163001
CTP، [α-32P] - 800Ci/mmol 10mCi/ml، 250 μCi	كاشف	بيركن إلمر	BLU008X250UC
الدناز I المؤتلف، ريبونوكلياز خالية	كاشف	روش	4716728001
اليوريا، عديم اللون إلى الأبيض بلورات أو مسحوق بلوري	كاشف	الصياد	BP169-500
هلام العازلة تحميل	كاشف	Ambion	AM8547
Hybond-N +، أميرشام	تزويد	GE للرعاية الصحية	RPN82B
UV Stratalinker 2400	معدات	Stratagene
اثيل pyrocarbonate	كاشف	سيجما	D5758-100ML
الهيبارين الصوديوم	أكروس	41121-0010
بيروكسيد الهيدروجين في الماء 30٪	كاشف	فيشر العلمية	BP2633-500
Gluteraldehyde، 8٪ EM الصف	كاشف	Polysciences	0/710	استخدام بحذر وفقا لتعليمات تصنيع لل
منع كاشف	كاشف	روش	11096176001	جعل الأسهم في 5٪ وتخزينها في -20 درجة مئوية
بروتين K	كاشف	روش	3115852001
ريبونوكلياز A	كاشف	روش	10109142001	جعل إلى 10 مغ / مل الأسهم وتخزينها في -20 درجة C.
ريبونوكلياز T1	كاشف	روش	10109193001
ULtrapure الفورماميد	كاشف	إينفيتروجن	15515-026
الليفاميزول هيدروكلوريد	كاشف	ICN Biomedicals. المؤتمر الوطني العراقي	155228
حمض النووي الريبي من الخميرة المستخفية، نوع VI	كاشف	سيجما	R6625	الفينول / كلوروفورم استخراج عدة مرات وعجلت، معلق في DEPC-dH2O وتخزينها في -20 ° C
مكافحة Digoxigenin-AP شظايا فاب	كاشف	روش	11093274910
BM الركيزة AP الأرجواني، مما عجل. الجاهزة للاستخدام الحل.	كاشف	روش	11 442 074 001
، واضح 4mL، مغلق الأعلى فيال التخزين، راحة كيت	تزويد	العلمية الوطنية	B7800-2
يهز N فرن خبز التهجين	معدات	Boekel العلمية	136400
خزعة متأكد تك	تزويد	Fisherbrand	15-200-402C
Paraplast تضمين النسيج زائد المتوسطة	كاشف	Fisherbrand	23-021-400
قشر-A-طريقة التخلص منها تضمين قوالب البلاستيك النسيج	تزويد	Polysciences	18646A
Colorfrost الشرائح بالاضافة الى مجهر	تزويد	Fisherbrand	12-550-17
الأحمر سريع النووية	كاشف	سيجما	N8002
Cytoseal 60	كاشف	ريتشارد ألان-العلمية	8310-16